全 文 ：7 一；
热带亚热带植物学报 1997，5(4)：32—38
Journal of Trot，icat and Subtropical Botany
大豆萌发过程的活性氧代谢
三 罗广华 ，阜 配 ·—_—————一 —。——————一 、 ， 一 ⋯
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摘要 本文研究了大豆萌发过程中活性氧的产生与清除，并探讨了光因子在活性氧代谢中的作用．大
豆呼吸强度、Of产生速率及Hp：水平都在吸水后第四天达到高峰，然后下降，三者的变化趋势同
步。SOD、POD及APX的活性随萌发过程而逐渐增强，最后趋于平稳．SOD同工酶谱中分别于萌
发的第二、第三天各出现一条新的酶带。CAT在萌发的初期猛增50倍左右，之后趋于稳定．在三种
清除H2O2的酶(CAT．POD、APX)中，CAT清除H2O2的能力远远高于POD 与APX，CAT可能
是大豆萌发过程中最主要的H2O 清除酶。光萌发时呼吸强度低于暗中萌发，但 O 产生速率与H O
水平高于暗萌发，光萌发时O 的产生占总耗氧量的1．1—2 7％，而暗中萌发为0．9—1．3％。光条件下
SOD、APx活性明显高于暗中萌发，而POD与CAT则在光和暗条件下相差不大。
关键词大豆种子；活性氧；超氧物歧化酶；过氧化氢酶 』f{淞
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ACTIVE oXYGEN METABoLISM IN SoYBEAN
DURING GERMINATIoN
Fu Aigen Wang
(Soulh China lnsrilule of Bol~y
Aiguo Luo Guanghua
Academia Sinica，Guangzhou 510650)
Abstract The generation of active oxygen and the activities of active oxygen scavenging
enzymes as well as the efect of light on active oxygen metabolism were studied in soybean
during germination．The O2 uptake，the rate of Of production，and the level of H 2 in
imbibed seeds all increased at the beginning of germination，but all decreased after 4 days
of imbibition．Gradual jncreases in activities of superoxide dismutase fsOD)，peroxidase
(POD)and ascorbate peroxidase(APx)were observed at the early stage of germination，
then the activities of SOD，POD．and APX tended to be in a certain 1eve1 with 1ittle
alteration．A new band of SOD isoenzyme presented respectively on the 2nd and 3rd day
of seed imbibition．There wa about a 50-fold increase in catalase(CAT)activity at the
early stage of germination，and then turned stable．Among the thre H2O2-scavenging
enzymes(CAT，POD and APX)，the capacity of CAT for scavenging H 2 was much
higher than those 0f POD and APX．So jt seems that CAT is the most important H，O，
车文为国家自然科学基叠资助项目
1996-09—09收稿；1997—07-08修回
缩写：O卜 超氧物阴离子自由基；soD一 超氧物歧化酶；POD- 过氧化物酶；AP 抗坏血酸过氧化物酶
cAT一 过氧化氢酶
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第4期 傅爱根等：大豆萌发过程的活性氧代谢 33
scavenging enzyme during germination．Although the O2 uptake of seeds germinating under
light was 1ower than that in the dark，the rate of Of production and the H 2 1evel under
