全 文 ：第27卷 第1期
2015年1月
Vol. 27, No. 1
Jan., 2015
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2015)01-0099-08
DOI: 10.13376/j.cbls/2015015
收稿日期：2014-06-26； 修回日期：2014-08-13
基金项目：国家重点基础研究发展规划(“973”计划)
(2010CB126200)；农业部公益性(农业)行业项目(2014-
03030)；科技部十二五科技支撑项目(2012BAD19B01)；
国家自然科学基金项目(31371935)；上海市长三角科
技联合攻关项目(13395810100)
*通信作者：E-mail: zrzhu@zju.edu.cn
CRISPR/Cas系统及其在昆虫基因功能研究中的应用
张敏菁1，张春红1，孙学鹏2，李红叶2，祝增荣1*
(1 浙江大学昆虫科学研究所，杭州 310029；2 浙江大学生物技术研究所，杭州 310029)
摘　要：近年来在众多细菌和古细菌中发现一类成簇的、有规律间隔的短回文重复序列 (clustered regularly
interspaced short palindromic repeats, CRISPR)结构家族，通过对其及相关基因 (CRISPR-associated genes, Cas
gene)的系统研究得知，它是生物体长期进化形成的获得性免疫系统，由 RNA介导，降解入侵病毒或者噬
菌体 DNA。众多研究者将 CRISPR/Cas系统改造成第三代人工核酸酶，用于靶向编辑基因组，目前已广泛
应用于人类细胞、小鼠、大鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫等。综述了此系统的基本结构、原理及
在昆虫上的应用、展望前景，为今后开展昆虫基因功能研究提供一定的技术参考。
关键词：CRISPR/Cas9系统；昆虫；基因组编辑技术；同源重组
中图分类号： Q789；Q819；Q96　 文献标志码：A
CRISPR/Cas: the emerging tool for insect genomic study
ZHANG Min-Jing1, ZHANG Chun-Hong1, SUN Xue-Peng2, LI Hong-Ye2, ZHU Zeng-Rong1*
(1 Institute of Entomology Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China;
2 Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)
Abstract: The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system was originally discov-
ered as acquired immunity system in numerous bacteria and archaea. Systematic analysis of CRISPR and its associ-
ated genes (CASs) revealed the crucial roles in defending external invasion of viruses and phages via RNA-
mediated DNA degrading. The natural CRISPR/Cas system has been remolded as the third generation artificial
nuclease, which is a powerful and promising tool for targeted genome editing. Currently, CRISPR/Cas-based
genome editing has been successfully applied in a increasing number of species, such as human, mice, rats,
zebrafish, bacteria, fruit flies, yeast and nematodes. In this paper, we reviewed the structural basis and mechanisms
of CRISPR/Cas system, and discussed the prospective application in insect genomics, to provide some technical
references for insect gene function study in the future.
Key words: CRISPR/Cas9; insect; genome editing; homologous recombination
随着越来越多昆虫物种全基因组测序的完
成，如黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)、赤拟谷
盗 (Tribolium castaneum)、家蚕 (Bombyx mori)、金
