全 文 ：收稿日期:2006-04-14
基金项目:新疆高技术发展计划项目“新疆家蚕抗菌肽基因工程产品的中试工艺研究”(200311118)
作者简介:李志龙(1977-),在读硕士研究士,主要从事发酵技术研究
通讯作者:张富春,电话:0991-8583259,电子邮件:zfcxju@xju.edu.cn
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
李志龙 张富春
(新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046)
摘 要: 巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达体系是近年发展起来的最为成功的真核表达体系。对巴斯德毕赤酵母
表达系统及影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素进行了简要综述。
关键词: 巴斯德毕赤酵母 外源基因 表达
ProgressofMethylotrophicYeastPichiaPastoris
ExpressionSystem
LiZhilong ZhangFuchun
(KeyLaboratoryofMolecularBiology,ColegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,XinjiangKey
LaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,Urumqi830046)
Abstract: ThePichiapastorisexpresionsystem isthemostsuccesfuleukaryoticexpresionsystem whichwas
widelyappliedanddevelopedinrecentyears.Thecharacteristicsandthefactorsinfluencingforeigngeneexpresionof
Pichiapastorisexpresionsystemarereviewedinthispaper.
Keywords: Pichiapastoris Foreignprotein Expresion
酵母表达系统为外源基因在真核细胞中的表
达提供了广阔的前景[1]。最先用于表达外源蛋白的
酵母菌来自于酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)
。酿酒酵母表达系统有原核生物生长快、操作简便
和真核细胞翻译后的加工和修饰功能的特点。但酿
酒酵母表达系统表达产物含量不很高,缺乏强有力
的严格调控的启动子,不适合于高密度发酵培养
[2]。而巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统得
以迅速发展并被广泛应用,是因为巴斯德毕赤酵母
具有强烈的好氧生长偏爱性,可进行细胞高密度培
养,利于大规模工业化生产;所含有的醇氧化酶
(AlcoholOxidase,AOX)基因的启动子具有强诱导性
和强启动性,适于外源基因的高水平诱导表达;可高
水平分泌表达外源蛋白,纯化方便;并具有真核细胞
的翻译后修饰功能等优点。迄今有多种外源蛋白在
巴斯德毕赤酵母中获得表达。但也有许多外源蛋白
表达不理想,甚至不能表达。要实现目的蛋白在巴
斯德毕赤酵母中的成功表达,必须充分考虑影响外
源蛋白表达的各种因素并采取有效的优化策略。
1 巴斯德毕赤酵母的生物学和遗传学特点
巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类
能够以甲醇作为惟一碳源和能量来源的酵母菌。以
甲醇为惟一的碳源和能量来源的酵母菌除毕赤酵
母属(Pichia)外,还有汉逊酵母属(Hansenula)、念珠
酵母属(Candida)和球拟酵母属(Torulopsis)等。但
可作为表达外源蛋白宿主菌的主要是巴斯德毕赤
酵母和多形汉逊酵母 (Hansenulapolymorpha)2个
种。它们在无性生长期主要以单倍体形式存在。当
环境营养限制时,常诱导 2个生理类型不同的接合
型单倍体细胞交配,融合成双倍体[3]。
巴斯德毕赤酵母能够利用甲醇,是因为甲醇能