light were higher than those in the dark．The ratio of O production to tota1 01 uptake
was 1．1—2．7％ iU seeds germihated under 1ight．while this rario was 0．9一l 3％ iU the dark．
The activities 0f SOD and APX under light were higher than those in the dark，but the
activities of POD and CAT had no distinct diference under light and dark．
Key words Soybean seed； Active oxygen； Superoxide dismutase； Catalase
植物衰老过程中的生理现象以及逆境胁迫对植物的伤害作用都与活性氧的产生和清除能力密
切相关，因此， 当前植物活性氧代谢的研究大都与植物逆境生理或植物衰老生理联系在一
起【l一 活性氧是植物氧代谢过程中的必然中间产物，它对于植物生命也不是绝对有害或无用的
产物 植物的很多生理过程需要恬性氧的参与，对于植物细胞的某些过程来说，活性氧是十分
重要的甚至是必不可少的。现有不少资料表明【I叫：活性氧在信息传导、杀灭病原体、细胞壁形
成、乙烯合成、启动基因表达、过剩能量耗散等生理过程皆有重要的生理作用。
种子萌发是一个十分复杂的生理过程。种子从吸水开始，细胞内部便发生一系列生理生化变
化，如细胞器、大分子及酶系统的活化或重新合成，贮藏物质的转化与转移，植物激素的合成与活化
等。这其中的很多生理过程已被人们广泛研究，但在种子萌发过程中的活性氧代谢方面，人们关
注很少，鲜见报道。种子萌发时物质和能量代谢旺盛，呼吸作用也必十分强烈。呼吸作用是植物
活性氧的来源之一，从理论上推测，种子萌发过程的活性氧代谢应该极为活跃。H2o2与种子萌发
有很大关系，H2O2处理可促进种子的萌发圈 过氧化氢酶与种子活力有一定相关性，有人以过氧
化氢酶活性作为种子活力的指标嘲。 1966年MajortTI提出了解除休眠的磷酸戊糖途径(PP途
径)假说，认为PP途径的增强是打破休眠的关键，凡能促进 PP途径的控速步骤(NADPH的再
氧化)的因子，均有打破休眠、促进萌发的作用。硫脲、NO／、羟胺等对种子萌发有促进作用，
Hendricks和Taylorson~1认为这些因子能不可逆地抑制CAT酶活性，故H2o2的分解只有通过
POD以及吡啶核苷酸苯醌还原酶(PNQR)与醌的氧化相连接，以促进NADPH的再氧化，从而激
活PP途径。这种假说必须有二个前提：1．种子萌发时有大量的H102产生；2．H2o2主要由CAT分解。
本文中，我们测量了种子萌发时of和产生速率与H2O2水乎， 以及活性氧清除酶SOD、
CAT、POD、APX的活性变化，以探讨种子萌发过程中活性氧的生理作用机制及种子萌发过
程中活性氧代谢的模式。
1材料与方法
市售大豆(Gtycine max)种子于温室中沙基培养，一组为暗生长，一组光照培养(光强为
24#tool m。s )。分别取吸水萌发 l、2、3、4、5、6 d后的幼苗为材料，去种皮待用
o，吸收 瓦氏呼吸计法，以／~moi min g FW为单位。
o 产生速率 王爱国方法19]，l g左右样品用 1 m1磷酸缓冲液(pH7．8，50 mmol／L)匀
浆，O．1 m1 10 mmol／L NHHC1反应20 min，加 l7％对氨基苯磺酸l m1和7 mmol『L ·萘
胺 l m1显色l min，以2 m1乙醚萃取一次，取水相，再用3 m1正丁醇萃取，将正丁醇相于
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530 nm 比色，用 NaNO2作标准曲线，从标准曲线上求出O ‘浓度，再换算成 O 的产生速
率，单位为 nmol min g FW。
H202含量 TiC14法fl0】=l g组织用 2 ml冷丙酮提取，取 1 m1冷丙酮液加 0 1 ml 20％
TiCI4的浓HCI液反应 l min，用 0．2 ml 17mol／L氨水沉淀，沉淀用丙酮悬浮洗涤 5次，最后
溶于3 ml 2 mol／L的H 04中，测A410，标准曲线用H202重复，空白用冷丙酮重复。
SOD活性测定 NBT法l”，以抑制NBT光化还原 50％为一个酶单位。
CAT活性测定 l ml反应液含：磷酸缓冲液 (pH7．8)50 mmol／L和 H，0，5 mmol／L．
加人适量酶液反应5 min，用 2 2 mol／L H2SO4终止反应。用TiC14法测定剩余的H2O2，
用 mol H2O2 rain g。FW 表示 CAT的活性。
POD活性测定 愈刨术酚法，3 反应液含：磷酸缓冲液(pH6 0)0．2 mol／L、H，O
5 mmol／L、愈刨木酚 5 mmol／L，加适量酶液反应 5 min，测A4∞【E=26．6 m／vl cIn )将Am
换算成浓度，最后以 m01 H，O，rain g。FW 表示POD活性。