小蜂 (Nasonia)、豌豆蚜 (Acyrthosiphon pisum)、小
菜蛾 (Plutella xyllostella)等 [1-6]，昆虫学工作者们面
临的重大挑战就是如何从海量的基因组数据中获得
基因功能等有效的信息，而要实现这个目标的重要
工具就是基因组编辑 (genome editing)技术 [1]，因此，
在现代生物学研究中，掌握和运用基因组编辑技术
显得尤为重要。
近年来兴起的基因组编辑技术主要有锌指核
酸酶 (zinc-finger nucleases, ZFNs)[7-8]、转录激活因子
样效应因子核酸酶 (transcription activator like effector
生命科学 第27卷100
nucleases, TALENs) [9-11]，以及最近的一种新兴技
术——成簇的规律间隔的短回文重复序列和相关
Cas蛋白的 DNA 核酸内切酶系统 (CRISPR/Cas
system)[12-13] (表 1)。本文将着重介绍 CRISPR/Cas系
统的基本结构、作用机制、在昆虫中的应用及其与
前两者基因组编辑技术的比较。
锌指核酸酶 (ZFN)是第一代人工核酸内切酶，
由可特异性结合 DNA的锌指蛋白和非特异性的核
酸内切酶 Fok I融合而成，能够在多种生物体基因
组的特定位点造成双链缺口 (double-strand break,
DSB)，从而诱发细胞内修复机制产生突变体 [14]。
每个锌指蛋白结合域由大约 30个氨基酸组成，能
够特异性识别靶标序列上 3~4个碱基。锌指核酸酶
的靶标序列含有两个锌指蛋白结合位点，两个结合
位点之间的间隔序列是核酸内切酶 Fok I切割位点。
ZFNs中使用的无明显序列特异性的 Fok I是以天然
存在的有特定识别序列的 Fok I为基础，进行工程
化改造得到的。
2012年，第二代人工核酸内切酶转录激活因
子样效应因子核酸酶 (TALEN)被 Science评为十大
科学突破之一 [15]，它与锌指核酸酶原理相似，都能
精确修饰基因组。转录激活因子样效应因子 (TALEs)
最早在植物病原物黄单胞杆菌 (Xanthomonas)中被
发现 [9]，由 34个氨基酸的重复单元组成，每个单
元可以识别一个碱基，特异性通常由其第 12、13
位的两个氨基酸决定。人工改造 TALEs的氨基酸
序列和长度，可使之与各种效应元件，如转录活化
因子、转录抑制因子、转座酶、DNA等结合，从
而对基因组的结构进行改造。
1　CRISPR/Cas系统介绍
CRISPR/Cas系统最早于 1987年在大肠杆菌
K12中被发现，它是一段碱性磷酸酶基因附近的
串联间隔重复序列 [13]。2002年，Jansen等 [16]将其
正式命名为 clustered regularly interspaced short palin-
dromic repeats (CRISPR)。CRISPRdb是一个由巴黎
大学维护的专门收录 CRISPR信息的数据库，通过
分析发现，有 40%的细菌基因组或质粒中存在至
少一个 CRISPR基因座 [17-18]。不同物种间 CRISPR
位点数量、CRISPR中重复序列和间隔序列的数量
都有所不同 [16,19-20]。
1.1　CRISPR/Cas系统基本结构
CRISPR/Cas系统由 CRISPR序列及其位点附近
的一系列保守的相关基因 (CRISPR-associated genes,
Cas genes)组成。CRISPR由一系列短的高度保守的正
向重复序列 (repeats)与长度相似的间隔序列 (spacers)
间隔排列组成。Cas基因编码的蛋白质具有核酸相
关的功能域，可位点特异性切割DNA双链。CRISPR
和 Cas基因之间有一段作为启动子的 CRISPR前导
序列 (leader sequence)，可启动 CRISPR序列转录 [21]。
表1 TALEN、ZFN及CRISPR/Cas系统的比较
TALEN ZFN CRISPR/Cas
特异性靶向原理 蛋白质介导，每个TALE由34个 蛋白质介导，每个锌指蛋白结合 RNA介导，sgRNA (single strand
氨基酸的重复单元组成，每个 域由大约30个氨基酸组成，能够 RNA)上20个碱基的向导序列以
单元可以识别一个碱基，特异 特异性识别靶标序列上3~4个碱 及紧跟于靶序列后的PAM序列。
性通常由其第12、13位的两个 基。
氨基酸决定。
核酸内切酶 FOK I家族的非特异性核酸内 FOK I家族的非特异性核酸内切酶 含有两个核酸酶结构域的Cas蛋
切酶 白，一个在蛋白质中间的HNH
核酸酶结构域和一个位于N端的
RuvC-like结构域分别切割DNA
的两条链
质粒构建 将多个重复单元通过分子克 将多个重复单元通过分子克隆或 只需改变sgRNA中20或30个碱
隆或是以固相为基础的TALE 是以固相为基础的锌指重复组装 基的向导序列即可
重复组装方法串联起来。 方法串联起来。
应用范围 能够与各种效应元件，如转 能够与各种效应因子结构域，如 几乎可以在sgRNA的介导下对
录活化因子、转录抑制因子、 核酸酶结构域、转录激活因子结 任意的DNA序列进行切割。
转座酶、DNA等搭配，对基 构域、位点特异性的重组酶结构
因组的结构或者功能进行改 域等搭配，对基因组中的目标位
造等。 点进行各种遗传修饰。
