全 文 ：植物学通报 2006, 23 (4): 389~394
Chinese Bulletin of Botany
收稿日期: 2006-03-16; 接受日期: 2006-04-26
基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目(G2000046806)和中国科学院知识创新方向性项目(KSCX2-SW-117)
* 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: xmjing@ibcas.ac.cn.
†共同第一作者。These authors contributed equally to this paper.
.技术与方法.
高纯度大豆种子线粒体的分离
景新明1*† 尹广昆鸟1,2†
(1中国科学院植物研究所 北京 100093) (2中国科学院研究生院 北京 100039)
摘要 利用不连续Percoll梯度分离得到高纯度的大豆(Glycine max)种子线粒体。线粒体制剂中没有检
测到胞液、过氧化物体和叶绿素的污染。线粒体的完整性达到97%以上, 在0~4 ℃下至少稳定2小时。
关键词 大豆种子, 高纯度线粒体, Percoll
Isolation of High Pure Mitochondria from Soybean Seeds
Xinming Jing 1*†, Guangkun Yin 1, 2†
(1 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)
(2 Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)
Abstract A procedure for isolating high pure mitochondria from soybean (Glycine max) seeds by
discontinuous Percoll density gradient centrifugation was established. The preparation contains
more than 97% mitochondria as intact organelles with no detectable cytosol, peroxisomes and chlo-
rophyll contamination. The mitochondria are stable at 0-4℃ for at least 2 hours.
Key words soybean seeds, high pure mitochondria, Percoll
呼吸代谢是生命过程的中心枢纽, 定位于
线粒体, 其主要功能是合成ATP和提供各种代
谢中间产物。植物线粒体蛋白质组的分析是
认识发生在线粒体中各种生理生化反应的重要
手段, 近年来受到很大的关注和迅速发展, 其中
以拟南芥线粒体的分析研究最系统和深入
(Millar et al., 2001, 2004)。目前植物线粒体蛋
白质组的大多数研究工作也是以这一模式植物
为材料做的。除拟南芥外, 目前只对单子叶禾
本科少数作物进行过分析(Heazlewood et al.,
2003)。以拟南芥为材料时, 大多是利用其培养
细胞或愈伤组织, 从这样的材料分离纯化线粒体
与从完整性植物组织分离有明显不同: 破碎再生
组织中的细胞壁很困难, 并且分化组织的线粒体
的密度比完整组织的低, 因而其移至梯度密度的
区域不同; 而禾本科植物是淀粉类种子植物。
油料类植物线粒体蛋白质组的分析还没有见到
报道。大豆是油料植物的典型代表, 在经济中
占有重要地位, 对其线粒体蛋白质组的分析在理
论和实践上都有重要意义, 而得到无污染高纯度
的线粒体是开展这一工作的前提。本文参考
Liang等的工作 (Liang et al., 1982, 1986, 1989), 融
合了新近的拟南芥等的研究成果(Millar et al.,
2001), 建立了适合于从油料种子大豆分离高纯
度线粒体的程序, 为大豆蛋白质组的研究创造了
良好的条件。
390 23(4)
1 材料与方法
1.1 供试材料
大豆种子是黑龙江省黑河农业科学院提供
的黑河13号, 发芽率为100%, 含水量为9.53%。
使用前种子贮藏在-20℃冰箱内。
1.2 种子萌发
将种子置于培养皿滤纸中, 加入10 mL蒸馏
水, 置于 22 ℃恒温培养箱, 黑暗中萌发。
1.3 线粒体的分离
所有的步骤在 4 ℃中操作, 参考 Liang等
(1982,1986,1989)和Millar等(2001)方法分离线粒
体。取萌发 2~3天大豆子叶 10 g, 加入 25 mL
研磨介质温和地进行研磨。研磨介质含 5 0
mmol.L-1的磷酸钾缓冲液(pH8.0)、0.3 mol.L-1
甘露醇、0.5%(W/V)BSA、0.5%(W/V)PVP-40
(polyvinyl pyrrolidone 40)、2.0 mmol.L-1 EGTA
和20 mmol.L-1半胱氨酸。匀浆用40 mm×40 mm
孔径尼龙布过滤。滤液于2 000 g离心10分钟,
取上清液于12 000 g离心15分钟。用含0.3 mol.
