全 文 ：植物学通报 2006, 23 (6): 665~669
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2005-12-08; 接受日期: 2006-05-10
基金项目: 陕西省自然科学基金(No. 99JK122)和陕西省教育厅专项科研资金(No. 04JK133)
* Author for correspondence. E-mail: weiyahuicn@yahoo.com.cn
.研究论文.
乙型肝炎表面抗原基因转化花生及其表达
朱剑光,尉亚辉*,郭芝光,吴艺舟,郝浩永,孙杰
西北大学生命科学院 教育部西部资源与现代生物技术重点实验室, 西安 710069
摘要 构建了乙肝表面抗原主蛋白基因(SHBs)的植物表达载体, 通过农杆菌介导转化花生(Arachis
hypogaea)并利用潮霉素筛选出抗性苗, 经PCR和Southern杂交鉴定转基因植株; 取植株的蛋白粗提液
进行ELISA检测, 结果表明, SHBs能在花生中表达, 且具有免疫原性, 其在新鲜叶片中的表达量约
为2.41 mg.g-1鲜重, 占总可溶性蛋白的0.033%。
关键词 乙肝表面抗原, 花生, 转基因植物, 口服疫苗
The Transformation and Expression of HBsAg Gene
in Arachis hypogaea
Jianguang Zhu, Yahui Wei*, Zhiguang Guo, Yizhou Wu, Haoyong Hao, Jie Sun
Northwest University, Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of
Education, Xi’an 710069
Abstract A plant expression vector carrying hepatitis B surface antigen (HBsAg) gene was con-
structed and used to transform Arachis hypogaea mediated by Agrobacterium tumefacient. Transgenic
Arachis hypogaea plants were identified by PCR and southern-blot. ELISA assay showed that the
HBsAg gene was expressed in transgenic Arachis hypogaea and had a expressing level of
2.41µg.g-1 fresh leaves.
Key words HBsAg, Arachis hypogaea, transgenic plant, edible vaccine
20世纪70年代, 人们开始利用基因工程技
术生产疫苗, 至今已经开发出了细菌和酵母等重
组系统。这种微生物反应器生长迅速, 容易室
内大规模培养和操作, 相对于血清灭活疫苗而言
其来源容易而且价格便宜, 是现用疫苗的主要来
源方式。20世纪90年代以后, 人们进一步将病
毒基因转化植物细胞并诱导其表达, 特别是转化
番茄等水果, 因其能新鲜食用, 故又称为口服疫
苗, 并且通过饲喂动物证明了口服同样能引起免
疫应答。但目前抗原蛋白在植物中的表达量
往往不高, 例如在马铃薯中表达的乙肝表面抗原
含量只有1.1 µg.g-1鲜重(Richter et al., 2000), 太
低含量的抗原容易因蛋白酶的水解而达不到诱
导机体应激的浓度, 因而提高植物反应器的抗原
表达量是植物口服疫苗的关键。
本文选择积累蛋白能力较强的豆科植物花
生(Arachis hypogaea)作为转基因受体, 以提高
抗原蛋白在植物中表达量的积累。我们成功
的将乙肝表面抗原主蛋白基因转化花生, 并正确
表达, 为口服疫苗和免疫增强剂的进一步研发打
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下了良好基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 pBI121载体为中国科学
院上海生命科学研究院植物生理生态研究所张
洪霞研究员惠赠; pCAMBIA1301载体为澳大利
亚CAMBIA研究中心惠赠; 农杆菌LBA4404购
自北京鼎国生物技术有限公司。
1.1.2 主要试剂 North2South直接HRP标记
检测试剂盒购自Pierce公司; 乙型肝炎病毒表面
抗原(HBsAg)诊断试剂盒(酶联免疫法)购自北京
万泰生物药业有限公司; 限制性内切酶购自
TaKaRa; T4 DNA连接酶购自 Fermentas Life
Sciences; 乙肝表面抗原主蛋白购自华美生物工
程公司。
1.1.3 培养基 共培养培养基(MS+10 mg.L-1
6-BA+0. 8 mg.L-1NAA)、脱菌培养基(MS+10
mg.L-16-BA+0.8 mg.L-1 NAA+500 mg.L-1Cef)、
筛选培养基(MS+10 mg.L-1 6-BA+0.8 mg.L-1
LNAA+20 mg.L-1 LHyg+300 mg.L-1 Cef)、生
根培养基(1/2MS+1.0 mg.L-1NAA+ 20 mg.L-1
Hyg+150 mg.L-1 Cef)。
1.2 方法
1.2.1 质粒构建 从乙肝患者血清中克隆乙肝
表面抗原主蛋白基因(SHBs), 构建克隆载体
pUC19/HB和植物表达载体pCAMBIA1301/HB,
经测序和翻译比对确定所得抗原为adr亚型(张