张敏菁，等：CRISPR/Cas系统及其在昆虫基因功能研究中的应用第1期 101
Cas基因具有较高的多样性，功能丰富。根据
Cas基因序列和 CRISPR/Cas系统免疫机制可将系
统大致分为 3类： I、II、III类 [22]。I和 III类都具
有多个 Cas蛋白。I类系统在古细菌和细菌中都有
发现，而 III类大多存在于古细菌中，鲜有出现在
细菌中 [16]，这两种类型都是由多个 Cas蛋白形成的
复合体参与 DNA切割。II类仅存在于细菌中 [16]，
且只需一个 Cas9蛋白来切割 DNA[23]，因此，这个
类型的系统是被改造得最多的人工核酸酶。Cas9是
由 1 409个氨基酸组成的含有两个核酸酶结构域的
蛋白质，一个在蛋白质中间的 HNH核酸酶结构域
和一个位于 N端的 RuvC-like结构域分别切割 DNA
的两条链 [24]。目前，此系统已应用于人类细胞、小
鼠、大鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫、
水稻等 [24-29]，成功定向敲除基因，本文将介绍该系
统在昆虫中的应用。
1.2　CRISPR/Cas作用机制
虽然 CRISPR/Cas的详细机制还未完全阐明，
但已基本明确其作用机制可大致分为 3个阶段：适
应、表达、干扰 [30]。第一阶段，外来入侵 DNA中
的原型间隔序列 (protospacer)被整合到宿主基因组
的 CRISPR位点 5端的两个重复序列之间 [21]，虽
然目前还不清楚整合位点选择的机理，但很有可能
是保守性的 Cas蛋白在起作用，如靠近 protospacer
的 1~4个碱基高度保守，称为 PAM (protospacer
adjacent motifs)，被认为在位点识别中起到重要作
用 [31]。第二阶段分为两个步骤，第一步是 CRISPR
转录产生前体非编码 RNA(precursor crRNA, pre-
crRNA)；第二步是长链 pre-crRNA加工成短链
crRNA，在 II型系统中，大分子蛋白 Cas9在这一步
中起到重要作用。短链 crRNA再与 trans-activating
crRNA (tracrRNA)形成双链二级结构 [32]，以指导
Cas蛋白切割。第三阶段是 crRNA和 tracrRNA的
二元复合物与 Cas蛋白结合，识别特异性位点并对
双链 DNA进行切割，产生 DSB，II型系统切割位
点位于 PAM上游 3~8 nt处 [24]。
在细菌和古细菌的原始免疫系统中，crRNA和
tracrRNA与 Cas蛋白结合发挥作用。而优化后的系
统中，crRNA和 tracrRNA的二元复合体可简化为
single strand sgRNA，它必须包括一个互补于靶基
因序列的引导序列和一个可与 Cas9蛋白结合的支
架序列 [30]。因此，只需表达两个产物——sgRNA
和 Cas蛋白，便能简便地、有效地修饰生物体基因
组 (图 1) [33]。
在 CRISPR/Cas系统的作用下，靶标位置产生
DSB，DSB诱导细胞引发非同源末端连接修复 (non-
homologous end joining, NHEJ)或同源重组 (homol-
ogous recombination, HR)修复机制对 DSB进行修
复，最终产生突变体 [34]。
同源重组修复是以同源链为模板的修复机制，
有位点特异性的核酸酶 (site-specific nuclease)参与，
其保真度非常高。利用 HR可以插入一个或者多个
基因，也可以进行单碱基替换。而非同源末端连接
修复机制是另外一种不会用到同源模板链的修复机
图1 用于基因组编辑的双元件CRISPR/Cas9系统示意图[43]
生命科学 第27卷102
制，所以，在断裂处容易出现小的插入或者缺失突
变，常常会导致移码突变，使基因的功能遭到破坏。
而在CRISPR/Cas中，主要是依靠NHEJ来产生突变。
1.3　脱靶效应
有实验发现，CRISPR/Cas系统存在脱靶效应，
即由于其对靶位点的识别主要依靠 13个碱基及
PAM序列，这样的序列在大的基因组中很容易出现
重复，因而会被Cas蛋白非特异性地切割。研究表明，
Cas蛋白对于 sgRNA 5端初始碱基的错配有一定的
容忍度。当 5端错配多于 1个碱基，可能出现脱靶
效应。而在 sgRNA的 3端的错配，通常会导致无
法靶向切割 [35-38]。也有研究表明，在人类细胞中有 5
个碱基错配的情况下，Cas9蛋白仍能切割双链 [39-40]。
但在以果蝇、家蚕为对象的实验中，使用 CasOT
(Cas9/sgRNA off-target searching tool)工具、PCR扩
增和测序方法，结果未检测到脱靶效应 [41-42]，说明
不同物种之间，Cas9的保真性存在一定差异。
2　CRISPR/Cas系统在果蝇中的应用
2013年至今已有多个研究团队在黑腹果蝇中
运用 CRISPR/Cas 系统对果蝇基因组进行靶向编
辑 [41,43-50]，不同点在于他们使用不同的方法产生系
统的两大元件，即 Cas9蛋白和 sgRNA，以达到编
辑基因组的目的。
2.1　共注射表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒
第一种果蝇突变体的产生是依靠两种质粒共注