L-1甘露醇、10 mmol.L-1 TES-NaOH, pH7.5的
甘露醇洗涤介质悬浮沉淀, 再分别离心2 000 g
和12 000 g, 得到的沉淀再用1 mL甘露醇洗涤
介质悬浮。沉淀悬浮用“温和法”: 沉淀加入
悬浮介质后, 用一支扁平小毛笔从沉淀物一侧,
顺次将沉淀悬浮, 用自动移液管将带小块的悬浮
物沿管壁均匀慢慢流下, 重复多次, 使其成为均
匀悬浮物。悬浮液敷在不连续 Percoll梯度上
面。Percoll梯度从下而上由 3层不同浓度的
Percoll组成: 45%(V/V)、23%和18%, 三者的体
积比为 1 : 4 : 2。Percoll溶液含 10 mmol.L-1
TES-NaOH (pH7.5)、 0.3 mol.L-1甘露醇、1%
(W/V)BSA。梯度 40 000 g离心 45分钟。从
18%与23% Percoll的界面看, 23% Percoll中部
可观察到极浅黄色(可能是胡萝卜素)和乳白色
宽带, 为线粒体分布的主要区域。从梯度管底
部分管收集, 每管 1 mL。
1.4 NAD+-苹果酸脱氢酶活性的测定
NAD+-苹果酸脱氢酶活性参考Glatthaar等
(1974)用光谱法在340 nm监测NAD+。在1 mL
反应混合物中, 含50 mmol.L-1Na-甘氨酸(pH 10.0),
100 mmol.L-1 L-苹果酸(pH 7.0), 2.5 mmol.L-1
NAD+。反应由加入线粒体启动, 测定 340 nm
吸光值的变化。NADH的摩尔消光系数为
6.2×103。
1.5 细胞色素氧化酶活性测定
细胞色素氧化酶活性测定参考 Liang等
(1982)方法: 1 mL反应混合物中含0.1 mol.L-1磷
酸钾缓冲液(pH 7.0), 13 mmol.L-1还原性细胞色
素c和酶, 反应由加入线粒体启动, 于550 nm检
测吸收变化, 细胞色素c的摩尔消光序数为
1.35×104。
1.6 过氧化氢酶活性的测定
过氧化氢酶活性参考梁峥等(1994)用光谱
法在 240 nm测定H2O2的分解连续监测。在 1
mL反应混合物中, 含100 mmol.L-1磷酸钾缓冲
液(pH 7.0), 0.14 mmol.L-1 H2O2, 反应加入线粒
体启动。H2O2的摩尔消光系数为 3.6×10。
1.7 乙醇脱氢酶活性的测定
乙醇脱氢酶活性参考李振国(1999)用光谱
法在340 nm监测NAD+还原。在1 mL反应混
合物中, 含100 mmol.L-1 Tris-HCl (pH 8.0), 0.5
mmol.L-1 NAD+和酶, 反应由加入10 mL、95%
乙醇启动。
1.8 线粒体完整性和稳定性的测定
1 mL反应混合物中含50 mmol.L-1 Na-甘氨
酸 (pH 10.0)、0.4 mol.L-1蔗糖、100 mmol.L-1
L-苹果酸(pH 7.0), 2.5 mmol.L-1 NAD+, 于340 nm
测定光吸收变化。反应由加入苹果酸启动, 反
应达到稳定状态后, 加入50 mL、5%Triton-100,
连续监测 2小时。利用有Triton和无Triton存
在时苹果酸脱氢酶的活性差, 求出线粒体的完整
性。其计算公式为: 完整性% = 100×[(+Triton
MDH活性)-(-Triton MDH)] / (+Triton MDH活
性)。+Triton代表线粒体总活性; -Triton 代表
破碎线粒体活性。
3912006 景新明 等: 高纯度大豆种子线粒体的分离
1.9 线粒体对NADH氧化的检测
线粒体对NADH氧化的检测参考燕义唐
等(1989)方法用光谱法在340 nm检测NADH氧
化。1 mL反应混合物中, 含 0.3 mol.L-1蔗糖、
10 mmol.L-1磷酸钾缓冲液、50 mmol.L-1
KCl、5 mmol.L-1 MgCl2、10 mmol.L-1 Tris-
HCl (pH7.2)。先加入线粒体制剂, 加入NADH
启动反应, 在 340 nm检测吸光值的变化。
1.10 线粒体蛋白的分部分离
参考Millar等(2001)的方法, 取大约1 mg蛋
白的线粒体溶解在1 mL 20 mmol.L-1TES-NaOH,
pH7.5中, 反复冻溶多次后, 于20 000 g离心25
分钟。上清为线粒体可溶性蛋白; 沉淀为全膜
蛋白, 保留部分做进一步分析; 另一部分沉淀用
弱去垢剂溶解后, 置于冰浴中 20分钟, 然后
20 000 g离心20分钟, 沉淀为膜整合蛋白, 上清
为膜周边蛋白。
1.11 SDS-PAGE电泳
参考Laemmli(1970)的方法, 用Bio-Rad电泳
系统。浓缩胶为 4%, 分离胶为 12%。
1.12 蛋白测定
蛋白含量按照Bradford (1976)的方法测定,
以 BSA作为标准。
2 结果和讨论
2.1 不同萌发时期大豆子叶的线粒体蛋白
分别取萌发1~6天大豆子叶10 g, 按分离方
