全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (5): 587-593, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.05.009
收稿日期 : 2008-12-18; 接受日期 : 2009-02-22
基金项目 : 国家自然科学基金 (No.30800876)、黑龙江省博士后基金 (No.LRB06-299)和东北农业大学青年科研基金
* 通讯作者。E-mail: sf andi@163.com
.研究报告.
光合菌对黄瓜光合及抗氧化同工酶的影响
宋兴舜 1, 2 , 任静 3, 刘雪梅 1, 2 , 马双 1, 杨传平2*
1东北林业大学生命科学学院遗传学科 , 哈尔滨 150040; 2林木遗传改良与生物技术教育部重点实验室 (东北林业大学 ), 哈尔
滨 150040; 3东北农业大学成栋学院生物食品系 , 哈尔滨 150030
摘要 以2种基因型的黄瓜(Cucum is sativus)为材料, 研究光合菌(PSB)的喷施对植物生物量、净光合速率(Pn)、叶片PSII
的最大光化学效率(Fv/Fm)及抗氧化同工酶代谢的影响。结果表明, 喷施PSB均能诱导2种基因型黄瓜的生物量显著增加, 并伴
随Pn的显著提高。但是, 2种基因型黄瓜的Fv/Fm并不受PSB喷施的影响; PSB能使总过氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化
酶(APX)活性提高, 并使它们的多数同工酶的活性上调, 这些同工酶活性的增加在叶绿体中表现更为明显(如 Cu/Zn-SOD、Fe-
SOD 和 s APX)。研究结果表明, PSB能通过增强黄瓜抗氧化酶体系的活性改善植株的抗氧化能力, 从而在植株的生长和光合
作用方面起到促进作用。
关键词 黄瓜 , 同工酶 , 光合作用, 光合菌
宋兴舜 , 任静 , 刘雪梅 , 马双 , 杨传平 (2009). 光合菌对黄瓜光合及抗氧化同工酶的影响 . 植物学报 44, 587-593.
光合菌(photosynthet ic bacteria, PSB)是自然环
境里常见的微生物, 它以各种有机物(如碳)为营养, 被
广泛地用于环保领域 , 例如它们被用来处理污水、废
水(Nagadomi et al. , 2000)及含有机物沉淀的淤泥
(Takeno et al. , 1999)等。 PSB以其广泛的应用价值
而著称(Zhu et al. , 1991)。研究表明, PSB 也可应用
于农业领域。近年来将 PSB作为主效成分开发成叶
面肥的尝试越来越多(夏青等, 2006), 但以往的研究
多关注于 PSB 对作物产量影响的直接观察, 而对植
株生理过程(例如光合作用和抗氧化系统)的影响鲜有
报道。
需氧生物体内活性氧 (react ive oxygen spec ies,
ROS)的产生是一个必然过程。正常的防卫体系必须
通过消除 ROS来保证携氧细胞的存活、细胞环境的
平衡并且修复氧化带来的损害。其中, ROS 的净化
机制引起了越来越多的关注。过氧化物歧化酶
(superoxide dismutase, SOD)、抗坏血酸过氧化酶
(ascorbate peroxidase, APX)等抗氧化酶在这一机制
中起重要作用。具有较高氧化代谢活动的细胞器(如
叶绿体、线粒体和微体等)是 ROS的主要来源, 这些
细胞器内的抗氧化同工酶(如 Cu/Zn-SOD、 Fe-SOD、
M n-S OD、胞质 A PX (c AP X)、叶绿体基质 A P X
(sAPX)、叶绿体类囊体膜 APX (t APX)和微体细胞
APX (mAPX))就担负起原地清除 ROS 的责任(Wang
et al., 2004)。测量这些同工酶的活性可以为我们提
供一种直接方便的方法来了解不同细胞器内发生的
变化, 同时避免了提取细胞器的复杂及由此带来的较
高误差。本文旨在研究叶面喷施 PSB对黄瓜光合作
用的影响, 同时阐明黄瓜抗氧化酶 SOD 和 APX同工
酶对此的响应机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验中使用的光合菌购自鑫泉生物(中国)制品有限
公司, 为紫色非硫光合细菌(Rhodopseudomonas
palustris), 参照 Han(1999)的方法, 配成 2.0×109.mL-1
的悬浮液。供试黄瓜品种为津研 4 号( C uc u m i s
588 植物学报 44(5) 2009
sativus L. ‘Jinyan No.4’) (JY)和丰冠 5号(Cucumis
sativus L. ‘Fengguan No.5’) (FG)。将预先浸种、发
芽的黄瓜种子播于砻糠灰基质中, 两片子叶充分展开
后移入日本园试配方营养液(Yu and Matsui, 1997)中
并置于人工气候室内培养(光照强度为600 mmol.m-2.