儒等, 2005)。
1.2.2 转化农杆菌 参照王关林等(2002)的方
法, 将构建好的植物表达载体pCAMBIA1301/
HB转化到根癌农杆菌LBA4404中。
1.2.3 花生再生体系的建立以及对潮霉素
敏感性试验 花生( Arachis hypogaea)种子消
毒后掰开, 保留带胚芽的一瓣, 点播于1/2MS+50
mg.L-1Amp 固体培养基中发芽。约6~7天, 将
下胚轴切成约8 mm的小段, 先置于分化培养基
上诱导 1周, 然后转至分别含有 0、5、10、
15、20、25、30、35、40、45、50 mg.L-1
潮霉素(Hyg)的分化培养基中, 以测定花生愈伤
对Hyg的敏感性。2周后, 在不含Hyg的分化
培养基上, 花生分化出2~4 cm的丛生芽, 把丛
生芽剪下, 再分别转到含有以上梯度浓度Hyg
的1/2MS+1.0 mg.L-1NAA生根培养基中, 以测
定无菌苗对潮霉素的敏感性。
1.2.4 转化花生 按王关林和方宏筠(2002)的
叶盘转化法转化花生。下胚轴在活化的菌液
中侵染15~20分钟, 转至共培养培养基中暗培养
2天, 接着光照培养2天, 然后转至脱菌培养基
光照培养1周,再于筛选培养基继续光照培养。
4周后, 将丛生芽剪下, 转至生根培养基诱导生
根, 3~4周后打开封口膜,炼苗约4天, 移栽入蛭
石土生长。
1.2.5 PCR鉴定 取转化植株和阴性对照组的
新鲜叶片, 利用CTAB法提取总DNA, 再根据
NCBI中登录号为AY646444.1的乙肝病毒基因
序列设计引物, P1: 5 AACGGGATCCCGC-
ACCATG-GAGAACACAACATCA3, P2: 5
CCCGGAATTCCGGCTTAAATGTATAC-
CCAAAGAC3。反应条件为: 94℃, 5分钟;94
℃,30秒;59℃,40秒;72℃,60秒;72℃,10分钟; 35
个循环。
1.2.6 Southern杂交鉴定 先以构建的
pCAMBIA1301/HB质粒为模板做PCR反应, 扩
增出乙肝表面抗原基因片段, 约 700 bp。以此
按 Pierce公司的“North2South直接HRP标记
检测试剂盒”说明书操作制备探针。再提取
转化植株的新鲜叶片的总DNA, 进行琼脂糖凝
胶电泳, 变性后按毛细管法转至杂交膜, 接着按
Pierce公司的“North2South直接HRP标记检
测试剂盒”说明书进行杂交, X光胶片曝光检
测 。
1.2.7 ELISA检测 将乙肝表面抗原主蛋白标
准品稀释成不同浓度, 按北京万泰生物药业有限
公司的“乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断
试剂盒(酶联免疫法)”使用说明书操作, 用酶
6672006 朱剑光 等: 乙型肝炎表面抗原基因转化花生及其表达
标仪于450/630 nm双波长检测, 将结果绘制成
SHBs含量的标准曲线。提取转基因植株的新
鲜叶片的蛋白粗提液, 进行同样的ELISA检测,
将结果与标准曲线比对测定转基因植株中抗原
的含量。
2 结果
2.1 农杆菌转化的鉴定
挑取在添加有 50 mg.L-1 km和 50 mg.L-1
Rif的LB培养基上生长的转化农杆菌LBA4404
单菌落, 扩繁后提取其质粒, 进行PCR鉴定(引
物及反应条件同 1.2.5节), 得到了 700 bp左右
的条带,与 SHBs大小一致。表明 pCAMBIA-
1301/HB质粒已经成功转化到了 LBA4404中
(图 1)。
2.2 花生再生体系的建立及其对潮霉素的
敏感性测定
每个花生下胚轴在MS+10 mg.L-1 6-BA +
0.8 mg.L-1 NAA培养基中分化出约2.7个丛生
芽, 当培养基中潮霉素浓度达到20 mg.L-1时能
有效抑制下胚轴的分化, 继续提高浓度达到30
mg.L-1时, 下胚轴在8周内均褐化死亡, 故选择
20 mg.L-1作为筛选压力浓度。
2~4 cm的丛生芽在 1/2MS+1.0 mg.L-1
NAA培养基中生根良好, 当 NAA浓度达到 2
mg.L-1时, 也能诱导花生生根, 但当其根长约
1~2 cm后就不再伸长, 而是不断膨大, 部分
褐化死亡。
在加有不同浓度潮霉素的生根培养基中,
当潮霉素浓度大于5.0 mg.L-1时丛生芽均不能
生根, 且6周内全部死亡; 而经PCR和Southern
杂交鉴定为阳性的转基因植株在含有20 mg.L-1
潮霉素的1/2MS 生根培养基中生根良好, 练苗
后能移栽成活(图 2)。
2.3 转基因植株的获得与鉴定
转化植株的总DNA的PCR结果得到了700
图 1 pCAMBIA1301/HB质粒 PCR扩增产物的凝
胶电泳
1~4. PCR产物
Fig. 1 PCR examination of pCAMBIA1301/HB con-
struct
M. lDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; 1-4. PCR Prod-
ucts of HBsAg gene
图 2 转基因花生的再生过程中各个阶段的图片
A. 外植体; B. 丛生芽; C. 培养基中生长的转化花生
植株; D. 移栽花盆的转基因花生植株
Fig. 2 Transgenic Arachis hypogaea plants regener-
ated from Hyg-resistant calli
A. Explants with buds; B. Cluster buds; C. Transgenic
Arachis hypogaea plants in culture medium; D.
