全 文 ：植物学通报 2005, 22 (增刊): 1~10
Chinese Bulletin of Botany
①国家重点基础研究发展规划项目(G1999011700)和国家自然科学基金项目(30170088)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: chenja@public.bta.net.cn
收稿日期: 2004-03-16 接受日期: 2004-09-01 责任编辑: 孙冬花
综述
植物细胞膜 NADPH氧化酶的研究进展①
郝福顺 陈 珈②
(中国农业大学生物学院, 植物生理生化国家重点实验室 北京 100094)
摘要　 植物细胞质膜NADPH氧化酶是植物中一种与哺乳动物嗜中性粒细胞gp91phox同源的氧化还原
酶。当植物受到生物或非生物胁迫时, 该酶通过短时间内大量产生信号分子活性氧(active oxygen
species, AOS)调节基因表达和细胞代谢, 使植物及时对逆境胁迫作出反应, 以适应环境的变化。NADPH
氧化酶在调节植物的生长和发育方面也起着非常重要的作用。本文对其结构特征、活性调节和功能等
方面的最新进展进行了综述。
关键词　 质膜, NADPH氧化酶, 活性氧, Ca2+
Research Advances in NADPH Oxidative Enzymes in the
Plasma Membrane of Plant Cells
HAO Fu-Shun CHEN Jia②
(State Key Laboratory for Plant Physiology and Biochemistry, China Agricultural University,
Beijing 100094)
Abstract The nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidative enzymes, homologues of
the mammal gp91phox enzymes in neutrophils, in the plasma membrane of plant cells modulate
gene expression and regulate cellular metabolites of plants by substantive production of active
oxygen species (AOS) under abiotic and biotic stresses. Consequently, plants can rapidly re-
spond to stresses and adapt to environmental changes. The enzymes are also important in the
regulation of plant growth and development. In present paper recent research progress about
the structure and function of the NADPH oxidative enzymes are reviewed and regulation of
enzyme activity is discussed also.
Key words Plasma membrane，NADPH oxidative enzymes，Active oxygen species, Ca2+
NADPH氧化酶是主要存在于哺乳动物嗜
中性粒细胞、植物细胞和丝状真菌细胞中的
一种以胞质NADPH为电子供体, 催化胞外O2
生成超氧阴离子(O2-. )的氧化还原酶(Lamb and
Dixon, 1997; Vignais, 2002; Lara-Ortiz et al.,
2003)。人嗜中性粒细胞NADPH氧化酶主要
由两部分组成, 一部分为核心酶, 由 p40phox、
p47phox、p67phox、p22phox和 gp91phox组成;
另一部分为 2个小分子量的鸟苷酸结合蛋白
Rac2和Rap1A。在静息状态下, NADPH氧化
2 22(增刊)
酶无活性, p40phox、p47phox和 p67phox作为一
个复合体存在于细胞质中; p22phox和gp91phox
以异二聚体存在于质膜中, 该二聚体被称为细
胞色素b558。gp91phox为大分子的糖蛋白, 含
