全 文 ：植物学通报 2005, 22 (5): 590~593
Chinese Bulletin of Botany
①国家烟草专卖局科技项目(110200101005)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: cuihong@371.net
收稿日期: 2004-05-10 接受日期: 2004-10-08 责任编辑: 崔郁英, 于昕
组织培养简讯
悬浮培养中不同理化因子对烟草发状根
生长及烟碱合成的影响①
1慕平丽 1崔 红 1刘海礁 2赵百东②
1(河南农业大学, 国家烟草栽培生理生化研究基地 郑州 450002)
2(国家烟草专卖局 北京 100053)
摘要 悬浮培养中烟草(Nicotiana tabacum)发状根的生长及烟碱合成受到基本培养基浓度、初始pH
值、激素种类和浓度等因素的影响。一个5 cm长的根尖, 悬浮在40 mL、pH值为6.0、附加1.0 mg.L－1
IAA的1/2 MS液体培养基中, 28 ℃、散光条件下培养30天, 烟碱产量可达0.241 mg.mL－1。
关键词 烟草, 发状根, 烟碱, 悬浮培养
Effects of Various Factors on the Growth and Nicotine
Production of Hairy Roots of Nicotiana tabacum
in Suspension Culture
1MU Ping-Li 1CUI Hong 1LIU Hai-Jiao 2ZHAO Bai-Dong②
1(Henan Agricultural University, National Tobacco Cultivate Physiology and Biochemistry Research
Center, Zhengzhou 450002)
2 (State Tobacco Monopoly Administration , Beijing 100053)
Abstract The growth and nicotine biosynthesis of hairy roots of Nicotiana tabacum in
suspension culture are influenced by various factors such as basal medium, hormone content
and the pH value. The maximal production of nicotine at 0.241 mg.mL－1 was obtained when one
tip of hairy root was cultured in 40 mL liquid 1/2 Murashige Skoog medium supplemented with
1.0 mg.L－1 indolacetic acid at 26-28 ℃ under natural scattered light. This result suggests the
potential application of a hairy root suspension culture system for the production of the second
metabolic substance of Nicotiana tabacum.
Key words Nicotiana tabacum, Hairy root, Nicotine, Suspension culture
自Chilton等(1982)首次报道了发根农杆
菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导植物产生
发状根以来, 发状根因其具有生长速度快、
分化程度高、次生代谢物质种类多及含量高
的特点, 成为次生代谢物质代谢机理研究和大
规模生产利用的理想体系(陈士云和侯嵩生,
5912005 慕平丽等: 悬浮培养中不同理化因子对烟草发状根生长及烟碱合成的影响
1993)。烟草次生代谢物质丰富, 具有很高的
开发和利用价值。但作为模式植物, 有关烟
草发状根的研究多集中在分子转化机理等方
面(Bharati, 2000), 而将发状根作为离体培养系
统进行次生物质合成调控的研究还鲜有报
道。作者在建立烟草发状根的诱导体系的基
础上(崔红等, 2003), 在悬浮条件下对影响烟草
发状根生长及烟碱合成的诸多理化因子进行
了研究, 旨在优化烟草发状根液体培养体系, 为
烟草发状根的大量培养和研究次生代谢调控
奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
烟草(Nicotiana tabacum)发状根无性系,
由发根农杆菌株Ar1334感染香料烟Sumxun无
菌苗叶片诱导, 在MS培养基上筛选而来。
1.2 悬浮培养及发状根生长量测定
取固体培养基上继代10天的发根无性系,
截取一条5 cm长的根尖接种在装有40 mL液
体培养基的100 mL三角瓶中进行培养。培养
物用滤纸吸干称鲜重, 60 ℃烘干24小时称干
重, 每处理设 5个重复。
1.3 烟碱产量的测定
以紫外分光光度法(Willits et al., 1950)测
定烟碱的含量, 设 3次重复。每瓶烟碱产量
(mg)= 根干重(mg)×根烟碱含量(%)+培养液
体积(mL)×培养液烟碱浓度(mg.mL-1)。
2 实验结果
2.1 基本培养基对发状根生长和烟碱合成
的影响
发状根无性系接种在固体MS培养基中
进行暗培养, 发状根生长旺盛, 多根毛, 没有向
地性。取发状根根尖在MS、1/2MS、1/4MS
溶液中进行发状根悬浮培养, MS培养基中生