Transgenic Arachis hypogaea plants in pots
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bp左右的片断, 与SHBs的大小一致, 而阴性对
照则没有相应条带(图3), 从而初步证明SHBs基
因已经整合到花生基因组中。
用HRP标记质粒的PCR产物作为探针, 与
抗性苗的总DNA进行Southern杂交, 经化学发
光检测, 其结果在相应位置得到杂交斑点。进
一步证明目的基因已经整合到花生的基因组当
中(图4为转膜之前的总DNA电泳图和杂交后
X光胶片检测结果)。
2.4 ELISA检测
转基因植株的新鲜叶片的粗蛋白提取液经
过450/630 nm双波长检测, ELISA结果为阳性,
约含2.41 mg.g-1鲜重的SHBs, 占总可溶性蛋白
的0.033%; 而未经转化的对照组检测结果则为
阴性。初步证明了乙肝表面抗原在花生中能
够表达并且表达的蛋白具有免疫原性(图 5)。
3 讨论
HBsAg根据其抗原决定簇的不同可以分
为8种亚型和2种混合亚型, 各亚型的地理分布
不同, adr亚型主要分布在亚洲及太平洋地区, 在
我国的主要是adr亚型, 而目前国内外研究和使
用的疫苗则主要是adw亚型, 故而本实验中研
究的adr亚型基因对我国乙肝防治有很大的实
用价值。
Mason等(1992)的研究表明, 通过饲喂表达
外源抗原的植物同样能使小鼠产生相同于注射
的免疫应激, 提示了基于基因工程的新一代疫苗
将不再需要通过针注接种, 而是口服美味可口的
新鲜水果就可以达到获得免疫的效果。水果
口服疫苗因其良好的现实意义和经济前景而成
为研究者们关注的热点, 也取得了很大的进展,
但抗原蛋白在植物中的表达量偏低成了现阶段
阻碍口服疫苗市场化的最大障碍。于是研究
者们通过不断改用更强的启动子、增强子或
使用调控序列等表达策略以提高抗原的表达量,
例如Mason等(1992)就成功的通过将CaMV35S
图 3 转基因花生植株的总DNA的PCR凝胶电泳
鉴定
1. 阴性对照; 2~3. 转基因花生植株的总DNA的PCR
扩增产物
Fig. 3 PCR examination of transgenic plants
M. TIANWEI Marker Ⅲ; 1. Negative control; 2-3.
PCR-amplified DNA fragment of HBsAg in transgenic
plants
图 4 转基因植株的总DNA的凝胶电泳(A)及其 Southern杂交分析(B)
1~4. 转基因植株总DNA的凝胶电泳; 5~8. 转基因植株总DNA的 Southern杂交印迹分析
Fig. 4 The agarose gel electrophoresis (A) and Southern blot examination (B) of the transgene in transgenic plants
M. lDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; 1-4. Gel electrophoresis of transgenic plant’s genomic DNA; 5-8. South-
ern-blot analysis of transgenic plants
6692006 朱剑光 等: 乙型肝炎表面抗原基因转化花生及其表达
启动子连接烟草刻蚀病毒5末端重复序列而使
乙肝抗原在烟草中的表达量提高了 11倍。另
外, 选择高蛋白积累能力的载体反应器来表达抗
原也是加速口服疫苗市场化的一种手段, 本文选
择积累蛋白能力较强的花生来表达乙肝抗原, 所
获得的转基因花生的叶片中乙肝抗原的含量比
文献报道在马铃薯(Shulga et al., 2004)和烟草
(Sunil Kumar et al., 2003)中表达时都要高, 而且
经ELISA检测具有免疫原性, 进一步的研究则