有辅基 FAD和血红素。p22phox为小分子量
的蛋白质。Rac2位于胞质中, Rap1A位于质
膜中。当细胞受到病原菌的刺激时 ,
p40phox、p47phox和 p67phox复合体与结合了
GTP的Rac2一起迁移到质膜与b558结合, 形
成有活性的NADPH氧化酶, 短时间内产生大
量的O2-. , O2-. 很快歧化为OH.和H2O2等其他活
性氧(active oxygen species, AOS), 该过程被
称为氧化猝发 (Vignais, 2002)。
当植物或悬浮细胞受到病菌侵染, 特别是
非亲和性侵染时, 会出现类似于人嗜中性粒细
胞的氧化猝发现象(Doke, 1983; Lamb and
Dixon, 1997; 蔡以滢等, 1999a; Wang et al.,
2002)。非亲和性的病菌孢子、激发子及一
些非生物胁迫都可诱导植物产生氧化猝发。
这些现象能够被嗜中性粒细胞 NADPH氧化
酶较专一的抑制剂碘二苯( D i p h e n y l c y -
clopropenone chloride, DPI)有效抑制。用人
的 p47 phox和 p67 phox制备的抗体可与大豆
(Glycine max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)
和拟南芥(Arabidopsis thaliana)细胞提取液中
大小相近的多肽产生免疫交叉反应(Dwyer et
al., 1996; Lamb and Dixon, 1997; Xing et al.,
1997; 蔡以滢等, 1999b), p22phox的抗体也可与
大豆细胞膜中分子量大小相当的蛋白质发生
免疫反应, 证明O2-. 主要来自质膜NADPH氧化
酶(蔡以滢等, 1999b)。但植物中是否具有
p22phox、p47phox、p67phox和 p40phox的同源
物存在争议, 因为在植物中, 目前尚未见到这
些蛋白同源物基因的报道。植物中具有与嗜
中性粒细胞小G蛋白Rac同源物的RhoGTPase
亚家族, 称为Rop, 现已从多种植物中克隆到了
编码 Rop的基因(Valster et al., 2000)。Rop
蛋白具有结合GTP的氨基酸序列TKLD, 大部
分 C末端有 1个异戊二烯化位点。Rop的种
类比 Rac丰富。
尽管没有从植物中纯化到 gp91phox的同
源蛋白, 但已从拟南芥(Keller et al., 1998;
Torres et al. , 1998)、水稻(Oryza sativa)
(Groom e t a l . , 1996)、烟草(Nicot iana
tabacum) (Simon-Plas et al.,2002; Yoshioka et
al . , 2003)、马铃薯(Solanum tuberosum)
(Yoshioka et al., 2001)和番茄(Lycopersicon
esculentum) (Amicucci et al., 1999)等多种植
物中克隆到了与人 g p 9 1 p h o x 同源的植物
NADPH氧化酶基因 RBOH (RESPIRORY
BURST OF OXYGEN HOMOLOGUES), 并检测
到了其转录产物。计算机分析表明 Rboh位
于膜上(Keller et al., 1998; Torres et al., 1998),
用生化方法也已证实其定位在细胞质膜上
(Keller et al.,1998; Sagi and Fluhr, 2001; Olmos
et al., 2003)。近年来, 利用突变体从基因水
平证明, 植物氧化猝发中, 质膜NADPH氧化酶
起关键作用(Simon-Plas et al., 2002; Torres et
al., 2002; Kwak et al., 2003; Yoshioka et al.,
2003)。
1 植物质膜NADPH氧化酶的结构
目前从拟南芥中已得到 10个与 gp91phox
同源的 Rboh基因(RbohA-J)(Foreman et al.,
2 0 0 3 )。对 R b o h A-F 的分析研究表明 ,
RbohA-F与 gp91phox氨基酸序列同源性为
59.5% ~ 62.3%, 具有6个跨膜区(图1), 分别
由 897、843、905、921、948和 944个氨
基酸组成(gp91phox只有 570个氨基酸)。其N