诱导其表达甲醇代谢所需的醇氧化酶(alcohol
oxidase,AOX)基因的表达,产生 AOX1和 AOX2。巴
斯德毕赤酵母在缺少抑制性碳源(如葡萄糖、甘油)
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2006年第6期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第6期
时,可利用甲醇作为惟一碳源。甲醇代谢的第一步
是在过氧化物酶体中甲醇在乙醇氧化酶作用下被
氧化成甲醛,并产生过氧化氢。乙醇氧化酶对氧的
亲和力很弱,因此巴斯德毕赤酵母代偿性地大量产
生这种酶,调控这种酶的启动子是强启动子,用来调
控异源蛋白的表达。乙醇氧化酶 (即 AOX1和
AOX2)由两种基因编码,细胞中绝大多数乙醇氧化
酶的活力是由 AOX1提供的。在甲醇培养的细胞
中,该酶可占细胞总蛋白的 30%以上。AOX2与
AOX1的同源性虽然高达 97%,但只承担很少一部
分活力。当 Aox1基因缺失只存在 Aox2时,大部分
的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,细
胞在甲醇培养基上生长很慢,这种菌株被称为
Muts;Aox1基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在
甲醇培养基上生长较快,这种菌株表型被称为
Mut+。Aox1基因的表达为转录水平调控。Aox1基因
的调控是一个抑制机制和诱导机制的过程,在以葡
萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而
在以甲醇为惟一生长碳源时诱导基因转录,蛋白质
表达。甲醇酵母生长适宜温度一般为 28～30℃。诱
导期间若温度超过 32℃,不利于蛋白表达,甚至会
导致细胞死亡。以甘油或葡萄糖为碳源时,Muts和
Mut+生长速度并无区别,而以甲醇为碳源时,Mut+的
生长比 Muts的生长明显更快[4,5]。
2 巴斯德毕赤酵母表达系统的构成
(1)表达宿主菌 该表达系统常用的表达宿主
菌有 GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等,均为甲醇
诱导型,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长
时,该表达系统的宿主菌中 AOX1基因的表达受到
抑制,而在以甲醇为惟一碳源时,宿主菌中 AOX1
启动子被强烈诱导,使外源蛋白大量表达。新近问
世的一类蛋白酶缺陷株,如 SMD1168(his4,pep4)、
SMD1163(his4pep4prb1)、SMD1165(his4prb1),可
以减少分泌蛋白的酶解消化,为外源蛋白的成功表
达创造了条件[6]。
(2)表达载体 该表达系统没有稳定的附加载
体,所以使用整合型载体,也称穿梭载体。其可以在
大肠杆菌中保存、扩繁,线性化后转入酵母细胞。常
见 的 胞 内 表 达 载 体 有 pPIC3、pPSC3k、pHIL-D1、
pAO815等,分泌型表达载体有 pPIC9、pPIC9K、
pHIL-S1p、YAM7SP6、pGAPZa等。这些载体大多以
His4作为选择标记,具有共同的一般结构。以
pPIC9为例,一般结构为:AOX1基因的 5′AOX1启
动子、编码 N端分泌信号(SIG)、多克隆位点(MCS)、
转录终止和 PolyA形成基因(TT)、3′AOX1序列、3′
AOX1终止序列、组氨酸脱氢酶筛选标志基因(H
is4)、抗氨苄青霉素基因(Amp)、大肠杆菌 pBR322质
粒片段 (复制起点 ColE1),以及一些特定的限制性
内切酶位点[7-8]。
3 巴斯德毕赤酵母高效表达外源基因的机制
P.pastoris能高效表达外源基因,是因为它有比
S.cerevisiae更强的强启动子,即醇氧化酶启动子
PAOX。甲醇营养型酵母能将甲醇分解为甲醛和过
氧化氢,在此反应中参与的酶是醇氧化酶(AOX1,
AOX2),其中 AOX2的表达量比 AOX1低得多,以甲
醇为惟一碳源时,AOX增至细胞总蛋白的 35%～
40%。PAOX1受甲醇诱导和葡萄糖或甘油的抑制。
因此,AOX的表达受甲醇的严格控制。P.pastoris所
表达的外源基因位于酵母染色体上,这是通过把携