射的方法。Gratz等 [45]将一个在 Hsp70启动子下表
达 Cas9基因的质粒和另一个在来自 U6基因的 pol
III启动子下表达 sgRNA的质粒共注射到果蝇合胞
体胚层。以能够遗传给后代的 yellow作为靶标基因，
检测突变效率结果发现，细胞自发进行 NHEJ修复
后，66%的被注射果蝇产生突变，而仅 5.9%的被
注射的果蝇产生了至少一个突变体后代。而注射两
种 sgRNA，它们分别靶向 yellow基因两端序列，
会引起目标基因大片段缺失并提高突变效率。
相似地，Ren等 [41]比较了不同启动子、sgRNA
支架长短对突变效率的影响。研究发现，在 nos启
动子下表达 Cas9基因的质粒和在 U6b启动子下表
达短支架 sgRNA的质粒共注射后，突变效率最高，
约为 3.2%。
此种方法虽然操作简便，但产生突变体后代的
比例较低。
2.2　共注射sgRNA和表达Cas9蛋白的mRNA
Bassett等 [51]将离体转录好的 sgRNA与表达
Cas9蛋白的 mRNA一起注射到果蝇早期胚胎中，
靶标基因是 yellow。有 88%的果蝇产生了至少一个
突变体后代。Yu等 [50]利用相同的方法对 yellow等
7个基因进行定向修饰，突变效率达到 80%左右。
这种方法的突变效率高，并且能在基因组上广
泛应用。与共注射质粒的方法比较，研究者认为两
者效率的差异来源于 sgRNA和 Cas9蛋白的表达水
平 [43]。注射体外转录好的 RNA，在果蝇胚胎中表
达水平高于质粒，但是从实验操作而言，体外转录
这一步需要花费大量时间。
2.3　转基因果蝇杂交
Kondo等 [52]通过两种转基因果蝇杂交产生突
变体后代。一种转基因果蝇在 nanos启动子下，在
生殖细胞中表达 Cas9蛋白；另一种转基因果蝇在
U6启动子下普遍表达 sgRNA。检测结果发现，有
90%的果蝇产生了至少一个突变体后代，并且两种
sgRNA共表达会产生最大 1.6 kb的片段缺失，突变
效率更高。
虽然这种方法的突变效率和可育比例高，但缺
点是每修饰一个靶标基因就需要产生一种新的转基
因果蝇，时间成本过高。不仅如此，突变体产生
后还需移去转入的 sgRNA和 Cas9基因，操作较
为复杂。
2.4　向转Cas9基因的果蝇注射编码sgRNA的质粒
Sebo等 [53]在生殖细胞系表达 vasa-Cas9的转
基因果蝇中注射编码 sgRNA的质粒，70%的果蝇
产生突变体后代。Ren等 [41]也用此种方法实验，不
同点在于使用的是 nanos启动子，获得突变的效率
为 92.9%。
相较前三种介绍的方法，此方法通过只在生殖
细胞中表达 Cas9蛋白而避免在体细胞产生突变，
影响细胞正常生长和发展 [43]，并且其具有操作简便、
突变效率高、可育比例高等优势，故应用范围广。
实际上，CRISPR/Cas9打靶效率因基因座不同，甚
至基因座相同而因位点不同差异很大。因此，为了
控制变量来比较不同方法运用此系统的差异，Gratz
等 [46]就对同一基因位点进行实验，结果发现共注
射 gRNA和 hsp70-Cas9质粒的果蝇有 8%产生了突
变体后代，而所有后代中 1.4%是突变体；向 vasa-
Cas9转基因果蝇注射 gRNA的果蝇有 53%产生了
突变体后代，而所有后代中 15%是突变体。可见，
两者打靶效率差异十分明显，并且只在生殖细胞中
表达 Cas9蛋白的果蝇健康，纯合可育。
张敏菁，等：CRISPR/Cas系统及其在昆虫基因功能研究中的应用第1期 103
3　CRISPR/Cas系统在家蚕中的应用
家蚕不仅是一种具有很高经济价值的吐丝昆
虫，还是研究鳞翅目昆虫的模式生物。为了更深入
地研究它，许多昆虫学工作者利用不同的生物技术
工具对其基因组进行编辑。在家蚕中应用 CRISPR/
Cas系统定向敲除基因也已获得成功。研究者选择
家蚕尿酸盐代谢通路中的 BmBLOS2基因作为靶标
基因，设计了两个靶向位点及 sgRNA，通过显微注
射的方法，将编码 Cas9的 mRNA和 sgRNA混合
注射到家蚕胚胎，成功获得了高突变效率的家蚕突
变体，并且能够稳定遗传 [54-55]。
西南大学家蚕基因组学国家重点实验室也以家
蚕为对象，选择了 BmKu70作为靶标基因，利用
CRISPR/Cas系统在家蚕核细胞进行定向敲除 [56]。
他们采用的是转入质粒 DNA，无需体外转录，比
直接注射 RNA更方便快捷且不易降解。当家蚕核
细胞转入针对 6个基因的 10条 sgRNAs时，所有
靶标位点都产生了定向突变，表明此系统可以诱导
多个基因同时突变，并且没有脱靶现象 [57]。除此之
外，CRISPR/Cas9还能诱导高频率定向基因组结构
变化，如大的染色体的缺失或倒置。综上所述，高
效率的定向基因编辑、基因组结构改变以及多位点
同时编辑的实现，为研究者精确、复杂地操控基因
提供了强有力的技术支持。
4　基于同源重组修复的靶位点精确编辑
很多研究侧重于关注在靶标位点是否产生了插
入或缺失，而有少数实验室报道了利用基于同源重
组修复 (HR)途径修复的 CRISPR/Cas基因修饰 [58]。
通过非同源末端连接修复 (NHEJ)途径修复产生的
突变片段大小具有不确定性，小到 1个碱基，大到
几百个碱基 [50]。虽然利用 NHEJ途径修复产生一个
基因的突变体的效率高，但由于其造成缺失或插入