有待使用HPLC等更精密的仪器对转基因植株
进行表达部位和表达量的精确测定。
花生属于豆科植物, 分化再生相对而言比
较困难。本文中通过用不同激素和不同浓度
搭配成功的建立了一套花生分化再生体系和基
于潮霉素压力的筛选体系。有文献报道在 5
mg.L-16-BA+1 mg.L-1NAA下丛生芽分化率最
图 5 转基因花生中HBsAg蛋白的ELISA分析
1. 空白; 2. 阴性对照; 3. 阳性对照; 4. 阴性对照植株;
5. 转基因植株; ABS. 吸收值
Fig. 5 ELISA detection of HBsAg proteins in
transgenic plants
1. Blank; 2. Negative control; 3. Positive control; 4.
Negative control plants; 5. Transgenic plants; ABS.
Absorption
高, 每个外植体分化 1~3个。本实验的结果表
明提高6-BA浓度至10 mg.L-1时, 平均每个外
植体可分化3.72个丛生芽, 但长期高浓度6-BA
下的外植体容易分化过多的小芽却不伸长, 形成
草甸状小芽点, 故而在侵染后的共培养和脱菌培
养时应该使用高浓度的(10 mg.L-1)6-BA, 而在分
化培养时使用 5 mg.L-1的 6-BA较为合适。
参考文献
王关林, 方宏筠 (2002). 植物基因工程(第 2版). (北京:
科学出版社). pp. 795-798.
张儒, 尉亚辉, 刘科, 刘蕾, 朱剑光, 郭芝光 (2005). 乙
肝表面抗原基因植物表达载体的构建. 西北大学学报
(自然科学网络版) 30, 142-142.
Mason, H.S., Lam, D.M.K., and Arntzen, C.J.
(1992). Expression of hepatitis B surface antigen in
transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11745
-11749.
Richter, L.J., Thanavala, Y., and Arntzen, G.J.
(2000). Production of hepatitis B surface antigen in
transgenic plants for oral immunization. Nat .
Biotechnol. 18, 1167-1171.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989).
Molecular Cloning, 2nd. (Gold Spring Harbor: Cold
Spring Harbor Laboratory Press), pp. 474-490.
Shulga, N.Y., Rukavtsova, E.B., Krymsky, M.A.,
Borisova, V.N., Melnikov, V.A., Bykov, V.A., and
Buryanov, Y.I. (2004). Expression and character-
ization of hepatitis B surface antigen in transgenic
potato plants. Biochemistry (Moscow) 69, 1158-
1164.
Sunil Kumar, G.B., Ganapathi, T.R., Revathi, C.
J., Prasad, K.S.N., and Bapat, V.A. (2003). Ex-
pression of hepatitis B surface antigen in tobacco
cell suspension cultures. Protein Expr. Purif. 32,
10-17.
(责任编辑: 孙冬花)