带外源基因的表达质粒线性化,以同源重组的方式
整合到强启动子 PAOX1下游,目的基因一般插入
到 5′AOX启动子和转录终止信号之间的单克隆位
点。整合方式有 2种:一种是在 His4或 5′AOX1启
动子 DNA片段的单酶切位点,将质粒载体切成线
性,通过单交换整合到染色体上,这种整合的菌株
表型为 Mut+,P.pastoris染色体上 AOX1基因保持
完整;另一种是双位点互换,含 5′AOX1启动子、外
源基因和转录终止区的表达单元置换染色体上有
完整功能的 AOX1基因,产生的菌株表型为 Muts,
由于 AOX1基因被置换,只能依靠弱转录的 AOX2
基因,所以该菌利用甲醇速度慢。但 2类表达菌的
表达水平均较高。
巴斯德毕赤酵母表达产物有胞内表达和胞外
分泌型表达两种方式,这取决于表达载体的选择和
载体构建时是否带有信号肽。胞内表达适合于通常
在胞浆中表达或不含-s-s-键的非糖基化蛋白,比胞
外分泌水平高,但产物纯化相对复杂[9]。对于那些
易于降解的蛋白或对宿主菌有毒害作用的蛋白,胞
内表达可将它们存储在广泛存在于甲醇酵母细胞
内的特异性细胞分隔-过氧化物酶体(peroxisomes)
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中。目前研究表明,胞内表达蛋白分选入过氧化物
酶体的作用主要与两种靶信号有关,即 PTS1和
PTS2。它们可与表达蛋白结合,帮助蛋白前体从胞
浆进入过氧化物酶体,从而获得较好保存。
4 巴氏毕赤酵母表达外源蛋白的优点
巴斯德毕赤酵母表达系统作为真核表达系统,
有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。可对表
达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰,从而使表达
出的蛋白具有生物活性,具有强有力的乙醇氧化酶
(AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达,
营养要求低,培养基廉价,生长快,与昆虫、哺乳动
物等高等真核细胞相比,易于进行操作和培养。巴
斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学
特性使它能高密度发酵生长,表达量高,有利于工
业放大生产。酿酒酵母中表皮生长因子(EGF)的表
达量为 7.4mg/L,而在巴斯德毕赤酵母中的表达量
为 450mg/L,表达量提高约 60倍。许多蛋白在巴斯
德毕赤酵母中的表达量可达到 g/L以上水平,如破
伤风毒素 C片段表达量达 12g/L,在巴斯德毕赤酵
母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞
外。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非
常少,有利于外源蛋白的分离和纯化。由于巴斯德
毕赤酵母无内源型载体,一般外源目的基因通过携
带它的整合型载体经同源重组整合到宿主染色体
基因组上,随染色体复制而复制,这种整合型表达
比内源性质粒表达稳定性高,可连续培养 100代而
外源基因不丢失。巴氏毕赤酵母能对所分泌的蛋白
进行翻译后加工,包括前体蛋白的成熟;二硫键的重
建;蛋白构象的正确折叠和适度的糖基化修饰,使所
表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白。此
外表达的糖蛋白,经高尔基复合体对蛋白糖链剪切,
使表达蛋白的外链不含 α-1,3-甘露糖,避免了像酿
酒酵母一样的免疫原性问题,使表达的糖蛋白更适
于治疗用途[10,11]。
5 影响外源蛋白表达的因素
5.1 启动子的影响
启动子在转录水平上调控基因的表达。常用的
启动子是 AOXI启动子,有人曾用过 PDAS(二羟丙
酮合成酶基因启动子),但不及 AOXI对外源基因的
驱动强度高。PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是
最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启
动子,在它的控制下 β-LabZ基因表达率比甲醇诱
导下的 PAOX驱动的产量更高,而且该组成型启动
