全 文 ：第 3 。卷 第 1期
199 1年 8 月
复 旦 学 报 (自然科学版 )
Jo ur u al o f Fu d an Un i v’e r ` i t y (入协t ur al 氏i e n .)
V o l
.
3 0 N o
.
1
Mar
.
19 9 1
紫参的遗传转化及外源基因的表达 ’
周 中一 * l邹高治l
(遗 传 学 研 究所)
提 要
以根癌农杆菌所携带的重组 T i 质拉为载体 , 对植物紫参的叶片、 叶柄和茎
段等不 同组织进行 了转化研究 . 结果表明 , 转化的植物组织在选择性培养墓上
可产生不定芽 , 并再生成出完整植株 . 再生植株的叶片在选择性培养基上仍可
正常生长和再生 , 在合适的条件下 , 转化频率可达到 16 . 4% . 转化植物及其后
代的卡那霉素抗性和章鱼碱类产物的存在表明 , 外源墓 因已转入受体植物细胞
内 , 并能在转化植物内稳定表达 . 结果还表明 , 最初的转化植株起源于转化细胞
而不是嵌合体 .
关健词 : 根癌病土壤杆菌 , 外源墓因 , 遗传转化 ,紫参 .
卜
0 引 言
紫参是一种常见的经济植物 ,有很高的药用价值 . 为提高其有效成分的含量 , 改善其
生长特性 ,对其进行遗传转化方面的研究 , 无疑具有很大的意义 . ” 以 T i 质粒为载体 , 通过
根癌农杆菌介导的基因转移 , 已被证明是一种极为有效的植物遗传转化方法川 、
T主质粒是根癌农杆菌所具有的染色体之外的遗传物质 . T i 质粒上带有能使被转 化
植物发生肿瘤的各种必需基因 slL . 当根癌农杆菌侵染植物时 , T主质粒上的一段可转移区
域即 -T D N A ,转移到受休植物细胞内 , 并整合到植物核基因组内〔 . J , 使受体植物细胞发
生转化 . 这种细菌和宿主植物之间的关系 , 构成了一种天然的植物基因转化系统 . 有确
切的证据证明 , 叭 D N A 的转移功能仅和 T i 质粒中 V ir 区域以及 T 一 D N A 的边界区有关 , 致瘤基因的切除并不影响茸转移功能“ ,们 . 根癌农杆菌的宿主范围极广 , 它可以有效
地感染大部分双子叶植物 .1t 和某些单子叶植物71[ . 所以 , 已切除致瘤基因的重组 T i 质粒
能被改造成多种多样的表达载体 , 广泛应用于各种月的基因的转移研究 . 木文首次报道
了用带有嵌合的新霉素磷酸转移酶 ( N P T l l) 基因的重组 T孟质粒对紫参的转化 , 并检侧
了外源基因在转化植物中的表达结果 .
收稿 日期 : 19 0 年 6 月 15 日 .
.
二
国家自然科学基金资助课题 .
1985 级硕士研究生 .
卜
DOI : 10. 15943 /j . cnki . f dxb -jns . 1991. 01. 012
第 1期 周中一 、 邹高治 :紫参的遗传转化及外源基因的表达
1材料和方法
1
.
1植物材料及其组织培养
紫参 (肋乙廊。 c h侃。。 钻 B e n t h)无菌苗 , 由本校环境与贺源生物学系倪德祥老师惠哟 .
选择生长旺盛 ,具深绿色光泽的叶片作为外植体 , 在添加了 。 . 5 p pm 6 B A (细胞分裂素 )
和 0 . 0 5 P Pm N A A (生长素 )的 M S 培养基上扩增 . 在 2 6 士 1 0 0 , 1 0O l u x ( 1 2 h / d )条件下
培葬一星期后 , 叶片边缘和伤 口处开始长出不定芽 . 待芽长出 3或 4 片真叶后 , 切下转到
、
~ ~ 一 ` . _ ` , ` ~ . 。 ~ ` : , . _ 1 , , 。 , 、 一 一 . 、 , ~ . , ~添加了 。 · 1 p p巩 6B A 和 1 · 0 p pm N A A 的去M S 培养基上诱导生根 .. , 八 ” “ ` 一 ` 一 . r ’ 毛 ` ” , 2 一 曰 尹 ’ ~ 一 ~ , 一 ’ ~ .1 . 2 菌株和质粒菌株 : 大肠杆菌 M C l o 6 1 ,根癌农杆菌 ( A夕r o 6a e云e , 叙。 t o gn e af e味e二: ) C s s c 一, r i f R .
