全 文 ：植物生理学通讯 第 40卷 第 5期，2004年 10月 595
微量大豆种子基因组DNA 的快速制备
徐景升* 姚伟 余爱丽 张木清 陈如凯
福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室，福州 350002
Rapid Extraction of Genomic DNA from Minim Soybean Seed
XU Jing-Sheng*, YAO Wei, YU Ai-Li, ZHANG Mu-Qing, CHEN Ru-Kai
Key Laboratory of Eco-physiology & Genetics Improvement for Sugarcane of Ministry of Agriculture, Fujian Agricultural and
Forestry University, Fuzhou 350002
提要 用改良的 CTAB 法，从微量大豆种子样品中快速提取了基因组 DNA，并从大豆基因组中扩增到了大豆蛋白酶抑
制剂基因。
关键词 CTAB；PCR；模板；大豆种子
收稿 2003-12-08 修定 　 2004-04-08
资助 福建省重大国际合作项目(2001I002)和“863”高新
技术发展计划课题(2001AA241191)。
* E-mail:xjs5211@sina.com.cn,Tel:0591-3768242
P C R 技术具有操作简便、灵敏度高的特点，
在分子生物学领域，尤其是分子检测中已得到了
广泛的应用。但是植物基因组 DNA 提取过程耗时
费力，影响了后续工作。本文针对大豆种子体积
小和坚硬的特点，根据 P C R 反应的要求，用改
良的 CTAB 法[1,2]，实现了微量大豆种子基因组
D N A 的快速提取。
材料与方法
1 材料
大豆(Glycine max)种子由吉林农业科学院提
供。实验中所用的Taq酶(Taq plus I DNA 聚合
酶)和引物均购自上海生物工程公司。
2 方法
2.1 基因组DNA制备 大豆种子去种皮后切取1/8
(约为20 mg)放入 1.5 mL离心管中，加入250 mL
50℃预热提取液(200 mmol·L-1 pH 8.0的Tris-HCl、
200 mmol·L-1 NaCl、25 mmol·L-1 EDTA、0.5%
SDS)，混合均匀，置于 50℃水浴中 10 min；加
入蛋白酶 K，终浓度为 100 mg ·L-1，混合均匀，
用自制研杵(取 1 mL 枪头，将尖端切去 2 mm，
用酒精灯稍微灼烧，使其熔化并凝固成圆端，枪
头尖端切去多少以灼烧后所形成的圆端能否与1.5
m L 离心管底部良好吻合为准，经试验以切去 2
mm 为宜)充分研磨，继续放在水浴中15 min，期
间颠倒混合数次。加入 250 mL CTAB 缓冲液[2%
CTAB、100 mmol·L-1 pH 8.0 的 Tris-HCl、20
mmol·L-1 EDTA、1.4 mol·L-1 NaCl、1% 聚乙烯吡
咯烷酮(PVP，40 kD)]。用等体积的酚、氯仿、
异戊醇混合液(体积比 25∶24∶1)抽提后，以
13 000×g 离心 5 min；并用等体积的氯仿抽提，
再以 13 000×g 离心 5 min；取上清液，加入等
体积的异丙醇，混匀后，于室温下静置 3 min，
以 13 000×g 离心 5 min。DNA 沉淀用 70% 乙醇
充分洗涤 2次，晾干，溶于 50 mL去离子水中，
于 -20℃下储存备用。
2.2 PCR扩增 扩增大豆蛋白酶抑制剂基因ScII
时，PCR 引物为：ScII1，5 ＇ATG GAA CTG
AAC CTC TTC AA 3 ＇；ScII2，5 ＇CTA GTC
ATC ATC TTC ATC AC 3＇。PCR产物为252 bp。
扩增抗草甘膦基因EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-
3-phosphate synthase，EPSPS，磷酸烯醇式丙酮
酰莽草酸合成酶)时，PC R 引物为：EP S P S 1，
5 ＇CCT CAA CGT GCT GAT GAA CC 3 ＇；
EPSPS2，5 ＇ GCG AGA ATC GGA TAT TCG