s-1, 温度为 30°C/20°C, 相对湿度控制在 75%-85%,
光周期 12小时)。园试配方营养液主要由 Ca(NO3)2、
KNO3、NH4H2PO4、MgSO4、MnSO4、ZnSO4、CuSO4、
HBO3、(NH4)2Mo7O4及螯合铁等组成。培养期间每隔
5 天更换一次营养液 , 四叶一心时进行处理。将PSB
悬浮液均匀喷施于叶片上 , 隔周喷 1次, 共喷 2次,
第 2 次喷施 1 周后进行单株鲜重及单株叶面积的
测定。
1.2 实验方法
1.2.1 光合及荧光指标的测定
采用 Ciras-2型光合仪(英国 PP-Systems 公司生产)
在光饱和条件下测定净光合速率(Pn)。用 FMS2脉冲
调制式荧光仪(英国Hansatech公司生产)测定荧光参
数。在测定暗适应荧光参数时, 先将叶片放在暗适应
夹中适应 15分钟, 照射检测光(光强<0.05 mmol.m-2.
s-1) 测得Fo, 再照射饱和脉冲光(光强为12 000 mmol.
m-2.s-1)测定 Fm。在测定 Pn的同时测定光下荧光参
数, 打开内源光化光(光强 600 mmol.m-2.s-1)10分钟
后测 Fm、Fs及 Fo。利用公式计算出暗适应下PSII最
大光化学效率 , 即 Fv /Fm＝(Fm-Fo)/ Fm(Cheng et al.,
2001)。
1.2.2 抗氧化指标的测定
SOD及其同工酶活性的测定参照 Giannopolitis 和
Ries(1977)的方法并稍加修改。取磷酸缓冲液(PBS)
提取的上清液 0.05 mL, 加 3 mL反应液(15 mmol.L-1
甲硫氨酸, 65 mmol.L-1 NBT, 2.0 mmol.L-1 核黄素,
0.1 mmol.L-1 EDTA; 用 50 mmol.L-1 pH 7.8的磷酸
缓冲液 PBS配制)。在 25°C、75 mmol.m-2.s-1 下光
照 15分钟, 于黑暗下终止反应。在波长 560 nm处测
定吸光值 , 以 PBS 缓冲液代替酶液作为空白对照。
酶活性采用抑制 NBT光化学反应 50%为一个酶活性
单位表示。在测定总 SOD活性的基础上 , 通过分别
加入 3 mmol.L-1 KCN和 5 mmol.L-1 H2O2来测定Cu/
Zn-和 Fe-SOD的活性, Mn-SOD的活性由总 SOD值
减去 Cu/Zn-和 Fe-SOD值得出。
A P X及其同工酶活性的测定参照 A m ak o 和
Asada (1994)的方法并稍加改进。将 0.3 g叶片研磨
于10 mmol.L-1 PBS(pH 7.0)中(1 mmol.L-1抗坏血酸,
20%(w/v)山梨醇, 1 mmol.L-1 EDTA, 0.1%(w/v)苯甲
基磺酰氟)。悬浮液用 4层纱布过滤后 12 000 ×g离
心 30 分钟。取上清液用来测定 cAPX和 sAPX: 先测
上清液APX的OD值(A), 将5 mL上清液加入到2.0 mL
通 N2的 50 mmol.L-1 PBS(pH 7.0, 含 10 mmol.L-1
H2O2)中, 加入后分别在第 1、2、3和5分钟取1.98 mL
混合液, 加入到另一含 10 mL 100 mmol.L-1抗坏血酸
的试管中, 终止反应。而后按常规方法测定 OD值。
将测定结果作图得一直线 , 反推 0 分钟时的 O D 值
(B)。B为 cAPX值, A-B为 sAPX值。沉淀用10 mmol.