质粒 : p G V 2 2 6 0 , A p R ; p G V 3 0 0 , A p R , S p / S m R .
农杆菌于 28 oC 在 Y E B 培养基上培养 , 大肠杆菌则于 3 o7 C用 L B 培养基培养 .
1
.
3 紫参组织的体外转化
将处于指数生长期的根癌农杆菌滴入不含激素 的 M S 培养基 中 , 调 到终 浓 度 为
5 x 1 0 7~ 1 x 1 .0 个细菌 /m l , 然后选择具有 6~ 8 片真叶的紫参无菌苗 , 将其叶片剪成约
( 5 、 考)m斌的小片 , 叶柄和茎剪成 8二二 长的小段 . 把剪好的叶片 、 叶柄和茎段均漂浮在
上述含农杯菌的 M s 。 (无激素 )培养基液面上 , 培养于 26 oc , 使细菌从植物伤 口处感染组
织 . 经不同时间培养后 , 取出这些组织 , 在无菌的滤纸上吸干 , 再用添加了氨节青霖素
(1 m g/ m l) 和氨唾肘头抱菌素 (1 m g /m l) 的M oS 培养基冲洗数次 ,然后铺在含有 50 0 协g l/ , I
氮鹰肪头抱菌素 、 o · 5 p p m 6B A 和 O · 0 5 p p m N A A 的 M S 固体培 养基 上 , 在 26℃ ,
1 0 0 卜往 光照 ( 12 h / d) 条件下培养 . 在这种无选择压力的条件下 , 转化细胞的生活力和
分裂能力均得到加强 。 三天后 , 把这些材料转移到选择性培养基上 (添加 50 协g/ m l 卡那
霉素 ,其他成分同上 ) , 每星期转接一次 . 从第三次转移开始 , 培养基中氨啤肪头抱菌素
的浓度减到 2 0 0 料g加 1 . 未经农杆菌感染的植物材料也经上述处理 ,作为对照 .
1
.
4 转化细胞的植株再生
经过转化处理 的植物材料 , 在选择性培养基上培养 10 d 左右 , 叶片边缘和叶柄两端
劲叻血现不定芽一 约 1“ 个星期后 , 将长有 4一 6 片真叶的芽从茎的根部切下 , 转移到生根
培养塞上 ,诱导根系发生 ,成为完整植株 .
1
.
5 转化植株的鉴定
1
. 转化株组织在选择性培养基上的不定芽诱导
为了验证前面所得到的转化株是否真起源于转化细胞 , 剪下转化植株各部位的叶片
和叶柄 , 在含有卡那霉素的选择性培养基上 , 进行不定芽诱导和植株再生 , 观察转化植株
的后代是否仍具有转化的性状 . 以野生型的紫参材料作为对照 .
2
. 章鱼被测定
pG V肋O中有作为双重标记的章鱼碱合成酶基因 . 用类似于 Ot t en 的方法内 , 对转
复 旦 学 报 (自然科学版 ) 第 3 0 卷
化植株及其后代进行了章鱼碱测定 . 为了增加转化植物中章鱼碱的浓度 , 被测植物预先
被置于添加了精氨酸 ( 2 0 0 “ g /m l) 和丙酮酸 ( 5 0 0 卜g /m l) 的 M S 液体培养基中培养 Z .d
2 结 果
2
.
