全 文 ：应用 A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体
周华蕾 吕茂民 王娜 刘子 章金刚
(军事医学科学院输血医学研究所,北京 100850)
摘 要: 应用 Pro tein A 亲和层析法, 从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体, 用 SDS-
PAGE 和 ELISA 法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价, 结果显示,电泳为两条带, 分别为免疫球蛋白 G
( IgG)的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯, 应用间接 ELISA 法测定腹水效价为 1 10- 7左右, 与
未纯化前无差异。结果表明,应用 A 蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体, 适用于高纯度单克隆抗体
的制备。
关键词: A 蛋白 纯化 单克隆抗体
Purification of Monoclonal Antibodies Using Protein
A Affinity Chromatography
Zhou Hualei LMaom in Wang Na Liu Zi Zhang Jingang
( I nsti tute of T r ansf usion Med icine , A MMS, Be ij ing 100850)
Abstract: The antibodies agaist human blo od clotting facto r Ⅶ were purified by using affinity chromato gr aphy
wit h pro tein A sepha rose CL-4B. The titers and purit y of the pur ified monoclonal ant-i FⅦ w ere det ermined by ind-i
r ect ELISA and SDS-PAGE respect ively. The result of SDS-PAGE had reached t he srandard of electr opho retic pur-i
ty . T he titers of the purified antibody in ascetic f luid w ere about 1 10- 7 by indir ect EL ISA. T he results indicated
that the antibodies of higher purit y had been prepar ed by using pr otein A af finity chr omato gr aphy , w hich w ere fit
for t he preparat ion highly purified monoclonal antibodies.
Key words: Protein A Pur ification M onoclonal ant ibody
A蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白, 分子量为 42KD,有 6个不同的 IgG结合位点。其中有 5个位点
对 IgG的 Fc片段显示很强的特异性亲和力, 不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA, IgM, IgE 也可能结合
在配体上,当达到饱和时,一个 A 蛋白分子至少可以结合两个 IgG分子。A 蛋白对 IgG 有高亲和力和特异
性,这一特点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上清中的单克隆抗体(简称单抗)。
本课题组制备了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体的细胞株,并诱生腹水。抗体的免疫球蛋白类别为 IgG, 亚类
为 IgG2a。作者用 Pro tein A- Sepharose CL-4B亲和层析柱分离纯化了腹水。并对纯化后的单克隆抗体进行
鉴定。结果表明,用 Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析柱分离提纯 IgG,方法简便快捷,分离后的 IgG纯
度高,特异性强,便于后续工作的进行。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂及仪器
抗体为分泌抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体的细胞株诱生的腹水,由本室制备。Pro tein A-Sepharose CL-4B
及 Sigma 3K18离心机为美国 SIGMA 公司的产品。AKT A explorer100为瑞典 Pharmacia公司产品。高压
收稿日期: 2005-08-10
基金项目:军事医学科学院创新基金资助项目
作者简介:周华蕾( 1975- ) ,女,硕士,研究方向:血液生物制品及其病毒安全性
通讯作者:章金刚,电话/传真: 010-68164971; E-mail: zhangjg@ nic. bmi. ac. cn
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
电泳仪为江苏丹阳无线电一厂产品。其余试剂及材料为国产。
1. 2 方法
应用 Protein A-Sephar ose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体, AKTA explorer100进行监测。
1. 2. 1 腹水的处理 取腹水,在 4 , 12 000g 条件下离心 15m in,以除去较大的凝块。
1. 2. 2 装柱 将 1. 5g Protein A-Sepharose CL-4B 干粉用 6~ 7ml 三蒸水溶解, 再用 0. 02M , pH 7. 4 的磷
酸盐缓冲液(上样缓冲液)浸泡 15min,然后装入层析柱中。
1. 2. 3 平衡 用 10倍柱床体积的上样缓冲液过柱,流速为 1m l/ min, pH 试纸测试流出液体的pH 为 7. 4。
1. 2. 4 上样 取预处理过的腹水 5ml, 用上样缓冲液稀释至 50ml, 用 0. 45m 的滤膜过滤, 上样, 流速为
1ml/ min。
1. 2. 5 洗脱 用上样缓冲液进行流洗, 10倍柱床体积,流速为 1ml/ m in。随后用 0. 02M, pH 4. 0 的柠檬酸
缓冲液洗脱抗体,同时应用 AKTA explorer100进行监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时, 取干净
的 4ml离心管收集, 每收集 3ml后, 立即用 1M , pH 9. 0的 T Ris-Hcl缓冲液调整 pH 值至 7. 0。
1. 2. 6 平衡 收集洗脱液至洗脱峰回到基线后, 继续用上样缓冲液平衡 5~ 10倍柱床体积,流速调至 1m l/
min。再用三蒸水平衡 10倍柱床体积。
1. 3 电泳鉴定
采用 SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE) ,浓缩胶和分离胶浓度分别为 120g/ L 和 50g/ L , 每槽
加样 10l,考马斯亮蓝 R250染色。具体操作见参考文献[ 1] 。
1. 4 活性检测
应用间接 ELISA 法测定效价。
2 结果
2. 1 Pro tein A-Sepharo se CL-4B柱层析
应用 AKT A explo rer100监测分离纯化色谱图(图 1) ,上样时所监测到穿透峰的 280nm 波长 OD值为
800AU 左右, 洗脱时得到一个洗脱峰, 此峰最大的 280nm 波长 OD值为 3 300AU ,此值远远大于穿透峰值。
2. 2 SDS-PAGE 鉴定结果
5倍稀释腹水的 SDS-PAGE 结果为多条带,纯化后的 IgG只有两条带,上下两条带分别为 IgG 2a的重链
及轻链(图 2) ,分子量分别是 50kDa、26kDa, 与理论值相符合。
图 1 Protein A-Sepharose CL-4B层析图
横坐标:时间( min) 纵坐标: 280nm 波长 OD
值( mAU ) 峰 1:穿透峰; 峰 2:