子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产
量更高,将成为 PAOX1启动子最有潜力的替代者。
5.2 目的基因的特性
目的基因的特性是决定表达成败的首要因素。
许多高 A+T含量的基因由于成熟前终止而不能
有效转录。特定的 A+T富含区可作为多腺苷酸或
转录终止信号,导致仅产生低水平或截短的 mRNA
[12]。某些稀有密码子,尤其是稀有密码子密集区往
往成为制约翻译速率的因素。目的基因特性对表达
的影响被认为是一种具有种属特异性的现象。在某
些情况下,可通过定点突变去除成熟前终止结构域
和替换稀有密码子。如果基因中存在大量 A+T富
含区和稀有密码子密集区时,常需要进行全基因合
成,使编码序列更符合巴斯德毕赤酵母密码子偏爱
性和有更高的 G+C含量[13]。
5.3 基因剂量
蛋白表达的优化往往涉及多拷贝表达株的筛
选。含多拷贝整合表达盒的菌株常比单拷贝者表达
量高,但情况并非总是如此。巴斯德毕赤酵母 表达
载体在染色体上大多为单拷贝整合,但基于整合的
稳定和 AOX1启动子的强启动性,一般单拷贝也可
能获得较高的表达水平。如含单拷贝乙肝表面抗原
(HBsAg)基因的表达株可获得 0.14g/L的产量[14]。多
拷贝整合则有利于充分发挥巴斯德毕赤酵母的表
达潜力。最近的研究表明,在 1～8整合拷贝数范围
内,HBsAg表达量随基因剂量的增加而成比例升
高。表达载体整合入染色体的两种方式产生多拷贝
重组子的概率不同。位点特异性单交换引起的多拷
贝基因插入比在两个独立单位点发生双交换产生
多拷贝基因的概率高,大约为 1%～10%。所以选择
单交换整合方式更有利于筛选多拷贝重组子。获得
多拷贝重组子的主要方法有:在体外利用同尾酶向
载体中多次插入首尾相连的表达盒;利用含巴斯德
毕赤酵母 his4基因和细菌 Tn903kanr基因的表达
载体,根据 G418抗性水平与 kanr拷贝数的正相关
性,筛选到高拷贝重组子[15];利用含细菌 Shble基因
的表达载体,根据 zeocin抗性水平与 ble基因拷贝
李志龙等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 11
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数的正相关性,筛选到高拷贝重组子。ble基因很小
(375bp),可作 E.coli和巴斯德毕赤酵母的筛选标
志;利用 DNA分析方法检测外源 DNA含量,提高
筛选效率[16];将目的基因两端连上宿主 rDNA的非
必需片段,通过同源重组整合于大量的 rDNA重复
单元中,以获得高拷贝,此法见于酿酒酵母表达系
统[17],在巴斯德毕赤酵母中有可行性。基因剂量与
表达水平的关系取决于特定的外源蛋白。所以在获
得多拷贝重组子的基础上,要进一步筛选确定因具
有合适拷贝数而显示最佳表达水平的菌株,亦即高
表达菌株的筛选应以表达的蛋白量为最终标准。可
利用 SDS-PAGE、菌落免疫印迹和活性分析等方法
检测目的蛋白的表达水平。
5.4 遗传背景的影响
多种宿主菌株中,一些转化子是 muts表型,另
一些转化子主要是 mut+表型。哪一种表型对外源蛋
白的表达量更高,对每一种蛋白而言是不确定的,因
此在 mut+菌株中表达水平较低时,可以尝试用 muts
表型来表达。
5.5 蛋白质分泌的影响因素
影响蛋白质分泌的关键因素是目的基因序列
本身。一般不能分泌的蛋白很难使其分泌。信号肽
也是影响分泌表达水平的重要因素。有些蛋白用其
自身的信号肽序列即可在巴德毕赤酵母中成功表
达,如人血清白蛋白、酵母转化酶等分泌蛋白。如果
蛋白自身信号肽序列效果不佳,可以尝试用酿酒酵
母的 α-交配因子(AMF)的信号肽序列,其对小分子
肽尤其有用,如:抑肽酶、表皮生长因子、凝血因子、
胰岛素。在 α-交配因子和目的基因之间插入一个
间隔肽(spacerpeptide)可以提高外源蛋白的表达水
平。ThomasK将编码 10个氨基酸连接肽的序列插
入到 α-交配因子与胰岛素前体基因之间,使胰岛
素前体在毕赤酵母中的表达提高了 3倍[18]。中科院
上海生化所也作过类似的研究,使胰岛素前体的表
达量提高了 2倍[19]。
5.6 影响蛋白质稳定性的因素
有些蛋白质,尤其是小分子肽易于受蛋白酶(多
在中性 pH条件下产生)的影响。这时可以用非缓冲
