全 文 ：植物学通报 2004, 21 (5): 625~630
Chinese Bulletin of Botany
①通讯作者。Author for correspondence. E-mail: xiagm@sdu.edu.cn
收稿日期：2003-08-11 接受日期：2004-02-02 责任编辑：白羽红
小麦的小孢子培养
秦余香 夏光敏
①
(山东大学生命科学学院 济南 250100)
摘要 小孢子培养是在花药培养的基础上发展起来的一种高效再生体系, 其在植物育种中的作用一直
受到关注。但是, 由于培养技术的限制, 小麦(Triticum aestivum)小孢子培养还未能推广应用。近年来小
麦小孢子培养发展很快, 展现出广阔的应用前景。
关键词 小麦, 小孢子培养
In Vitro Culture of Wheat Microspores
QIN Yu-Xiang XIA Guang-Min①
(School of Life Science, Shandong University, Jinan 250100)
Abstract Microspore culture is a plant regeneration system with a high frequency, which was
developed from anther culture. It is noticed that microspore culture has an important role in plant
breeding. But, microspore culture has not been utilized widely because the technical limitation in
wheat. In recent years, microspore culture of wheat (Triticum aestivum L.) has been improved
significantly with a potential for application.
Key words Wheat (Triticum aestivum L.), Microspore culture
小孢子培养是在花药培养的基础上发展起来的技术, 但小孢子培养又区别于花药培养, 前者
属于单细胞培养, 而后者属于器官培养的范畴。它是指在体外条件下, 由雄配子体直接发育成完
整植株的过程。从分离的小孢子获得再生植株具有极大的应用潜力。因为它是单细胞且能再
生纯合植株, 因此它是作物改良和植物系统发育研究的理想材料。用于作物改良可减少繁琐的
近交过程；用于系统发育研究, 可使研究对象简化, 易于操作。同时它也是基因操作的好材料。
通过对转基因植物的小孢子进行培养, 就可能快速得到纯合体(Jähne and Lörz, 1995)。近年来, 小
孢子培养取得了很大进步, 在大麦(Hordeum vulgare L.) (Ritala et al., 2001; Li and Devaux, 2003)、
小麦(Triticum aestivum L.) (Touraev et al., 1996; Zheng et al., 2001; 2002; Liu et al., 2002a)和水稻
(Oryza sativa)(Raina and Irfan , 1998)等作物上都建立了高效再生系统。下面将对小麦小孢子培
养的研究进展作一综述。
1 供体
1.1 环境条件对供体的影响
供体植株的性状对小孢子培养的成功具有决定性的影响。因生长条件不同, 同一个品种能
专 题 介 绍
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分裂和再生的小孢子的数量会有很大变化(Heberle-Bors, 1989)。影响供体植株活力的因素包括
光周期、光强度、光质、温度、营养以及病虫害等。为了建立一个能再生的培养体系, 供
体植株需要生长在适宜的可控制的条件下(Touraev et al., 1996; Zheng et al., 2001; 2002; Liu et al.,
2002a)。
1.2 基因型对供体的影响
在小麦小孢子培养中, 基因型是一个重要的影响因素。从目前研究的现状看, 小孢子培养还