端为亲水区, 具有gp91phox中不存在的300个
左右氨基酸, 推测位于胞质中, 该区域含有1~2
个保守的Ca2+结合EF手性模体结构(Torres et
al., 1998)。C端中有一些结构, 如结合黄素和
NADPH的区域在 Rboh中也是保守的。
Keller等(1998)仔细地分析了拟南芥的
RbohA基因。发现 RbohA除具有上面 Rboh
32005 郝福顺等: 植物细胞膜 NADPH氧化酶的研究进展
的特征外, 其C末端区与gp91phox脱辅基蛋白
(69 kD)显著相似, 该区有 32%的氨基酸与
gp91phox相同, 其中包括与 gp91phox催化区和
胞质结合区同源的区域; gp91phox完成其功能
所必需的一些结构, 如结合血红素的4个组氨
酸残基及保守的Pro-415和Asp-500残基等在
RbohA中也是保守的。RbohA与人的 Ran-
GTPase激活蛋白1(RanGAP1)具有很多相似
性。整个RbohA有23%的氨基酸与RanGAP1
相同 , 有的区域相同的氨基酸达 4 0 % ,
RanGAP1中的一些保守氨基酸残基在RbohA
中也是保守的。抗体交叉反应说明RbohA不
像 gp91 phox 那样高度糖基化。其他植物的
gp91phox同源蛋白结构与Rboh类似, 推测它们
和 gp91phox都来自共同的祖先(图 2)。
研究表明 Rboh均为单拷贝。正常条件
下Northern只能够检测到RbohD、RbohE和
RbohF的 mRNA, 其中 RbohD和 RbohF的
mRNA较丰富, 在根中的含量显著高于叶和
茎。用RT-PCR方法可检测到RbohA、RhohB
图 1　Rboh蛋白的模式图
图中显示的是该蛋白在膜中的定位, 6个跨膜区(罗马字母所示), 2个亚铁血红素可能的位置(实心三角箭
头所示), FAD, NAD/P(r, 核糖; a, 腺嘌呤)结合位点以及 EF手性
Fig.1　Schematic representation of a Rboh protein (Torres et al., 1998)
The protein in the membrane has six transmembrane domains (indicated with Roman letters) and the putative
position of the two hemes (indicated with filled triangles), the FAD and NAD/P (r, ribose; a, adenine) binding sites
and the EF-hand
图2　各种植物Rboh同源物的系统进化树(引自Yoshioka et al., 2003)
利用相邻连接法构建的无根进化树。代表序列的平行线长度与这些序列估计的遗传距离成正比。平行
线上面或下面的数字指该分支在 1 000次重复中出现的概率
Fig.2　Phylogenetic tree of various plant respiratory burst oxidase homologs (Yoshioka et al., 2003)
An unrooted tree was constructed using the neighbor-joining method. The length of the horizontal lines connecting
the sequences is proportional to the estimated genetic distance between these sequences. The number above or
below each horizontal line is the frequency with which a given branch appeared in 1 000 bootstrap replications
4 22(增刊)
和RbohC的mRNA, 它们在根中分布多, 在地
上部分器官中分布较少(Torres et al., 1998)。
2　植物质膜 NADPH氧化酶的功能
质膜NADPH氧化酶通过催化产生AOS,
在抵御病原物、应答非生物胁迫反应以及调
节植物的生长发育中起非常重要的作用。
2.1　参与植物的防御反应
当致病菌侵染植物或悬浮细胞时, 植物会
发生氧化猝发, 产生大量的O2-. 、OH.和H2O2
等AOS。AOS能够通过本身的毒害作用直接