的片段大小不可预测，故无法在基因组产生精确的
插入、删除或置换，也就难以应用于活体基因功能
研究 [49]。然而，HR修复途径可弥补这个缺陷。HR
修复途径是以同源链为模板，保真度非常高，因此，
利用HR途径可以对基因组靶标位点进行精确修饰。
Gratz等 [46]构建了一个 HR修复途径所需的供
体 DNA载体，包含为了快速整合同源臂的多克隆
位点、为了随后接近基因座的 attP ΦC31噬菌体重
组位点、可见标记 3xP3DsRed以及在其旁的 loxP
位点 (为了标记能被移除 )。将此载体与编码 gRNA
的 DNA共注射到 vasa-Cas9转基因果蝇胚胎中，
16%的果蝇产生了精确突变。
Yu等 [49]选择了果蝇的两个基因座——CG4221
和 CG5961作为研究对象，利用 CRISPR/Cas系统
和 HR途径进行实验。供试果蝇选择 Ligase4突变
体 (Lig4169)，因为 Ligase4基因功能丧失后，NHEJ
途径被阻断，故细胞会启动 HR途径修复 DSBs。
在 CG4221突变体中，CG4221的大小为 0.12 kb的
F-box域被 loxP精确置换，导致基因功能丧失。在
CG5961突变体中有相似的结果。在同源供体 DNA
上，设计一个 Hind III限制性位点，通过 HR途径，
成功置换了CG5961基因座中第一个编码外显子 40 bp
的内源 DNA片段。值得一提的是，同样是 HR修
复途径，利用 TALEN的突变效率低于 CRISPR/Cas
系统。
Port等 [47]利用转基因 Cas9系和通用的 gRNA
表达质粒，与寡核苷酸供体一起，通过同源重组进
行精确基因组编辑，而且不需要可见的标记。他们
设计了一个寡核苷酸供体 DNA以引入一个 11 bp
的序列，这个序列包括 BgIII限制性酶的识别位点。
将供体 DNA 注射到 act-cas9 U6:3-gRNA-e 胚胎，
产生 DSB并诱发细胞 HR产生突变体，突变体效
率达到 40%，并且测序发现，在靶位点有供体 DNA
的精确整合。
Bassett等 [44]验证了在果蝇 S2细胞系中，依
靠 HR的 CRISPR/Cas9系统也能产生精确突变。有
研究表明，短单链 DNA寡核苷酸 (ssDNA)和长双
链 DNA (dsDNA)供体都能作为模板，在果蝇和其
他物种中实现 HR途径。因此，他们共转染 gRNA
切割位点两边的 DNA供体，PCR检测结果发现，
同源臂越长，整合效率越高，并且最优的同源臂长
(通过同源基因靶标 )为 1 kb。通过这个技术，研
究者有可能可以控制果蝇细胞系的遗传，甚至可以
研究基因组维度的细胞表型。
5　简便方法筛选突变体
基于 PCR的筛选突变体方法，花费大量人力
物力，且效率不高。Yu等 [49]开发了一种简便筛选
的方法，它利用的是果蝇 white基因标记。他们首
先构建含有 white编码序列的 pP[RS3]3’M载体，再
将 gRNA和外源供体 DNA (pP[RS3]3’M-yellowwhite-K-1)
共注射到果蝇胚胎，yellow基因的突变体可通过是
否为 white+表型 (红眼 )来判断。此方法不需要高
通量的 PCR和酶解，只需显微镜观察，因此简单、
生命科学 第27卷104
快速、准确且适用范围广。Gratz等 [46]也设计了一
种方法，但只适用于在靶标位点包含已标记的转座
子的果蝇株系，如 DSH3PX1EY08084果蝇。这种方法
利用已标记的转座子在修复过程中缺失来筛选成功
的突变体。目前在家蚕的突变体筛选法中，应用普
遍的仍是 PCR扩增并测序，只有当靶标基因的突
变会改变易观察表型，如体色时，才能通过肉眼观
察简便筛选 [42]。因此，未来需进一步优化筛选方法，
达到对难以从表型筛选的位点进行快速筛选的目的。
6　总结与展望
CRISPR/Cas II型系统因其系统成分简单、操
作方便、突变效率高的优点，已成为现在发展最为
迅速、国内外学者广泛研究开发、应用于多种生物
体基因组的定向基因编辑技术。由于受到 PAM
(NGG)的限制，它不能对所有靶标位点进行编辑，
但越来越多的研究显示，不同细菌中 CRISPR/Cas
的 PAM不同，有 CWT、GAA等 [31,60]，因此，可
以适应不同靶位点，适用范围将更广。
作为第三代人工核酸酶——CRISPR/Cas系统
具有显著优势。首先，CRISPR的靶向突变效率要
高于 TALEN[49]；其次，ZFN与 TALEN的 DNA特
异性结合域都是蛋白质，因此，在实际操作中需要
根据靶标序列设计合成蛋白质，构建组装时间长且
成本高。而新兴的 CRISPR/Cas由 RNA介导，每
个靶标位点只需替换已构建好的载体中的 20 nt碱
基，重复利用率高而操作简便、节省成本 [61]。
虽然对 CRISPR/Cas系统的基础研究及应用已
开展得如火如荼，但其详细作用机制还未完全阐明。
在应用方面，CRISPR/Cas系统也存在一定缺陷。
第一，不同生物体突变效率差别大，就比如在果蝇
中突变效率高而在酵母中突变效率低，因此，可能
并不适用于所有生物体，不同昆虫也然。第二，虽
然在黑腹果蝇、家蚕中应用未检测到脱靶效应，但
有文献报道在其他生物体上应用时出现脱靶效应，
如小鼠、人等 [62-63]。因此，需要研发新方法来解决
脱靶问题，如南京大学模式动物研究所黄行许课题
组利用 Cas9切口酶和成对 sgRNA，在高效突变小