法取 12 000 g沉淀的线粒体制剂做单向 SDS-
PAGE电泳, 结果如图1所示: 第3天的子叶线
粒体蛋白丰富, 蛋白条带最多, 发芽 2天的次
之。上清液(可溶性蛋白)的电泳分析与线粒体
一致, 表明发芽2~3天可能是大豆子叶功能蛋白
最活跃时期。以后的实验均以萌发3天的子叶
为材料。
2.2 高纯度线粒体的分离
将10 g子叶12 000 g离心得到的线粒体铺
在Percoll液面上方进行离心分离, 由图2可见,
线粒体分布在梯度较宽的区域(第 15~30管)。
在线粒体分布区域没有乙醇脱氢酶(胞液标志
酶)和过氧化氢酶[过氧化物酶体(在油料种子称
为乙醛酸循环体)的标志酶]的活性。只有少量
的乙醛酸循环体集中在梯度底部, 这种情况和拟
南芥以及其他植物的情况明显不同(Millar et al.,
2001; Heazlewood et al., 2003)。由于线粒体和
过氧化物酶体沉淀系数很接近, 通常后者迁移速
度比线粒体略快一些, 二者的峰部分重叠, 较难
分开。在萌发 2~3天的大豆子叶中, 可能由于
乙醛酸循环体还未大量形成和发育不完全, 总量
较少, 比重较高, 故迁移比线粒体快得多。这
对获得高纯度线粒体是很有利的, 这也可能是油
料种子与其他种子的不同之处。当梯度离心
90分钟, 线粒体和乙醛酸循环体都迁移至底部
23%和 40% Percoll界面处, 与拟南芥相似
(Millaret al.,2001), 二者的活性峰部分重叠。乙
醛酸循环体迁移比线粒体体略快一些(图略)。
将第20~30管合并, 按1 : 4(V/V)与含0.25
mol.L-1蔗糖和1 mmol.L-1磷酸钾(pH7.5)缓冲
液混合, 于20 000 g离心30分钟。在离心管底
部可观察到少量白色云状物, 用吸管小心将上清
液除去, 保留底部0.5~1.0 mL, 轻轻摇动使其均
匀分散悬浮, 加入12 mL含0.25 mol.L-1蔗糖和
图 1 大豆子叶线粒体蛋白 SDS-PAGE电泳分析
图中 1~6分别代表萌发 1~6天。
Fig. 1 SDS-PAGE analysis of mitochondria of soy-
bean cotyledon mitochondria during germinating 1-6
days.
392 23(4)
1 mmol.L-1磷酸钾缓冲液(pH7.5), 再离心洗涤1
次。得到的沉淀为纯化的线粒体。再次测定
过氧化氢酶和乙醇脱氢酶活性, 未检测到乙醛酸
循环体和胞液污染。由于大豆子叶在严格黑
暗中萌发, 没有形成叶绿体, 所以避免了叶绿体
的污染。
将线粒体放置在0~4℃保温2小时, 其完整
性在97%以上, 利用细胞色素氧化酶作为线粒
体的标志酶测定完整性, 得到与图 3相同的结
果 。
NAD+-苹果酸脱氢酶(参与三羧酸循环)除
定位于线粒体内膜的外, 还分布在过氧化物酶体
(乙醛酸循环体, 参与穿梭系统)和叶肉细胞(参与
C4途径)。在分离纯化的线粒体中, 未检测到过
氧化氢酶, 表明不存在乙醛酸循环体污染; 制剂
在严格黑暗条件下发芽和研磨, 没有形成叶绿体
的条件, 也未观察到叶绿素的存在, 同时参加C4
途径的苹果酸脱氢酶的辅酶为NADP+, 因此测
到的也不是NADP+-苹果酸脱氢酶的活性。所
以不会误导产生不正确的结果。
获得的线粒体的细胞色素氧化酶活性, 能
被1 mmol.L-1 KCN抑制(图4), 同时能很好的氧
化NADH(图5)和苹果酸(图2, 图3)。上述结果
表明我们分离得到的线粒体存在良好的三羧酸
循环、电子传递的功能, 以及线粒体内膜是完
整的。
线粒体通常以细胞色素氧化酶为标志酶。
该酶要求以马心Ⅲ型细胞色素为底物, 且其试剂
为氧化型, 用时要将其变为还原型, 并要求A550/
图 2 大豆子叶线粒体Percoll梯度分离
Percoll梯度离心后, 从底部分管收集, 每管 1 mL, 分别测苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase ,MDH)的活
性、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrognase, ADH)的活性和过氧化氢酶(catalse, CAT)的活性
Fig. 2 Fraction number of soybean cotyledon mitochondria by Percoll gradient centrifugation
After centrifugation, the 30 fractions were collected from Percoll gradient (from bottom to top). And assay the
activity of malate dehydrogenase , alcohol dehydrognase and catalse.