受基因型的限制, 表现为不同基因型的小孢子诱导产生小孢子胚的频率和难易程度不同。有些
基因型的小麦小孢子容易产生胚状体, 而有些则不能或者需要在培养基中添加子房等物质才能培
养成功(Touraev et al., 1996; Zheng et al., 2001; 2002; Liu et al., 2002a; 2002b)。人们对控制花药培
养的遗传因素也进行了研究。在小麦花药培养研究的基础上, Picahe等和Agache等提出花药培
养能力与某些显性基因有关, 认为促进花粉愈伤组织形成的基因位于小麦的1D和5B染色体上(朱
至清, 1998)。Zhang和 Li (1984)发现控制花药培养的基因主要位于 2A和 2B染色体上, 而 2B、
4A、5A和 5B染色体上则含有少量抑制胚发生的基因。Torp等(2001)指出小麦花药培养中与
绿色植株相关的基因位于 2AL、2BL和 5BL上。但具体是那些基因控制着小孢子在培养中的
反应, 目前还不清楚。
1.3 小孢子的发育时期
选择适当发育时期的小孢子是小孢子培养成功的关键。人们大多使用单核中期和晚期的小
麦小孢子进行培养, 这时幼穗的形态可通过在显微镜下观察小孢子的形态确定(Zheng and
Konzak， 1999)。可是, 朱宏和张忠恒(2002)报道用双核早期的小孢子培养也获得了花粉植株, 这
可能与植物材料和培养方法有关。
2 预处理的促进作用
为使小孢子的遗传方向从配子体向孢子体转变, 人们使用了多种处理方法(Touraev et al.,
1997)。在小麦花药培养中经常应用低温预处理诱导雄核发生(朱宏和张忠恒, 2002)。黄斌(1985)
曾提出低温预处理对花药培养的可能作用机制。他认为低温可能通过3个方面的作用来促进小
孢子雄核发育启动，一是使花药内源激素发生变化, 由此影响小孢子, 改变其配子体发育途径;
二是导致小孢子的孤立化, 对小孢子胚胎发生的诱导起促进作用；三是低温有利于绝大多数的
小孢子保持生活力, 防止退化。Mejza等(1993)认为低温处理幼穗对小孢子培养可能有双重作用
—— 阻断小孢子有丝分裂以产生胚状体及为花药抚育小孢子提供了充足的时间。但也有相反的
报道, Liu等(2002b)报道 4℃低温预处理可使花粉胚的获得率降低。Touraev等(1996)和Liu等
(2002a)报道, 在小麦小孢子培养中, 用33℃高温预处理后, 再于25℃培养, 可获得很高的花粉胚获
得率。Wei等(1986)指出, 甘露醇预培养对小麦游离小孢子培养有促进作用。李文泽等(1995)推
论碳饥饿是启动雄核发育的重要因素。Zheng 等 (2001)在小麦小孢子培养中发现2-羟烟酸等化
合物可诱发小孢子发生并能保持小孢子的活性。Liu等 (2002b)指出, 在预处理阶段给小孢子提
供适当的营养将决定产生的胚的质量。高温、饥饿、适当的营养以及合适的渗透压再与一些
化合物共同运用, 代表了目前小麦小孢子培养中预处理的方向。
3 小孢子的分离与纯化
在小麦小孢子培养中, 花粉的分离方法有自然法、研杵-离析技术和微型搅切法3种。(1)自
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然法(自动散落法)是将花药培养在液体培养基中, 花粉自动散落。2~3 d后, 分离小孢子进行培
养。该法分离的小孢子受到的损伤小, 容易培养成功 (王子霞等, 1996) 。但它收集的小孢子数
量少, 因此效率较低。后来人们对该法进行了改进, 首先置花药于液体培养基中培养, 然后将花
药与液体培养基一起用磁力搅拌棒搅拌, 以收集未散落的小孢子(Hu and Kasha, 1997); (2)研杵-
离析技术是用一个玻璃或金属棍挤压花药, 然后过筛, 其中有部分小孢子受到了损伤(朱宏和张忠
恒, 2002); (3)微型搅切法是在微型搅切器的玻璃管中装有微马达带动的旋转刀片, 可以迅速将花
药打碎, 经过滤和离心, 能收集到大量游离的小孢子。现在该方法已被广泛用于大麦(Li and
Devaux, 2003) 和小麦(Zheng et al., 2001) 等植物的小孢子分离。
分离过程中死亡的小孢子或花药壁碎片可释放酚类化合物, 在以后的培养中对小孢子造成毒
害。为得到理想的实验结果, 需要对小孢子进行纯化。用不同方法分离到的小孢子通过一定孔