1 最适转化条件的确定
实验中主要考察了植物各部分组织对农杆菌侵染的反应 、 细菌与植物受体混和培养
的时间及转化后的强化处理对转化结果的影响 . 表 1 和表 2 的结果表明 : 在植物组织水
平的转化中 , 虽然人们大多以叶片作为转化材料 , 但对紫参来说 , 却是幼嫩茎段的转化奴
率比较高 , 在 10 m in 到 48 h 的培养时间范围内 , 紫参组织与农杆菌混合培养的时间与
转化效率呈正相关性 , 说明适当延长混合培养的时间 , 对细菌侵染组织是有益的 , 但从统
计学角度讲 , 这方面的差异并不十分显著 ,转化后的强化处理有利于增强转化细胞的存活
力和分裂能力 ,而使转化频率提高 (表 3 ) .
组织
表 1 紫参不 同组织的转化须率 1)
材料数 (块 ) 转化子数 (块 ) 转化率 (劣 )
叶片
叶柄
茎段
6
。
6
2
。
8
16
.
8
90自737864土`
l) 转化条件为混合培养 48 h , 经强化处理 .
表 2
实验序号 培养时伺
混合培养时问对紫参转化频率的影响且,
材料数 (块 ) 转化子数 (块 ) 转化率 (侣 )
6325肠
Jl
1 0 m i n
22 h
曦6 h
8
.
2
6
.
6
16
。 么
O曰I 79n`
l) 经强化处理 ,倪合培养时用 i X( 幻 lu x 光照 .
表 3 转化后的强化处理对转化细率的影响幻
实验序号 强化处理 材料数 (块 ) 转化子数(块 ) 转化率( 男 )
6
.
4
16
.
7
Oé
3
,土1山,几3Ré兑甘2
l) 棍合培养 48 h , 1 。刃 lt x 光照 .
2
.
2 正常植株与转化植株的生长特性及再生惰况比较
在非选择性培养基上 , 正常植株与转化植株的组织均能够经不定芽途径生长 . 再生 .
在含卡那霉素 ( 6。 卜g /m l) 的选择性选培养基上 , 正常植株的材料很快枯萎 、 死亡 , 若外植
第 i期 周中一 、邹高治 :紫参的遗传转化及外源基因的表达
体中有胶芽存在 ,则往往可以先存活并生长一段时间 ,但在继代培养过程中仍逐渐枯姜而
死 ; 转化植株的各种组织如叶片、 叶柄和茎段则能够正常生长 , 形成不定芽 (图 1 ) , 转到生
根培养基上可长出根系 , 再生成完整植株 (图 2) . 以转化株的后代与正常株的生长状况
相比较 , 仍存在上述差异 (表 4) .
表 4 正常组织与转化组织不定芽的诱导率比较
非选择性培养基
材料块数 不定芽数 , ’ 频率 (绍 )
选择性培养基
材料块数 不定芽数 , ’ 频率 (侣 )
n,山
8
门人弓13OU正常组织
转化组织
2 9
8 4
93
.
6
92
.
3
3 7
103 7 8
.
6
i ) 不定芽数是指长出不定芽的外植休块数 .
图 1 正常组织与转化组织的生长特性比较
饭 在选择性培养基上正常组织不能生长 (左 ) , 而转化组织生长正常(右 ) ,
权 在非选择性培养墓上正常组织 (左 )和转化组织 (右 )均生长正常
` b g 胜
图 2 转化植株的再生 图 3 转化子中章鱼碱检测的纸电泳结果
` . 标准章鱼碱 ; l, .h 未转化的正常组织 ;
仇 d . 转化植株组织 ; e~ 9 . 转化株后代杭株组织
2
.
3 转化植物中章鱼碱的检测
纸电泳结果 (图 3) 表明 , 紫参转化株及后代中均有章鱼碱类产物存在 . 图 3 给出了
两个转化株以及三个后代植株的电泳图谱 , 而对照组均为阴性 . 说明外源的章鱼碱 合成
酶基因确已转移到转化株细胞内 , 并能在转化细胞内正确衷达和稳定地传给后代 .