杀灭病原菌; 也可通过促进植物受侵染部位细
胞壁糖蛋白的交联和木质素的合成阻止病原
菌侵入临近的组织或细胞; 还可激活水杨酸的
生物合成, 使植物产生对病菌的系统抗性; 同
时可诱导有关的抗性基因表达, 产生抵抗病菌
的物质, 如植保素等。此外, AOS能够使受侵
染的寄主细胞产生程序性死亡, 将病菌限定在
受侵染的部位 , 保护植物免受更大的危害
(Doke et al., 1996; Lamb and Dixon, 1997)。
实验表明, 氧化猝发中, AOS主要是由NADPH
氧化酶催化产生。细菌激发子Harpin能够诱
导拟南芥 N A D P H 氧化酶表达产生 A O S
(Desikan et al., 1998)。在拟南芥的抗病反应
中, AtrbohD和AtrbohF对于AOS的积累都是
必需的(Torres et al., 2002)。用病毒诱导的基
因沉默法证明, 编码烟草 N A D P H 氧化酶
NbrbohA和NbrbohB的基因在本塞姆氏烟草
(Nicotiana benthamiana)抗病反应中参与了
H2O2的生成和对病菌的抵抗(Yoshioka et al.,
2003)。电泳方法也证实, 烟草叶片用花叶病
毒处理后能够通过增加 NADPH氧化酶的量
促进O2-. 的产生(Sagi and Fluhr, 2001)。
2.2　参与植物对非生物胁迫的反应
在 ABA和水分胁迫下, 玉米幼苗质膜
NADPH氧化酶的活性显著提高, 产生了大量
的O2-. , 抗氧化酶的活性也明显提高(Jiang and
Zhang, 2002)。拟南芥 NADPH氧化酶基因
AtrbohD和 AtrbohF的双突变体破坏了ABA
诱导的气孔关闭、ABA对AOS产生的促进、
ABA诱导的胞质Ca2+浓度的增加以及ABA对
气孔保卫细胞质膜 Ca 2+可通透性通道的激
活。已经从分子水平证明, NADPH氧化酶在
ABA信号转导中起重要作用(Kwak et al.,
2003)。
NADPH氧化酶与 Cu、Fe和 Zn等金属
的营养密切相关。在 Cu缺乏或过量的情况
下, 硬粒小麦根细胞质膜NADPH氧化酶活性
明显提高(Quartacci et al., 2001)。Fe和Zn的
缺乏分别导致番茄和大豆植物 NADPH氧化
酶活性增加及AOS水平的提高(Pinton et al.,
1994)。镉能够诱导烟草悬浮细胞产生氧化猝
发, 用组织化学的方法证实H2O2首先产生于
质膜, NADPH氧化酶的抑制剂DPI和imidazole
都能够抑制H2O2的产生, 说明NADPH氧化酶
在此过程中起关键作用(Olmos et al., 2003)。
烟草悬浮细胞在低渗胁迫下, NADPH氧化酶
活性提高, DPI能够有效抑制其活性(Cazalé et
al., 1998)。紫外线也可显著升高 NADPH氧
化酶的活性(A-H Mackerness et al., 2001)。此
外, NADPH氧化酶在植物对干旱(Zhao et al.,
2001)、冷(Shen et al. , 2000)和机械伤害
(Orozco-Cárdenas et al., 2001)等胁迫反应中都
起重要作用。
2.3　调节植物生长发育
对拟南芥根和根毛生长受抑制突变体
r h d 2 的分析表明 , 突变表型是由于编码
NADPH氧化酶的基因发生变化所致; 对突变
体和野生型的比较研究证实了由 NADPH氧
化酶产生的AOS, 使根和根毛顶端细胞质膜发
生超极化, 激活了质膜Ca2+内流通道, 使胞质
Ca2+浓度升高, 从而促进了细胞的伸长和根毛
的发生(Foreman et al., 2003)。
玉米生长的过程中, 其叶片的伸长区产生
大量 AOS, 其中的 H2O2主要存在于质外体。
用DPI处理, O2-. 和H2O2的积累均受到抑制, 同
52005 郝福顺等: 植物细胞膜 NADPH氧化酶的研究进展
时抑制了叶片伸长区的生长, 这种抑制作用能
够被外源H2O2部分逆转, 说明NADPH氧化酶
对于玉米叶片的发育是必需的(Rodriguez et
al., 2002)。
NADPH氧化酶参与了萝卜(Raphanus
sativus)种子萌发过程中 AOS的形成(Schop-
fer et al., 2001)、陆地棉纤维细胞次生壁的形
成(Potikha et al., 1999)和植物木质部的木质化
(Barceló, 1998), 其产生的AOS能够降低烟草