径的金属网过滤, 可以进行纯化。但是使用该方法, 往往纯化程度不够理想。常含有一些大小
合适 但却是死亡的或发育不好的小孢子。经预处理之后, 可以根据小孢子的生理状况不同而造
成的密度差异, 使用密度梯度离心进行纯化。Percoll梯度离心, 可获得很好的效果(Touraev et al.,
1996; Indrianto et al., 2001) 。但是Percoll 试剂较昂贵, 近年来人们将小孢子悬在0.3 mol.L-1的甘
露醇中, 使用21％的麦芽糖梯度离心, 取得了与Percoll 试剂同样的分离效果(Zheng et al., 2001;
2002)。
4 小孢子培养条件
4.1 培养基
在小麦小孢子培养中, 一般使用过滤消毒的液体培养基, 不同的液体培养基其成分各异。一
般是在基本培养基MS 和N6 的基础上进行不同的改进。
4.1.1 N 源 N 源在培养基中的重要作用是在大麦的小孢子培养中被发现的。在大麦的小孢子
培养中, N源在雄核发育中很重要, 降低培养基中铵态氮的浓度, 用谷氨酰胺作为无毒氮源提高了
绿苗的产量(Olsen, 1987)。研究表明, 分裂的启动以及进一步的发育和植株再生可能都是通过氮
源控制的(Mordhorst and Plörz , 1993)。但Ritala等(2001)报道在培养基中去掉谷氨酰胺不影响
绿苗的产生, 但可使白苗的数量减少。
4.1.2 糖 在大麦花药研究中发现麦芽糖比蔗糖有效(Hunter, 1988)。在小麦小孢子培养中, 传
统的蔗糖也已被麦芽糖所代替。蔗糖对小孢子具有毒害作用, 其毒害作用的部分原因可能是由
于在培养过程中培养基的渗透压因蔗糖的水解而升高。这种渗透压变化比含有等量麦芽糖培养
基的渗透压变化大。蔗糖对雄核发生的抑制作用在花药培养中也有发现(Zhou et al., 1991)。麦
芽糖对小孢子培养的正向作用还可能是由于在小孢子培养的初期阶段, 麦芽糖的缓慢水解而造成
果糖供应不足, 使小孢子处于饥饿状态(Zheng, 2003), 有利于小孢子的脱分化和进一步的发育。
4.1.3 渗透压 培养基的渗透压在小孢子培养中也是一个很重要的参数。Liu等(2002a)在小麦
小孢子培养中, 摩尔渗透压浓度低于300 mOs mole.kg-1 H2O时, 随渗透压的增大, 花粉胚的数量
和体积增加, 超过该值时, 反之。一般使用的摩尔渗透压浓度为300~320 mOs mole.kg-1 H2O, 相
当于0.3 mol.L-1的甘露醇或0.25 mol.L-1 的麦芽糖的渗透压(Zheng, 2003)。
4.1.4 激素 在小麦小孢子培养中, 外源激素的存在是小孢子脱分化并进入雄核发育的必要条件
(李波等, 1997)。但是激素的浓度一般比较低。诱导培养中激素的浓度过高, 会使小孢子趋向于
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形成愈伤组织, 不易形成胚状体(Zheng et al., 2001)。PAA对小麦小孢子培养具有促进作用 (Hu
and Kasha, 1997)。一定浓度的 2, 4-D和KT的存在是诱导小孢子细胞分裂的必要条件；从两
种激素的作用效果上看, 2, 4-D起主要作用 (李波等, 1997)。Zheng 等(2001)将2, 4-D、KT和PAA
共同使用, 取得了很好的效果。但是激素的组成和浓度没有一成不变的规律, 需要在实验中摸
索 。
4.1.5 条件培养 为了提高胚发生和植株再生频率, 人们利用了条件培养基(将一定数量的新鲜
子房与液体培养基一起在适宜温度下温育一定时间的培养基)和子房看护培养的方法。Zheng等
(2002)报道每毫升培养基加10个子房, 于27℃温育7~10 d, 然后每毫升条件培养基用3 mL液体培
养基稀释, 和子房一起用于小麦小孢子培养获得了理想的实验结果。利用条件培养基能克服植
物基因型的小孢子培养在正常条件下小孢子培养不能成功的缺点(Li and Devaux, 2001; Zheng et
al., 2002)。
4.2 小孢子培养的密度、温度及光照
一般在26~28℃且黑暗条件下诱导小麦花粉胚状体发生(Zheng et al., 2001; 2002; Liu et al.,
2002a)。在小孢子培养中需要有一个合适的培养密度。有效密度范围为(5×103~2×104).