鼠基因基础上，大大降低 CRISPR/Cas9系统的脱靶
效应 [64]。第三，目前应用普遍的突变体筛选法仍是
PCR扩增并测序检测，只有当靶标基因的突变会改
变易观察表型时，才能通过肉眼观察简便筛选。因
此，未来需进一步优化筛选方法、缩短筛选时间，
达到对难以从表型筛选的位点进行快速筛选的目
的。此外，CRISPR/Cas9系统目前还只限于对核基
因组的编辑，无法完成对细胞器基因组的操作，而
TALEN系统通过改造后已经能对线粒体基因组进
行改造 [65]。
2014年初，在人类细胞中完成了基于 CRISPR/
Cas系统的全基因组敲除筛选，发现靶向 18 080个
基因的全基因组 CRISPR/Cas9敲除 (genome-scale
CRISPR/Cas9knockout, GeCKO)文库的慢病毒传递，
能在人类细胞中进行正向和负向的选择性筛选 [66]。
这对于在昆虫中应用此全基因组筛选平台具有重要
意义。例如，为了找到特定蛋白质在某一昆虫中的
受体，可针对此昆虫的全基因组设计覆盖每个基因
的 sgRNA库，得到敲除了相应基因的昆虫个体，
再进行蛋白筛选，最终获得相关受体基因。
随着昆虫全基因组测序的不断发展，人们已经
获得了黑腹果蝇、赤拟谷盗、家蚕、寄生蜂、豌豆蚜、
小菜蛾等昆虫的全基因组，因此，怎么样把海量基
因组信息转化成有意义的基因组功能变得尤为重
要。而 CRISPR/Cas9系统便可以帮助我们对昆虫的
几乎任意基因进行人工操作，对研究昆虫基因功能、
代谢通路等具有重要意义。
综上所述，CRISPR/Cas系统作为一项新技术，
有令人瞩目的优势，但也有需要解决和改善的缺陷。
果蝇作为模式生物为今后对此系统的应用研究打下
了基础，因此，需要研究人员进行更多的探索和实
践，在不断完善 CRISPR/Cas系统功能的基础上，
利用 CRISPR/Cas系统对昆虫全基因组功能注释发
挥重要作用，以求对人类了解自然产生深远的影响。
[参　考　文　献]
[1] Myers EW, Sutton GG, Delcher AL, et al. A whole-
genome assembly of Drosophila . Science, 2000,
287(5461): 2196-204
[2] Richards S, Gibbs RA, Weinstock GM, et al. The genome
of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature,
2008, 452(7190): 949-55
[3] Xia Q, Guo Y, Zhang Z, et al. Complete resequencing of
40 genomes reveals domestication events and genes in
silkworm (Bombyx). Science, 2009, 326(5951): 433-6
[4] Werren JH, Richards S, Desjardins CA, et al. Functional
and evolutionary insights from the genomes of three
parasitoid Nasonia species. Science, 2010, 327(5963):
343-8
[5] International Aphid Genomics Consortium. Genome
sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS
Biol, 2010, 8(2): e1000313
[6] You M, Yue Z, He W, et al. A heterozygous moth genome
provides insights into herbivory and detoxification. Nat
张敏菁，等：CRISPR/Cas系统及其在昆虫基因功能研究中的应用第1期 105
Genet, 2013, 45(2): 220-5
[7] Choo Y, Klug A. Selection of DNA binding sites for zinc
fingers using rationally randomized DNA reveals coded
interactions. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(23):
11168-72
[8] Choo Y, Klug A. Toward a code for the interactions of zinc
fingers with DNA: selection of randomized fingers
displayed on phage. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,
91(23): 11163-67
[9] Boch J, Scholze H, Schornack S, et al. Breaking the code
of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.