培养基 (MGY,MM)。由于随着毕赤酵母在非缓冲
培养基中的不断表达,pH降到 3或更低,使得许多
中性 pH蛋白酶失活。毕赤酵母能在低 pH生长。另
外,有报道在 pH6.0的缓冲培养基中加 1%的
Casaminoacids可以抑制细胞外蛋白酶,使得鼠表皮
生长因子的产量提高[20]。还可以用确定最佳发酵时
间来减少蛋白酶的水解作用,使产出时间比达到最
佳。若上述方法仍不能有效抑制蛋白酶对表达产物
的水解作用,可以尝试蛋白酶缺陷株,如 SMD1168
作宿主菌进行表达。
5.7 重组转化子的筛选
为获得高表达菌株,需要对大量的转化子进行
筛选。传统筛选高拷贝转化子的方法有 SDS-PAGE、
免疫杂交检测蛋白产物水平来间接检测基因的拷
贝数,或用 DNA探针杂交直接检测拷贝数,目前多
采用 PCR方法来检测 DNA的含量。Invitrogen公司
最新发展的质粒 pPIC9K上带有 G418的抗性基因,
可以通过转化子对 G418抗性水平快速筛选高拷贝
转化子。小量摇瓶试验是筛选转化子简便而有效的
方法,但是摇瓶培养的巴斯德毕赤酵母表达外源蛋
白的水平往往不能准确反映发酵罐中的情况,因为
摇瓶培养液的 pH值无法控制,培养物的通气不充
分及无法控制添加碳源的最适速率。目前一种
SCM摇瓶技术(shakenceramicmembraneflask)比普
通摇瓶发酵更接近于发酵罐发酵,可以使外源蛋白
的表达比普通摇瓶发酵提高 2.6～10倍,因而对重组
转化子的筛选更为有[21]。
5.8 发酵条件的影响
通气量是影响表达水平的重要因素。用发酵罐
进行培养,外源蛋白的表达水平一般要比普通摇瓶
发酵高出 10～100倍。用毕赤酵母表达胰岛素前体,
在摇瓶发酵时为 40mg/L,而在 10L的发酵罐中的
表达水平是 250mg/L[22]。郭永志等用毕赤酵母表达
系统表达重组胰岛素原,发现相同体积的培养液,
用发酵罐表达外源蛋白的产量比摇瓶中的产量提
高 5～10倍[23]。主要原因是普通摇瓶发酵的通气不
理想,影响了菌体的高密度生长及表达。大多文献
报道的表达水平都是摇瓶发酵条件下的结果,因此
用发酵罐进行培养,表达水平还会有上升的空间。
碳源也是影响表达水平的重要因素。毕赤酵母表达
培养基常用的碳源是甘油,但甘油对 AOX启动子
有抑制作用。甘油的添加量也影响外源蛋白的表
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达,甘油添加的最适水平应该是在利用甲醇诱导时
能够被消耗殆尽。甲醇诱导的方式、用量、诱导时间
都会对源蛋白的表达水平产生影响。现在一般用甘
油培养使细胞达到一定的浓度,再加甲醇诱导的两
步法来表达外源蛋白。而 Ohashi等证明两步法是
诱导甲醇酵母高水平表达外源基因的好方法,比普
通产率高出 10倍[24]。以甲醇作为诱导剂诱导 AOX
启动子驱动外源蛋白的表达和蛋白酶的表达,因此
甲醇添加量对外源蛋白的表达会产生影响,一般添
加量为 0.5%～1%。诱导时间也是影响因素之一,
诱导时间应该在 5d左右,外源基因的表达才能达
到最高,而有些菌表达时需要诱导 7天以上,过短的
时间(3d)表达量很低,过长的时间外源蛋白的降解
增加,因此寻求一个最佳产量时间比就特别重要。
诱导外源蛋白表达时的起始 pH可能是影响巴斯
德毕赤酵母高效表达重组蛋白的关键因素之一,通
过改变诱导时的 pH值,可使表达量提高[25]。在培养
基中添加特殊的营养物质,也能提高一些蛋白的表
达水平。
6 展望
迄今已有 200多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵
母中获得表达。但也有许多蛋白表达不理想,甚至
不能表达。因此选择巴斯德毕赤酵母作为表达体
系,要实现目的蛋白在巴斯德毕赤酵母中的成功表
达并兼顾其实用性和安全性,必须充分考虑影响表
达的各种因素并采取相应的有效优化策略,对表达
的条件进行优化,从而达到高水平的表达。随着人
们对甲醇营养型酵母分子遗传学研究和认识的加
深,以及巴斯德毕赤酵母表达系统发酵工艺的不断
完善,人们会利用巴斯德毕赤酵母表达系统生产出
更多更好的来自动植物和微生物及人类的活性蛋
白。巴斯德毕赤酵母表达系统也将在真核表达产品
产业化和商业化进程中发挥越来越大的作用。
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