长的根比较短粗, 而在1/2 MS和1/4 MS中生
长的根较为细长柔软; 3种处理都在接种后的
10~25天进入对数生长期, 在25天以后进入生
长停滞期。MS处理与 1/2 MS处理发状根的
生长量较为接近, 而 1/4 MS处理中的发根生
长量明显较低(图 1)。
在培养 30天后收集培养物, 测定每瓶培
养物中烟碱产量, MS、1/2 MS和 1/4 MS 3
种处理分别为(2.12±0.71) mg、(3.40± 0.83) mg
和(1.74±0.26) mg。由此看来, 1/2 MS比较适
合烟草发状根的生长和烟碱合成。MS培养
基中过高的离子浓度, 虽然对发状根的生长有
促进作用, 但在某种程度上抑制了发状根的烟
碱合成, 而在1/4MS培养基中生长缓慢, 很可
能是由于营养不足所造成的。
2.2 初始pH值对烟草发状根生长和烟碱含
量的影响
发状根在 pH值分别为 4.0、6.0、8.0的
1/2 MS培养基中进行悬浮培养, 在25天时测
定发状根的干重、烟碱含量以及培养液中烟
碱含量, 结果如图 2。
从生长量来看, 初始 pH值为 8.0时最高,
每瓶干重为(19.88±4.30) mg, pH值为4.0时, 生
长量最小, 每瓶仅为(5.56±1.21) mg。从烟碱
含量来看, pH值为 6.0的处理烟碱含量最大,
其含量为每瓶(3.96±0.89) mg, 而且绝大部分释
放到了悬浮液中; pH值为8.0的处理总烟碱含
图 1 基本培养基对发状根生长的影响
Fig. 1 Effectes of basial medium on hairy root
growth
592 22(5)
量稍低, 每瓶(2.72±1.01) mg; pH值为4.0的处
理烟碱含量最低, 而且不向培养液中释放。
2.4 激素对烟草发状根生长和烟碱含量的
影响
在pH为6.0的1/2MS培养基中, 分别添加
不同浓度的 IAA、NAA和 GA3, 在相同的条
件下进行悬浮培养, 30天后收集培养物, 分别
测定干重及烟碱总含量。从图3中看出GA3、
IAA和NAA 3种激素都能促进烟草发状根的
干物质积累, 但影响程度不同。GA3的促进作
用最大, 在 0.5 mg.L － 1浓度下可使干重达
121.5 mg, 而对照只有19.1 mg; IAA随着浓度
增高对发状根生长的促进作用增加, 在1.0 mg.
L－ 1时达到最大; NAA对发状根的促进作用
较小, 且对浓度不敏感。
从图4看出, NAA对发状根烟碱合成影响
不大, 而IAA对烟碱的合成和积累有较大的促
进作用, 在处理浓度为1.0 mg.L－1时, 可使烟
碱产量增至0.241 mg.mL－1.m－1, 而对照仅有
0.099 mg.mL－1.m－1; 相反, 不同浓度GA3处
理, 培养物中烟碱总含量与对照相比都大幅度
降低, 说明GA3虽然对发状根的生长有促进作
用, 但对烟碱的生物合成和积累有明显的抑制
作用。
3 分析
在悬浮培养过程中, 发状根的生长和物质
积累受到多种因素的影响(Sauerwein et al.,
1992; 蔡国琴等, 1995; 刘本叶等,1998)。我们
在研究中发现烟草发状根的形态、生长量及
物质合成受到基本培养基浓度的影响, 过高的
离子浓度不利于烟碱的合成, 过低的离子浓度
无法满足生长需要, 1/2MS更适合烟草发状根
的生长和烟碱合成; 发状根处于酸性环境(pH
为4), 无论对其生长还是烟碱合成都极为不利,
这与Mukundan和Hjortso (1991)的研究结论
一致。而随着初始 pH值升高, 发状根生长量
有所增加, 但烟碱的合成又有所抑制, pH值的
图 2 不同 pH值对发状根烟碱合成的影响
Fig. 2 Effects of pH on nicotin synthesis of hairy
roots
图 3 激素对发状根生长的影响
Fig. 3 Effects of hormone on hairy root growth
图 4 激素对发状根烟碱合成的影响
Fig. 4 Effects of hormone on nicotine output
5932005 慕平丽等: 悬浮培养中不同理化因子对烟草发状根生长及烟碱合成的影响
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影响可能是通过改变酶和底物的解离状态而
起作用。关于pH值为6时发状根中的烟碱绝
大部分向溶液中释放, 其机理还不太清楚, 有
可能与细胞膜通透性的改变有关; 不同浓度的
GA3、IAA和 NAA都能促进烟草的发根生
长, 以GA3的促进作用最为显著, 但GA3严重
抑制烟碱的合成, IAA对发状根烟碱合成则有
促进作用, 该结果与生长素和细胞分裂素都抑
制发状根烟碱合成的报道(Rhodes et al., 1994)
不一致。这可能是因为T-DNA的随机插入导
致了发状根遗传组成丰富的多样性, 使得不同
的发状根株系对外源激素的反应模式产生了
差异, 因而导致了相反的结论。同时, 发状根
这种丰富的无性系变异也为进行高产株系的
筛选提供了可能性。
香料烟品种sumxun的发状根在固体培养
时发状根中烟碱含量为1.57%, 与母体植株接
近。通过对上述理化因子的优化研究, 在悬
浮培养条件下烟碱产量可占毛状根干重的
17.4%。这可能是因为在悬浮培养过程中, 烟
碱不断向培养基中释放, 使得发状根中烟碱含
量维持在较低水平, 刺激了烟碱合成代谢的持
续进行, 从而在培养体系中烟碱含量远远高于
母体含量的。这也是悬浮培养有利于进行大
规模生产的优势所在。
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