APX活性测定 3 ml反应液含磷酸缓冲液50 mmol／L(pH7舟)、抗坏血酸0．05 mmol／L
02 0．1 mmol／L及 EDTA 0．1 mmol／L，加人适量酶液测 A265(E=l5 mM ctn-~)以
t*mol／L H202 min g FW 表示 APX活性
2 实验结果
2．1大豆萌发过程中活性氧的产生
2．1．1呼吸强度的变化
种子在萌发时发生的一系列生理生化变化大都是需能反应，因此种子萌发的开始都表现为
呼吸代谢的加强，大豆种子也不例外(图1)。随着萌发的推进，种子呼吸强度逐渐增强，第4
天达到高峰，随后由于贮藏物质消耗以及生理变化剧烈程度的下降，呼吸速率有所降低。
从图l中可见，暗萌发的呼吸速率高于光下萌发，这可能是因为暗中生长更旺盛，光因子有
抑制幼苗生长的作用。
2 1．2 O，。的产生速率
Of是O2的单电子还原产物，它是生物体内最初产生的活性氧。 从图2可知，大豆在萌发
开始的 1—4 d内，O 产生速率逐渐上升，在第 4天达到高峰，之后稍有降低，这种变化趋势
善
著
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圈 I大豆萌发过程中的呼吸速率
Fig．1 O2 uptake in soybean seeds
during germination
O l 2 3 4 5 6
天 Day
图2 大豆萌发过程fl勺O 产生速率
Fig．2 Thc rate of O2"generation _n soybean
seeds during germination
O 8 6 4 2 0
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与呼吸速率的变化相似。 罗广华认为O ‘的产生与O 吸收呈密切的正相关l ．本实验进一步证
实了这一结论。 虽然大豆在暗中萌发的呼吸强度高于光下萌发的呼吸强度，但暗中萌发时Oi
产生速率却低于光照下种子萌发时的O，一产生速率。从O，。产生速率(图2)和呼吸速率(图1)可
见， 光照 下种子萌 发时 02-的产 生 占总耗 氧量 比例 的 1．1—2 7％， 而 暗 中萌发 则为
0．9—1 3％。 这说明光在大豆萌发时促进了02-的产生。
2．1．3 H，O，水平的变化
植物细胞内的H’O，主要由O 歧化而形成。 图3展示大豆种子萌发过程中H202水平的变
化。 可以看出，萌发过程大豆H O 水平的变化趋势与O，吸收、O2。的产生相一致，都是先上
升后下降，三者之间密切相关。光下种子萌发的H O 水平高于暗萌发种子的H2O2水平，光对
萌发时大豆的H，O，积累有一定的促进作用。PattersonI 测定了很多植物叶片中H2O2水平是在
0 1一O 6#tool g-1Fw之间，本实验大豆萌发时的HO，水平明显高于这个数值，可见，萌发时
大豆的 H ，积累是较强的。
2．2大豆萌发过程中活性氧清除酶的变化
2．2．1超氧物歧化酶
sOD是生物体内专一清除O，。的酶，它在活性氧清除系统中占有十分重要的位置。 从图4
中可以看出，在暗中萌发的初期，大豆SOD的活性逐渐增强，活性上升约2倍之后变化不太
明显，基本稳定在一个水平上、光下萌发的大豆SOD活性明显高于暗中葫发的SOD活性。
图 5为萌发过程中大豆SOD同工酶谱(分为a、b、C三组)。在整个萌发过程中，b组酶没
5
一
天 Day
图3 大豆萌发过程中的H 2含量
Fig．3 H202 content in soybean seeds
dunng germination
天 Day
囤4 大豆萌发过程的SOD活性变化
Fig 4 SOD activity in soybean seeds
during germination
A Day) B
图5 大豆在光(A)和暗f B】前发J~fJ．-l，SOD同工晰酌】
Fig．5 SOD zymogram in soybean seeds during germination under lent(A) nd in darkness(B)
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有太大变化，表现十分稳定，a组酶在萌发的第3天出现一条迁移率最大的新SOD酶带，随着
萌发过程的推进，这一新SOD酶带的活性越来越强 c组酶在萌发的第 2天就出现一条新的
sOD酶带 光下萌发与暗中萌发的SOD酶谱的变化趋势相同，光下SOD酶谱与暗中SOD
酶谱差异在于c组酶；光下的酶带清晰、明显，而暗中萌发的带模糊不清
2 2．2过氧化氢酶 过氧化物酶及抗坏血酸过氧化物酶
过氧化氢酶是植物体内以H，O，为底物的酶，分解 H，O2为 O 和水，它对细胞内的H2O2分
解有重要作用 从图6可知，大豆种子吸水后第 l天的CAT活性很低，但之后迅猛上升，吸
水萌发的第 3天的CAT活性是萌发第 l天的50倍以上，猛增之后，其变化出现平台效应，保
持在一个比较稳定的水平上。我们研究了萌发过程中的CAT酶谱，但没有发现cAT类型的变
化(资料略)。 光下发育与暗中发育的大豆在 CAT活性变化上没有太大的差异，光对CAT活性