复 且 学 报 ( 自然科学版 ) J` 24 第 3 0 卷
3 讨 论
实验中采用的中间载体 p G V3 0 起源于章鱼碱型的 p T i , 其 -T D N A 中除左右边界
区以及章鱼碱合成酶基因 ( O C S ) 外均被切除而置换上嵌合的 N P T l 基因 、 H P T 基因
( H gy or m cy 恤 抗性 ) 以及在细菌中表达的 S p / S m R 基因 . 由于 0 0 5 基因的存在 , 给转
化实验带来了益处 : ( 1) 与用 N P T l 作为筛选手段相比 , 野生型植物中章鱼碱本底含量
要低得多 , 以章鱼碱的存在作为转化的标志 ,很少会受到假阳性的干扰 , ( 2) 纸电泳的操作
比同位素标记的分子杂交要简捷得多 , 在没有特殊要求的情况下 , 可不做分子杂交而仍然
能得到可靠的结果 .
在转化细胞培养的最初阶段 , 由于选择压力的存在以及转化细胞的密度太低 ,转化细
胞往往不能正常分裂而降低了转化频率 . 所以在转化实验中 , 人们常采用各种措施来避
免细胞因密度太低而死亡的间题 .[J . 常见的方法有看护培养 、 添加细胞抽提物等 . 在本
实验中 ,转化组织先被置于无选择压力的培养基上培养 ,使转化细胞得到生活力的强化处
理 ,这也是一种挽救措施 . 从结果来看 ,这种处理对提高转化频率明显有利 .
用叶盘法进行遗传转化实验 , 除了操作简便 , 实验周期短之外 , 主要的优点还在于其
培养要比原生质体 、 单细胞方便得多 , 但有一个重要的限制因素使得该方法在应用上存
在局限性 , 即在进行组织水平转化时 , 得到的转化子中可能混杂有嵌合体 lo[ 〕 . 一般认为 ,
从叶片外植体得到的再生植株起源于单细胞 l[ 卫〕 , 但转化可能发生在芽原基的分化发育过
程中 . 结果是不定芽中仅部分细胞起源于转化细胞 ,而另一部分细胞则起源于正常细胞 .
另外 ,也可能由于细胞间存在着的流通作用使得正常细胞在附近转化细胞的影响下 ,在选
择性培养基上分化出不定芽 . 所以 ,通过叶盘法转化得到的转化株 ,若不经过反复检测的
话 ,就很难被排除是嵌合体的可能性 . 在本实验中 , 由于转化频率比较高而得到了较多的
转化株 ,故能够对结果进行反复检脸 . 从各个转化株的不同部位分别取样检测章鱼碱 ,纸
电泳结果表明均有章鱼碱存在 . 另外 , 在选择性培养基上诱导转化株及其后代的叶片产
生不定芽时 , 也有愈识地从各个转化株的不同部位取材 , 结果发现 , 它们均能以较大频率
诱导出不定芽 . 在选择性培养基上不能萌发的那部分材料 , 在来源上并没有植株或部位
的专一性 , 完全是随机的、 这很可能是因为外源基因表达水平上的差异或操作上的误差
所引起的 . 因此 , 我们认为 ,这些转化株是起源于转化细胞而不是嵌合体 .
时倪德祥老师在植物材杆上给予的大力支持和汪训明老师在实验过程中给予的启发
帮助 ,作者谨此致谢 .
参 考 文 献
[ 1 〕 刘涤 . 植物生物工程学的发展成就和前景 . 生物科学动态 , 19 87 , (4 ) : 1~ 8 .
「2 〕 朱群 . 植物冠痪瘤发生的分子基础 . 桂物生理通讯 , 19 85 , ( 1 ) : 1~ 7 .
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.