Science, 2009, 326(5959): 1509-12
[10] Bonas U, Stall RE, Staskawicz B. Genetic and structural
characterization of the avirulence gene avrBs3 from
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Mol Gen Genet,
1989, 218(1): 127-36
[11] Cermak T, Doyle EL, Christian M, et al. Efficient design
and assembly of custom TALEN and other TAL effector-
based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res,
2011, 39(12): e82
[12] Brouns SJ, Jore MM, Lundgren M, et al. Small CRISPR
RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science,
2008, 321(5891): 960-4
[13] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide
sequence of the iap gene, responsible for alkaline
phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and
identification of the gene product. J Bacterial, 1987,
169(12): 5429-33
[14] Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction
enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.
Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(3): 1156-60
[15] 方锐, 畅飞, 孙照霖, 等. CRISPR/Cas9介导的基因组定
点编辑技术. 生物化学与生物物理进展, 2013, 40(8):
691-702
[16] Jansen R, Embden J, Gaastra W, et al. Identification of
genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes.
Mol Microbiol, 2002, 43(6): 1565-75
[17] Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. The CRISPRdb database
and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries
of spacers and repeats. BMC Bioinformat, 2007, 8: 172
[18] Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. CRISPRFinder: a web
tool to identify clustered regularly interspaced short
palindromic repeats. Nucleic Acids Res, 2007, 35(2): W52
[19] Wei C, Liu J, Yu Z, et al. TALEN or Ca 9 rapid, efficient
and specific choices for genome modifications. J Genet
Genomics, 2013, 40(6): 281-9
[20] Godde JS, Bickerton A. The repetitive DNA elements
called CRISPRs and their associated genes: evidence of
horizontal transfer among prokaryotes. J Mol Evol, 2006,
62(6): 718-29
[21] 李铁民, 杜波. CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进
化. 遗传, 2011, 33(3): 213-8
[22] Haft DH, Selengut J, Mongodin EF, et al. A guild of 45
CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple
CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. PLoS
Comput Biol, 2005, 1(6): e60
[23] Garneau JE, Dupuis MÈ, Villion M, et al. The CRISPR/
Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and
plasmid DNA. Nature, 2010, 468(7320): 67-71
[24] Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, et al. Heritable
genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system.
Nat Methods, 2013, 10(8): 741-3
[25] Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al. Efficient genome
editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat
Biotechnol, 2013, 31(3): 227-9
[26] DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, et al. Genome engineering
in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.
Nucleic Acids Res, 2013, 41(7): 4336-43
[27] Li D, Qiu Z, Shao Y, et al. Heritable gene targeting in the
mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat
Biotechnol, 2013, 31(8): 681-3
[28] Cho SW, Kim S, Kim JM, et al. Targeted genome
engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided
endonuclease. Nat Biotechnol, 2013, 31(3): 230-2
[29] Miao J, Guo D, Zhang J, et al. Targeted mutagenesis in
rice using CRISPR-Cas system. Cell Res, 2013, 23(10):
1233-6
[30] Guo SC, Lv Y, Lin YX, et al. CRISPR/Cas9 systems: the
next generation gene targeted editing tool. Proc Natl Acad
Sci India B: Biol Sci, 2014: 1-11
[31] Mojica F, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, et al.
Short motif sequences determine the targets of the
prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology, 2009,
155(3): 733-40
[32] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, et al. CRISPR
RNA maturation by trans-encoded small RNA and host
factor RNase III. Nature, 2011, 471(7340): 602-7
[33] Dahlem TJ, Hoshijima K, Jurynec MJ, et al. Simple
methods for generating and detecting locus-specific
mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.