原生质体的再生能力 ( P a p a d a k i s a n d
Roubelakis-Angelakis, 1999)。
3　植物质膜NADPH氧化酶的活性
调节
3.1　Ca2+激活NADPH氧化酶
Ca2+是植物细胞重要的信使, 它偶联各种
胞内外信号, 参与细胞的多种基本生命过程。
植物中 gp91phox的同源物具有保守的钙结合
EF手性模体结构, 提示Ca2+可与其直接结合
而发生相互作用。实验表明, 生物和非生物
胁迫导致的氧化猝发都与胞质Ca2+浓度的增
加有关。Ca2+能够促进AOS的产生, 而 Ca2+
通道的阻断剂和Ca2+螯合剂对AOS的生成有
抑制作用(Lamb and Dixon, 1997; Jong et al.,
2002; Jiang and Zhang, 2003; Olmos et al.,
2003)。电泳和免疫交叉反应说明, 在烟草
病毒诱发的氧化猝发中, Ca2+可能直接激活
NADPH氧化酶(Sagi and Fluhr, 2001)(图
3)。蛋白激酶抑制剂 staurosporine及钙调
素抑制剂W-7和ophibolin可有效抑制激发
子诱导的氧化猝发, 说明Ca2+可能通过磷酸
化调节 NADPH氧化酶的活性(Lamb and
Dixon, 1997)。Xing等(2001)用拟南芥钙依
赖蛋白激酶(CDPK)基因转化番茄原生质体
后增加了原生质体NADPH氧化酶的活性。
钙调素也可能通过调节 N A D 激酶增加
NADPH的量间接激活NADPH氧化酶(Neill
et al. , 2002)。
3.2　ABA参与该酶的调节
ABA作为主要的植物激素和细胞内重要
的信号分子, 与细胞内多种代谢密切相关。
外源ABA能显著提高细胞质膜NADPH氧化
酶的活性, ABA合成的抑制剂钨酸盐可有效抑
制其活性的升高, 钨酸盐的抑制效应能被外源
ABA逆转。进一步的研究表明, 外源ABA不
能直接激活NADPH氧化酶, 但却能增加O2-. 的
产生量, 因此ABA调节NADPH氧化酶的活性
可能需要细胞内其他因子的参与(Jiang and
Zhang, 2002)。
3.3　Rop蛋白可正负调节NADPH氧化酶
Park等(2000)以大豆悬浮细胞为材料, 发
现21 kD的Rop蛋白在激发子诱导的氧化猝发
中从胞质转运到了膜上。分别用人Rac1抑制
型表达载体 R a c N 1 7 和激活型表达载体
RacV12瞬时转化大豆细胞。比较这两类转化
细胞对低渗、oligo-GalUA和 harpin激发子
的反应, 发现前者产生 AOS的量明显少于后
者。番茄中 21 kD的 Rop蛋白在对特异激发
子的反应中也从胞质转运到了质膜。在非亲
和性病原物诱发大豆细胞的氧化猝发中, G蛋
白的抑制剂suramin有明显抑制作用(Rajase-
khar et al., 1999)。与 Rac2同源的烟草 Rop
蛋白也参与了激发子诱导的氧化猝发(Kieffer
et al., 1997)。在水稻中, Rop参与了 AOS的
产生和细胞的程序性死亡(Kawasaki et al.,
1999)。实验证实, 在缺氧情况下, 拟南芥能够
通过激活 Rop信号激活 NADPH氧化酶产生
H2O2应答胁迫反应(Baxter-Burrell et al. ,
2002)。最近, Morel等(2004)从烟草中克隆了
5个编码Rop蛋白的 cDNA(Ntrac1-5)。当用
真菌激发子 cryptogein处理烟草叶片和细胞
时, Ntrac5 mRNA受到抑制。在激发子诱导
的氧化猝发中, 过表达 Ntrac5的烟草细胞其
NADPH氧化酶基因NtrbohD的活性在转录和
翻译水平均受到抑制, Ntrac5作为NtrbohD的
负调节因子在起作用。以上结果说明, Rop蛋
6 22(增刊)
白在植物 NADPH氧化酶的调节中起重要作
用(图 3 )。
3.4　其他因子的调节作用
尽管还没有直接在植物中分离到与
p40phox、p47phox和p67phox同源的蛋白或
基因, 但是在烟草中发现能够与 p47phox和
p67phox抗体反应的蛋白被磷酸化, 同时从胞
质转运到了质膜, 这说明植物细胞中很可能存
在p47phox和p67phox的同源物并调节NADPH
氧化酶的活性(Xing et al., 1997; 蔡以滢等,
1999b)。在大豆细胞的氧化猝发中, 多种激酶
参与了 NADPH氧化酶活性的调节(Rajase-