TC 3＇，PCR 产物为 201 bp。两个 PCR 反应使
用同一体系。反应总体积为 2 5 mL，组分为：
1×PCR 缓冲液、2 mmol·L-1 MgCl2、0.2 mmol·L-1
dNTPs、1 mL 模板 DNA、2.5 U Taq 酶，引物
浓度为0.25 mmol·L-1。PCR 反应程序为：95℃变
性 5 min；94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃退火 1
min，39 个循环；72℃延伸 10 min。扩增产物
技术与方法Techniques and Methods
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分别做酶切和测序分析。
结果与讨论
从20 mg的大豆种子中一般可以提取到0.3~
0.7 mg 的大豆基因组 DNA，DNA 得率随着加入蛋
白酶K前水浴时间的减少而逐渐降低(图1)。当水
浴时间低于10 min时，大豆种子块研磨困难，所
得 DNA 的浓度在 2 ng·mL-1 左右，PCR 结果不稳
定。以本文方法制备的大豆种子基因组 DNA 为模
板，我们扩增到了大豆蛋白酶抑制剂基因ScII的
252 bp片段(图2)。经HaeIII酶切鉴定，得到180
和72 bp 2个片段(图3)。
在大豆种子DNA 提取过程中，由于大豆种子
坚硬，水浴温度和时间常影响其研磨效果，从而
影响 D N A 的得率和质量。温度低，水浴时间延
长，D N A 降解的机会增加；温度高，蛋白酶 K
容易失活，D N A 会受到内源核酸酶的攻击。所
以，在加入蛋白酶 K 之前，水浴温度和时间以大
豆种子小块软化，可充分研碎为准。选择50℃的
水浴温度，可保证蛋白酶 K 在短时间内发挥作
用。蛋白酶 K浓度达到 100 mL·L-1，可确保其功
能发挥。研磨是关键，研磨不充分，D N A 得率
明显降低。用自制的 1 mL 枪头研杵，其尖端
与 1.5 mL的离心管底部吻合良好，可保证研磨充
分。同时，研杵一次性使用，样品间无交叉污
染，方便快捷。从我们的实验结果可以看出，在
保证大豆种子块可以充分研磨的前提下，水浴时
间对 PCR 模板质量影响不大，4 个处理的模板都
可得到良好的扩增。
我们使用本文的方法，从进口大豆中扩增出
了EPSPS 基因 201 bp 片段(图 4)，测序结果证明
是该基因的部分片段。此方法适于转基因大豆种
子快速检测，每人每天可以处理 200 份样品。
参考文献
1 田清震,盖钧镒,喻德跃等.大豆 DNA 扩增片段长度多态性
(AFLP)研究.大豆科学,2000,19(3):210~217
2 Tao Z, Cai X-F, Yang S-L et al. Detection of exogenous
genes in genetically modified plants with multiplex poly-
merase chain reaction. Plant Mol Biol Rep,2000,19:289~298
图2 大豆蛋白酶抑制剂基因(ScII)PCR扩增结果
M:梯级分子量标准(1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、
0.3 kb); 1~4:加入蛋白酶 K之前 50℃水浴时间 30、20、15、
10 min；5:无模板的空白对照。
图4 EPSPS基因扩增结果
M：梯级分子量标准(1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、
0.4、0.3、0.2 kb); 1：EPSPS 基因 201 bp PCR 产物。
图 1 大豆基因组DNA提取结果
对照:λ DNA, 50 ng·L-1; 1~4:加入蛋白酶K之前50℃水浴
时间 3 0、2 0、1 5、1 0 m i n。
图3 大豆蛋白酶抑制剂基因(ScII)252 bp 的
PCR产物经HaeIII酶切结果
M：梯级分子量标准(1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、
0.4、0.3、0.2 kb); 1：252 bp PCR 产物经 HaeIII 酶切结果。