图 3 线粒体的完整性和稳定性
Fig. 3 Intactness and stability of mitochondria
3932006 景新明 等: 高纯度大豆种子线粒体的分离
点和难点之一。
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图 4 线粒体细胞色素氧化酶活性
Fig. 4 Cytochrome oxidase activity of mitochondria
图 5 线粒体对NADH氧化
Fig. 5 NADH oxidition by mitochondria
图 6 线粒体蛋白的 SDS-PAGE电泳分析
A. 可溶性蛋白; B. 总膜蛋白; C. 膜整合蛋白; D. 膜
周边蛋白; M. 标准蛋白
Fig. 6 SDS-PAGE analysis of mitochondria protein
A. solution protein; B. total membrane protein; C. in-
tegral membrane protein; D. peripheral membrane
protein; M. Mark proteins
A560大于6, 目前尚需依赖进口, 价格较贵, 所以
存在诸多不便。本实验利用NAD+-苹果酸脱
氢酶作标志酶得到同样效果, 不存在这些不便,
同时增加了标记线粒体的手段。
2.3 线粒体的蛋白分析
将得到的高纯度线粒体按照线粒体蛋白的
分离方法分为可溶性蛋白、总膜蛋白、膜整
合蛋白和膜周边蛋白, 然后进行SDS-PAGE单
向电泳分析, 结果如图6所示: 可溶性蛋白含量
和总膜蛋白的含量都很丰富。线粒体含有发
达的膜系统, 含有很多参与生理生化反应的膜蛋
白与基质可溶性蛋白。膜整合蛋白和膜周边
蛋白的条带颜色很淡, 可能是因为用弱去垢剂不
容易将膜整合蛋白和膜周边蛋白分开, 而且很容
易使其丢失。如何更好地分离膜整合蛋白和
膜周边蛋白目前仍是研究线粒体蛋白质组的热
394 23(4)
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全国系统与进化植物学研讨会暨第九届
系统与进化植物学青年研讨会
为加强国内植物进化研究领域的交流与合作, 推动和加速我国植物系统学和植物进化生物学的发展,
促进该领域人才成长, 中国植物学会植物系统与进化专业委员会定于2006年8月20~23日在陕西省西安
市西北大学举办“全国系统与进化植物学研讨会”, 同时召开第九届系统与进化植物学青年研讨会。本
次会议将对植物系统学和植物进化研究领域的研究成果、进展动态、发展方向等进行研讨和交流, 会
议将邀请国内外知名专家做专题报告。会议的主要议题包括植物分类和区系、植物系统发育重建、物
种形成和分子生物地理学、分子系统学和分子进化、植物繁殖生物学和交配系统进化以及植物保护遗
传学等。会议期间还将特邀美国、奥地利和瑞士等国的著名专家做专题讲座。
一、主办单位和承办单位
本次会议由中国植物学会主办, 系统与进化植物学国家重点实验室(中国科学院植物研究所)和西北
大学联合承办。
二、日程安排
2006年 8月 19日 报到
8月 20～21日 第九届系统与进化植物学青年研讨会
8月 22～23日 系统与进化植物学研讨会
三、联系人和联系方式
1. 联系人: 张志耘(中国科学院植物研究所)
电话: 010-62836083 传真: 010-62590843 E-mail: zhangzy@ibcas.ac.cn
通讯地址: 北京香山南辛村20号 邮编: 100093
2. 联系人: 魏朔南 (西北大学)
电话: 13186153602 传真: 029-88303572 E-mail: wsn0505@nwu.edu.cn
通讯地址: 陕西省西安市太白路229号西北大学生命科学学院 邮编: 710069