PLoS Genet, 2012, 8(8): e1002861
[34] Bibikova M, Golic M, Golic KG, et al. Targeted
chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila
using zinc-finger nucleases. Genetics, 2002, 161(3): 1169-
75
[35] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome
engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013,
339(6121): 819-23
[36] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable
dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial
immunity. Science, 2012, 337(6096): 816-21
[37] Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human
genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339(6121):
823-26
[38] Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, et al. DNA targeting
specifici ty of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat
Biotechnol, 2013, 31(9): 827-32
[39] Jiang W, Bikard D, Cox D, et al. RNA-guided editing of
bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat
Biotechnol, 2013, 31(3): 233-9
[40] Fu Y, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-
target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in
human cells. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 822-6
[41] Ren X, Sun J, Housden BE, et al. Optimized gene editing
生命科学 第27卷106
technology for Drosophila melanogaster using germ line-
specific Cas9. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(47):
19012-7
[42] Wei W, Xin H, Roy B, et al. Heritable Genome Editing
with CRISPR/Cas9 in the silkworm, Bombyx mori. PLoS
One, 2014, 9(7): e101210
[43] Bassett AR, Liu JL. CRISPR/Cas9 and genome editing in
Drosophila. J Genet Genomics, 2014, 41(1): 7-19
[44] Bassett AR, Tibbit C, Ponting CP, et al. Mutagenesis and
homologous recombination in Drosophila cell lines using
CRISPR/Cas9. Biol Open, 2014, 3(1): 42-9
[45] Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, et al. Genome
engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided
Cas9 nuclease. Genetics, 2013, 194(4): 1029-35
[46] Gratz SJ, Ukken FP, Rubinstein CD, et al. Highly specific
and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed
repair in Drosophila. Genetics, 2014, 196(4): 961-71
[47] Port F, Chen HM, Lee T, Bullock SL. An optimized
CRISPR/Cas toolbox for efficient germline and somatic
genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U
S A, 2014, 111(29): E2967-76
[48] Sebo ZL, Lee HB, Peng Y, et al. A simplified and efficient
germline-specific CRISPR/Cas9 system for Drosophila
genomic engineering. Fly: Austin, 2014, 8(1): 52-7
[49] Yu Z, Chen H, Liu J, et al. Various applications of
TALEN- and CRISPR/Cas9-mediated homologous
recombination to modify the Drosophila genome. Biol
Open, 2014, 3: 271-80
[50] Yu Z, Ren M, Wang Z, et al. Highly efficient genome
modifications mediated by CRISPR/Cas9 in Drosophila.
Genetics, 2013, 195(1): 289-91
[51] Bassett AR, Tibbit C, Ponting CP, et al. Highly efficient
targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/
Cas9 system. Cell Rep, 2013, 4(1): 220-8
[52] Kondo S, Ueda R. Highly improved gene targeting by
germline-specific Cas9 expression in Drosophila.
Genetics, 2013, 195(3): 715-21
[53] Sebo ZL, Lee HB, Peng Y, et al. A simplified and efficient
germline-specific CRISPR/Cas9 system for Drosophila
genomic engineering. Fly: Austin, 2014, 8(1): 52-7
[54] Wang Y, Li Z, Xu J, et al. The CRISPR/Cas System
mediates efficient genome engineering in Bombyxmori.
Cell Res, 2013, 23(12): 1414-6
[55] Daimon T, Kiuchi T, Takasu Y. Recent progress in genome
engineering techniques in the silkworm, Bombyxmori. Dev
Growth Differ, 2014, 56(1): 14-25
[56] Ma S, Chang J, Wang X, et al. CRISPR/Cas9 mediated
multiplex genome editing and heritable mutagenesis of
BmKu70 in Bombyxmori. Sci Rep, 2014, 4: 4489
[57] Liu Y, Ma S, Wang X, et al. Highly efficient multiplex
targeted mutagenesis and genomic structure variation in
Bombyxmori cells using CRISPR/Cas9. Insect Biochem
Mol Biol, 2014, 49: 35-42
[58] Baena-Lopez LA, Alexandre C, Mitchell A, et al.
Accelerated homologous recombination and subsequent
genome modification in Drosophila. Development, 2013,
140(23): 4818-25
[59] Beumer KJ, Trautman JK, Mukherjee K, et al. Donor
DNA utilization during gene targeting with zinc-finger
nucleases. Genes Genomes Genet, 2013, 3(4): 657-64
[60] Esvelt KM, Mali P, Braff JL, et al. Orthogonal Cas9
proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat
Methods, 2013, 10(11): 1116-21
[61] 张智辉, 董少忠, 寸韡. 基因组定点编辑技术的研究进
展. 生命科学, 2013, 25(7): 735-42
[62] Wu Y, Liang D, Wang Y, et al. Correction of a genetic dis-
ease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell,
2013, 13(6): 659-62
[63] Fu Y, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-tar-
get mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in
human cells. Nat Biotech, 2013, 31(9): 822-6
[64] Shen B, Zhang W, Zhang J, et al. Efficient genome modi-
fication by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target
effects. Nat Methods, 2014, 11(4): 399-402
[65] Bacman SR, Williams SL, Pinto M, et al. Specific
elimination of mutant mitochondrial genomes in patient-
derived cells by mitoTALENs. Nat Med, 2013, 19(9):
1111-3
[66] Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, et al. Genome-scale
CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.
Science, 2014, 343(6166): 84-7