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第 1 期 周中一 、邹高治 : 紫参的遗传转化及外源基因的表达 7 5
, . . . . , , . . . 曰甲 . . . . 一 . 加口 . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ . . ~
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198 2 , 7 9 ( 2 0 ) : 6 32 2~ 6 32 6
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[ 6 〕 M` “ L M , C o o k叮 D A . iB o l o盯 o f 人 g r o b a “ t“ r i u m T u m e f a “ i e , : s : p la , , t l ,l t o r a o t i o , 1· I ” 云
价 ” 口, t o己, 1 98 1 , uS p p l 13 , 15一 4 6 ·
t 7 〕 肠叮 k a s V S , e t a l . E x p r e s s i o 。 。 f T i p l a om i d G e n e s i n M o n 0 0 0 t y lde o n o n o p l a n t , 1 1、 f e o tde
W it h A盯ob a o ter i u m T u . Oaf oien 氏 N a t” r e , 19 84 . 3 11 ( 5 988 ) : 7 6 3~ 7 64 ·
[ s 〕 o t恤 L , 氏 ih l p o r o o r t R A , A R a l、 , 1 叭工i o r o : 。 a l e M et h o d f o r the G e t e o t i o n o f L y s o p i , 、 e a u d
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a l ien 工地hy d r o郎 n a o e A e t i v i t te s . B `o “ h e o B ￡o夕儿夕5 A e t a , 19 78 , 52 7 ( 2 ) : 4 97一5 0 0 .
{ 。 〕 H o r s e h R B , J o n e s G E . A D 6ub l e F i lt e r p a p e r eT o hn i q ue f o r p l a t l n g C u l t u r喊 p l a t l t C o l l , .
I ” . ` t r o , 19 30 , 16 ( 2 ) : 1 03~ 108 .
t l o〕 L a 。 : 10 M a rt o n . T r a n s f o二 a t i o n o f T ob a 。。 0 C e l l , b y C o e ul t u r e W i t h A g r ob a o t o r i u m T u l n o ·
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A ca d e m i o P er s吕 I n e 一 1 9 8 4
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5 14一 5 2 1 .
[ 1 1〕 T ar o T ab n h V a n K . C o n t r o l o f M o r p h o ge n e s i , b y I n h e r e n t a n d E x o妙 ,、 o 。 , l y A p p l l喊
f铸。 t o r 3 i x、 T h i n C e l l l a y e r s . I ” t乙R e ” C , t o l, 19 80 , S u p p l i 1A : 175~ 1 94 .
S T U D Y O N G E N E T I C T R A N SF O R M A T IO N IN S a l ` 艺a e人i n e n s i s
B E N T H A N D EX P R E S S I O N O F EX O G E N O U S G EN E
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. 切 d i e d w 主t h r e e o m b i x l a n t T i P l a s m i d . D i f f e r e n t P a r t s o f t h e P l a n t s u e h a s l e o v e s ,
P e t i o l e s e g m
e n t s a n d s t秘 s e g m e n t s W e r e u s e d i n t h e t r a n s f o r m a七j o n . T h e T i P l a s -巨 i d e o n土a i n e d N P T 1 1 g e n e e o d丈n g f o r n e o m y e i n Ph o s p h o t r a n s f e r a o e a s w e l l a 。
o e t o P i n e o y n 七h e t a s e g e n e ( o e s ) u s e d a s t h e s e r e e n i n g 功 a r k e r . T h e t r a n s f o r m e d
p运 n 七 t i o s u e s P r o d u e e d a d v e n t i t i o u s b u d s a n d f o r m e d w h o l e P l a n t o n t h e s e l e e t i v e
扭 e d iu m . T h e l e a f d i s e s o f t r a n s g e n i e P l a n七 a l s o g r e w a n d r e g e b e r a t e d n o r 功 a l l y o n
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毛勿n ht e d i f f e r e n 七 P a r t s o f t r a n s g e n i e P la n t s s h o w e d t h a七七h i s P l a n t s w e r e o r i g i n a -
加 d fr o班 七r a n s f o r m e d e e l l s b u t on t t h e e h im e r a .
K盯 wo r d s : 助 , o乙a e t e , 伽。 t。 。 e f a c落e。 , e x o g e n o u , g e n e , g e n e t i e t r a n s f o r am -
名i o n , 从名公落a e h落几。舫血 B e n t h .