mL-1。过高的密度对小麦小孢子培养是没有必要的, 足够高但又相对较低的密度有利于细胞分
裂和胚状体发生对氮源、营养和空间的竞争(Zheng, 2003)。
5 小孢子的发育及植株再生
Indrianto等(2001)对体外小麦小孢子培养进行了追踪, 提出预处理之后的小孢子可根据其细
胞学特征分为3种类型: (1)大液泡位于小孢子中央, 细胞核由一薄层细胞质包围紧靠小孢子壁; (2)
细胞质丝分割大液泡并与位于小孢子壁附近的细胞质囊相连, 细胞质囊内包有细胞核; (3)第三种
类型的小孢子的细胞质囊移至小孢子的中央。 这3种类型小孢子是发育过程中由第一种类型发
育到第三种类型的3个连续的发育阶段, 而不是区分小孢子有无应答的依据。他们指出, 胚状体
发生时小孢子的第一次分裂是对称分裂。最初小孢子壁的破裂总是在小孢子发育成多细胞结构
的小孢子中含淀粉粒的细胞的对面。含淀粉粒的细胞位于萌发孔附近。这些结论为小孢子的
胚状体发生提供了细胞学证据, 为研究小麦小孢子培养的机理奠定了基础。
广泛用于小麦小孢子植株再生的培养基为 190-2培养基 (Zhuang and Xu, 1983)。当胚状
体生长至直径1~2 mm大小时, 将其转至再生培养基上。根据小苗生长状况, 约2周之后即可
将其转至土壤中生长。为提高胚状体发生频率, 可在第一批胚状体转出之后, 更新诱导培养基
及其中的子房。
6 白化现象
在小麦小孢子培养得到的植株中, 白化苗普遍存在。供体的基因型和生理状态, 小孢子的发
育时期, 培养温度以及低温预处理等多种因素对白化都有不同程度的影响。研究表明, 白化苗含
有质体基因组的大量缺失, 而且核基因也影响白化现象(Jähne and Lörz, 1995)。但白化的首要原
因还不清楚。
7 小孢子再生植株的倍性
小孢子起源的再生植株的倍性在不同作物中有所不同。小孢子具有体外培养时自动加倍的
6292004 秦余香等：小麦的小孢子培养
特点, 但原因不清, 加倍的程度也有所不同。在小麦的小孢子培养中, 报道的数字因基因型不同
而不同, 有20%~78%的再生绿色植株是加倍的(Zheng et al., 2001; 2002; Liu et al., 2002a; 2002b)。
促使染色体加倍最常用的药物是秋水仙素(Hansen and Andersen , 1998)。与秋水仙素相比, 一
些抗微管的除草剂, 例如氟乐灵比秋水仙素与植物微管蛋白结合的特异性强, 在低浓度下就能产
生与秋水仙素相似的作用, 可作为传统秋水仙素的一个替代品 (Jähne and Lörz, 1995)。N2O也可
代替秋水仙素, 将来自花药的小麦幼苗在N2O的气体环境中温育, 得到了与秋水仙素一样的效果,
但没有毒副作用(Jähne and Lörz, 1995)。寻求一种简便快速鉴定小孢子再生植株倍性的方法, 在
单倍体育种中具有十分重要的意义。鉴定花粉植株倍性的方法, 通常采用压片法观察染色体。
但是这种方法程序繁琐且工作量大。用气孔保卫细胞长度鉴定花粉植株倍性的方法简便快速，
实验结果稳定可靠。实验表明, 气孔保卫细胞长度受染色体倍性控制；单倍体与二倍体之间气
孔保卫细胞长度差异非常显著, 单倍体气孔保卫细胞长度一般在60 μm以下, 二倍体气孔保卫细
胞长度一般在70 μm以上。由于气孔保卫细胞长度受测试叶片取样部位的影响, 所以从同一部
位取样为宜。这样可以减少取样误差, 提高准确性(胡道芬, 1991)。另外, 利用流式细胞仪也是
一种快速检测染色体倍性的方法。
小孢子培养开辟了生物学研究领域的新天地, 可以预测, 随着培养技术的不断改进, 小孢子培
养必将在作物育种中起重要作用。
参 考 文 献
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