L-1 PBS (pH 7.0, 含 1 mmol.L-1抗坏血酸)悬浮。采
用同样方法测出 tAPX及 mAPX值。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 光合菌对黄瓜生物量的影响
由表 1可知, PSB的喷施均显著增加 2种基因型黄瓜
的鲜重和叶面积。与对照相比, FG的鲜重增加49%,
叶面积增加 27%; JY 鲜重增加 44%, 叶面积增加
25%。但是在整个实验过程中 , 这 2个指标在 2种基
因型之间没有明显的差异。
2.1.2 光合菌对黄瓜 Pn和 Fv/Fm的影响
由图 1可见, 2种基因型黄瓜施用 PSB后, Pn均随处
理时间的延长呈显著增加的趋势(图 1A)。而且在整
个实验过程中一直维持着这种高且明显的速率。在
处理结束时(15天), Pn值为对照植株的 2倍左右。但
是, PSB却没有引起 Fv /Fm的显著变化(图 1B); 同时,
589宋兴舜等: 光合菌对黄瓜光合及抗氧化同工酶的影响
表 1 光合菌(PSB)对黄瓜叶片单株鲜重和单株叶面积的影响
Table 1 Ef fec ts of photosynthetic bac ter ia (PSB) on f resh w eight, leaf area of cucumber leaves
Genotypes Fresh w eight (g.plant-1) Leaf area (cm2.plant-1)
Control PSB Control PSB
FG 37.28±4.81 56.28±7.42* 232.2±17.8 296.8±18.7*
JY 36.31±4.63 52.48±4.71* 205.3±30.5 258.7±20.3*
* PSB处理与对照间差异显著 (P<0.05) (n>3)
FG: 丰冠 5号 ; JY : 津研 4号
* A s ignif icant diff erence betw een PSB spray ing and control treatments at the 0.05 level (n>3)
FG: Cucumis sativus ‘Fengguan No.5’; JY : Cucumis sativus ‘Jinyan No.4’
图 1 光合菌(PSB)对黄瓜光合速率 (Pn)(A)和PSII最大光化学
效率(Fv/F m)(B)的影响
FG: 丰冠 5号 ; JY : 津研 4号
Figur e 1 Effects of spray ing photosynthetic bac ter ia (PSB)
on net photosynthetic rate (Pn) (A) , and the max imal photo-
chemical ef f ic iency of PSII (Fv/Fm) (B) in cucumber leaves f or
different times
FG: Cucumi s sati vus ‘Fengguan No.5’; JY : Cucumis sativus
‘Jinyan No.4’
图 2 光合菌(PSB)对黄瓜叶片总SOD(A)和APX(B)活性的影
响
FG和 JY : 同图 1
Figur e 2 Effects of spray ing photosynthetic bac ter ia (PSB)
on the ac tiv it ies of total SOD (A) and APX (B) in cucumber
leaves f or diff erent times
FG and JY see Figure 1
590 植物学报 44(5) 2009
在 2种基因型之间也没有观察到明显的差异(图 1)。
2.1.3 光合菌对黄瓜抗氧化酶及其同工酶活性的影
响
由图 2可知, 当植物处在无PSB喷施(对照)的环境下,
2种基因型黄瓜的总 SOD活性随时间没有改变。但
是, 在喷施 PSB后, 2种基因型黄瓜的总SOD活性随
处理时间的延长呈逐渐增加的趋势(图 2A)。无论是
在 PSB 处理还是在非处理条件下 , FG基因型的总
SOD活性均比 JY 高(图 2A)。类似地, 总 APX活性也
呈现同样的变化规律 , 只是增长的速率比 SOD慢(图
2B)。
我们进一步测定了 PSB喷施对 SOD 和 APX同
工酶活性的影响(图 3, 图 4)。在 2种基因型黄瓜之间 ,
Cu/Zn-SOD 和 Mn-SOD的活性没有明显差异, 只是
对照组中 FG的Fe-SOD活性要比 JY植株的高。PSB
的喷施在 FG植株中引起了Cu/Zn-SOD 和 Fe-SOD
的活性显著增加, 而 Mn-S OD的活性却没有增加。
类似地, 对于 JY植株来说 , 喷施PSB后Cu/Zn-SOD
的活性增加了 61%, 而 Fe-SOD 和 Mn-SOD的活性
没有变化。对于 A P X同工酶 , 在对照组中 F G 的
cAPX 和 mAPX 的活性比 JY植株的高。在 2种基因
型之间, sAPX 和 tAPX活性的差异不大 (图 4)。然
而, 在 PSB 喷施处理后, cAPX、mAPX 和 sAPX在
FG中分别增加 10%、23% 和 27%; 在 JY 中增加
54%、30% 和 25%。但是, tAPX在 2 种基因型黄
瓜之间的活性均没有差异 , 而且在喷施 PSB 后其活
性也没有明显变化。
2.2 讨论
迄今为止关于PSB对植株生长和光合作用直接影响
的报道还比较少。在本实验中 , 我们发现 PSB 能够
明显地促进植物生长和光合作用 , 在处理后期, 2种
基因型黄瓜均表现出明显的正面效果(表 1; 图1)。同
时, Fv /Fm并未受 PSB影响, 说明 PSB不会诱导光抑
制。这些结果表明 , PSB可以促进植物的生理过程 ,
因此在农业生产上可能有潜在的商业价值。究其原
因, 可能是由于 PSB 中存在一种或多种刺激生长的
物质, 它们诱导了植物生长和光合作用的发生。一些
研究人员 (Sasak i et al., 1993)报道了紫色非硫光合
细菌可以在细胞内聚集大量的 5 - 氨基酮戊酸
(aminolevulinic ac id, ALA)。用 ALA处理植物、土壤
图 3 光合菌(PSB)对黄瓜叶片 SOD同工酶 Cu/Zn-SOD (A)、
Fe-SOD (B)和 Mn-SOD (C)活性的影响
Figure 3 Eff ects of spraying photosynthetic bac ter ia (PSB)