khar et al., 1999)。植物受伤后, 寡聚半乳糖
醛酸酶能够刺激 N A D P H 氧化酶的活性
(Orozco-Cárdenas et al., 2001)。另外, 乙烯
在番茄悬浮细胞的氧化猝发中能够显著促进
NADPH氧化酶的活性(Jong et al., 2002)。磷
酸脂酶D和磷脂酸也可激活拟南芥NADPH氧
化酶大量产生O2-. (Sang et al., 2001)。黄瓜幼
苗的抗冷性试验表明, 亚精胺能够抑制NADPH
氧化酶的活性(Shen et al., 2000)。
4 与植物 NADPH氧化酶相关的
信号转导
质膜NADPH氧化酶催化产生的AOS, 特
别是其中的H2O2可作为信号分子向下游传递,
引起细胞内一系列的应答反应。
4.1　Ca2+是NADPH氧化酶的下游信号
植物NADPH氧化酶可能通过在Ca2+通道
附近产生AOS调节质膜Ca2+通道, 从而调控
胞质Ca2+浓度(Kwak et al., 2003)。
在拟南芥根和根毛的发育中, 根和根毛顶
端细胞质膜NADPH氧化酶产生的AOS激活
质膜Ca2+通道, 导致胞内Ca2+浓度升高, 促进
了根和根毛的生长(Foreman et al., 2003)。 其
他的实验也表明, 拟南芥根发育中产生的AOS
可导致质膜Ca2+内流和K+外流(Demidchik et
al., 2003)。在 ABA信号传递中, NADPH氧
化酶AtrbohD和AtrbohF催化产生的H2O2, 超
极化激活质膜Ca2+可通透性通道, 使胞质Ca2+
浓度升高, 导致气孔关闭(Kwak et al., 2003)。
烟草悬浮细胞在对低渗胁迫和激发子的反应
图 3　植物 NADPH氧化酶与 ABA、Ca2+、AOS、Rop、激酶和磷酸脂酶的关系模式图
Fig.3　Schematic representation of a testable model for the interaction among NADPH oxidases, ABA, Ca2+,
AOS, Rop, kinases and phosphorylases
72005 郝福顺等: 植物细胞膜 NADPH氧化酶的研究进展
中, NADPH氧化酶催化产生的AOS不仅诱导
Ca2+通道的开放, 而且可导致Cl-和K+的外流
(Cazalé et al., 1998)。
4.2　激酶和磷酸酶传递AOS信号
蛋白激酶级联 M A P K、M A P K K 和
MAPKKK是植物细胞重要的信号途径, H2O2
和激发子都能够激活该级联(Desikan et al.,
2001)。2C蛋白磷酸酶(PP2C)参与了紫苜蓿
(Medicago sativa)损伤诱导的MAPK途径的
负反馈调节(Meskiene et al., 1998)。Rentel等
(2004)从拟南芥中克隆了1个编码丝氨酸 /苏
氨酸激酶的基因OXI1,许多产生H2O2的氧化
猝发都能够诱导该基因的表达。进一步的研
究表明, OXI1是氧化猝发信号向下游传递中重
要的组分(图 3)。
4.3　AOS的其他下游信号
AOS可直接氧化对氧化还原敏感的蛋白
质或间接通过氧化还原敏感分子如谷胱甘肽
或硫氧还蛋白控制细胞的氧化还原状态。氧
化还原敏感的代谢酶可直接调节细胞代谢, 而
氧化还原敏感的信号蛋白则通过下游信号成
参 考 文 献
分执行其功能(Vranová et al., 2002)。另外,
H2O2能够诱导水杨酸和乙烯等激素的合成, 因
此, NADPH氧化酶可能通过植物激素参与细
胞的代谢反应(Chamnongpol et al., 1998)。
5 展望
近年来, 由于分子生物学技术和各种突变
体的应用, NADPH氧化酶的研究取得了很大
进展。但该酶的许多方面仍是未知的, 如对
其结构的了解目前还只是推测, 对其活性调节
的研究也不深入。无疑对这一重要膜蛋白分
子结构的解析和活性调节分子机理的阐明还
将任重道远。今后应对以下方面加强研究: 1)
植物NADPH氧化酶的结构及主要的结构域与
功能的关系; 2)NADPH氧化酶的活性调节, 特
别是胞质调节因子; 3)与NADPH氧化酶相关
的信号传递机制; 4)NADPH氧化酶与其他信号
途径的交互作用。相信随着植物基因组和蛋
白质组研究的不断深入, 人们最终能够从分子
水平真正了解植物细胞的 NADPH氧化酶。
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