影响不大
过氧化物酶也是植物体内H，O，的清除酶，它和CAT不同的是需要 H，O，之外的另一个底
物。在萌发的初期，大豆POD活性逐渐增加，在活性上升2．5倍以后变化趋于缓慢，保持一个
相对稳定的水平 在萌发初期，光下发育的POD略高，但后来则与暗中生长时的POD相差无儿。
Ⅲ
蛙
嶷
天 Day
固6 大豆萌发过程r 时CAT POD和APX恬性变化
Fig．6 CAT．POD aad APX activities in soybean seeds during germination
抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血酸为底物清除H O2的酶，在叶绿体中，人们没有发现过氧
化氢酶的存在。 Nakano和 AsadaI 『认为 APX是叶绿体中清除H，0 的关键酶， 它在保护叶
绿体免受活性氧伤害的作用中有十分重要的意义，因此它受到越来越多的关注。 在萌发过程的
开始，光下萌发和暗中萌发的大豆 APX活性都呈现上升趋势，但后来暗中萌发的大豆 APX活
性不再上升，而光下萌发大豆的APX持续增长，并于第4天出现最高的水平。 可见，光对大
豆萌发过程中的APX活性有明显的促进作用。
3 讨论
在植物细胞内，线粒体的呼吸电子传递链的电子漏以及叶绿体光合电子传递链的电子漏是
超氧物阴离子自由基(o0的主要来源。在黑暗中萌发的大豆叶绿体发育受阻，H 2和O2。的形
成主要来自于线粒体的电子漏。 黑暗萌发时O 的产生占总 O2吸收的 0．9—1．3％．这跟
Puntanlo的实验结果相一致 。但这并不是植物体内真正的O 产生速率，植物细胞中O 产生
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部位的附近，一般都有SOD的分布，O，。一旦形成，SOD能很快将它歧化成 H 2。 因此实验
中得到的 O 产生速率只是细胞内O，。产生速率与O ’清除速率的差值，真正的O 速率肯定高
于这个数值 NohlI 认为约有 2O％左右的O 可逃脱SOD的歧化作用。
光下萌发的大豆呼吸强度低于暗中萌发，可能是光因子抑制了大豆的生长速度。从外观上
看，暗中萌发的大豆生长速度高于光下萌发，呼吸作用更强烈一些。但光下萌发的大豆02产
生速率及H，O，水平皆高于暗中萌发的。光促进了植物活性氧的产生，其原因有三个方面：1．加
大呼吸作用过程中电子漏的比率，加剧线粒体中Oi的产生：2．促进大豆叶绿体的发育，使活
性氧的形成多一个重要来源；3 促进细胞中过氧化物体、乙醛酸循环体、某些酶反应等 (除线
粒体和叶绿体)的活性氧的产生。其中第二方面的作用可能是最重要的。
植物体内SOD活性与O 产生速率有很大的相关性。大豆萌发过程中，在 O ’产生速率及
H，O，水平上升的同时，SOD活性也逐渐增加。SOD活性受到 O2-产生速率的诱导，这种内源
SOD活性的上升反映了植物自身的一种保护机制：O 吸收的猛增带来了o 上升，o 水平的上
升诱导了SOD活性上升，而这种增加的SOD活性使O2-限制在一定水平内，使O 一不至对植物
本身造成伤害。 一般认为O2-是在基因表达的水平上影响了SOD活性，那么这里存在着两种情
况：1．使原有的基因表达得到加强；2．启动新的基因表达。 从大豆萌发过程的SOD酶谱来
看，O，。可能既促进了新的SOD基因表达，又使原有基因的表达得到加强。光下萌发与暗中萌
发的大豆SOD同工酶谱的差异在于c组酶。罗广华认为这组酶与叶绿体的发育密切相关lq，本
文支持这一观点
H 2由sOD歧化02而形成。H 的清除则由CAT、POD、APX等承担 从三种酶清
除H2O2的能力来看，CAT清除H2O2的能力远远高于POD和APX，可以说，在整个萌发期
问，大豆H O2的清除工作主要由CAT承担。但 H 2在细胞中的主要来源为线粒体和叶绿
体，它们不含CAT或CAT酶活性很小。那么，CAT是怎样清除H2O 2的呢?NohlI1 51认为
H，O，对生物膜有很好的透性，它可以十分方便地穿过线粒体膜及叶绿体膜而进入细胞质，从而
被CAT清除。Salinl 7l认为叶绿体中的各种酶对H2O2十分敏感，若H 2不及时被清除则会损
伤叶绿体，APx是叶绿体中清除H，O 的关键酶。但APx在萌发过程中活性远远低于CAT，
可以说，萌发时APX对细胞中整个H’0，的清除作用不大。过氧化物酶在大豆萌发中活性也不
高，罗广华证明l_61：萌发期闯，大豆过氧化物酶主要存在于种皮中，这种组织特异性定位的生
理意义还有待进一步探讨
打破休眠的PP途径假说至今还没有直接的证据。 我们的实验说明：相对于植物的其它部
位，植物在萌发过程中的 HD，水平是相当高的，而且有迹象表明CAT是 H2o2的主要清除
酶。如果那些抑制CAT活性的物质抑制过氧化物酶的活性，那么在 CAT受抑制时 H 2的分
解可能要由过氧化物酶承担，从而促进NADPH的再氧化，推动PP途径的进行 在一定程度
上，本文支持休眠解除的PP途径假说
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