on the activities of SOD isoenzymes inc luding Cu/Zn-SOD (A),
Fe-SOD (B) and Mn-SOD (C) in cucumber leaves
A
591宋兴舜等: 光合菌对黄瓜光合及抗氧化同工酶的影响
及植物的根部可以使农作物的产量提高到 121%-
163%(Sasak i et al., 1998)。但相关机理还有待进一
步的研究。
在本研究中, 我们发现 PSB 能够诱导一些抗氧
化酶的活性提高, 例如黄瓜的 SOD 和 APX(图 2), 以
此使植株避免或减轻氧化胁迫。在我们最近的研究
中报道了 APX同工酶(如 cAPX、sAPX 和mAPX)活性
在高温、光合抑制剂甲基紫精(methyl viologen, MV)
和 H 2 O 2 胁迫条件下可被诱导以排除过多的 H 2 O 2
(Song et al., 2005)。本研究中我们不仅发现在喷施
PSB后, 2种基因型黄瓜的 APX也有类似的变化(图
4), 而且也进一步发现 PSB能够导致总SOD、Cu/Zn-
SOD 和 Fe-SOD 活性的提高(图 3)。SOD是消除O2-
毒性的关键酶 , 环境胁迫一般会不同程度地引起
S OD 活性提高(王娟和李德全, 2001; 胡筑兵等 ,
2006)。SOD在不同的细胞器官中有 3种不同的同工
酶。Cu/Zn-SOD多数位于叶绿体、细胞溶质和过氧
化物酶体中, 而 Fe-SOD和Mn-SOD分别位于叶绿体
和线粒体内(Alscher et al., 2002)。2种基因型黄瓜的
PSB处理组与对照组相比 , 总 SOD活性随着 Cu/Zn-
SOD和 Fe-SOD活性的增加而增加, 而Mn-SOD活性
几乎没有改变(图 3)。这种差别的原因(或至少部分原
因)可能是在不同细胞器内产生的 O2-量不同以及不
同 SOD同工酶对 O2-敏感程度不同。有报道表明胁
迫不足以诱导Mn-SOD活性改变, 但可以诱导叶绿体
中酶活性的提高(Alscher et al., 2002), 并且叶绿体比
其它细胞器对 ROS更敏感(Samis et al. , 2002)。
值得一提的是, 抗氧化酶活性的提高一般意味着
发生了不同程度的氧化胁迫。本实验中 SOD、APX
及其同工酶活性整体上均上调, 表明植株受到了一定
程度的胁迫。我们推测这与 PSB的浓度有关。今后
我们将尝试研究较低浓度的PSB对黄瓜植株抗氧化
系统的影响。
综上所述, 我们发现 PSB 能够促进黄瓜植株的
生长和光合作用, 通过在整体水平上提高 S OD 和
APX活性来改善植物的抗氧化能力。这些结果将为
PSB在农业生产上的进一步应用提供理论依据。
图 4 光合菌(PSB)对黄瓜叶片 APX同工酶 cA PX (A)、mA PX
(B)、sA PX (C)和 tA PX (D)活性的影响
Figur e 4 Ef fec ts of spraying photosynthetic bac ter ia (PSB)
on the ac tiv ities of APX isoenzymes including cAPX (A), mAPX
(B), sAPX (C) and tAPX (D) in cucumber leaves
A
592 植物学报 44(5) 2009
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Xingshun Song1, 2 ,Jing Ren3, Xuemei Liu1, 2, Shuang Ma1 ,Chuanping Yang2*
1De partme nt o f Gene tics, Coll ege of Li fe Scie nce , Northea st Fore stry University, Ha rbi n 1 500 40, Chi na; 2Ke y L aborato ry of Fore st
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Abstr act We examined the net photosynthetic rate (Pn), the max imal photochemical eff iciency of PSII (Fv/Fm) and the ac tivities of
antioxidant isoenzymes in cucumber (Cucumis sativus) w ith or w ithout photosynthetic bacteria (PSB) application. PSB spraying
resulted in a s ignif icant inc rease in f resh w eight and leaf area for both genotypes of cucumber plants , accompanied by a marked
increase of Pn. How ever, Fv/Fm show ed negligible changes. Exogenous PSB also increased activities of total superoxide dismutase
(SOD) and ascorbate peroxidase (A PX) , and a general inc rease of their isoenzymes . The inc reased level in Cu/Zn-SOD, Fe-SOD
and stroma APX (sAPX) w as most signif icant in chloroplasts. These results implied that PSB played a f avorable role in grow th and
photosynthes is and improved hardiness in cucumber by enhanc ing antiox idant enzyme activities.
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* Author for correspondence. E-mail: sfandi@163.com
(责任编辑: 白羽红)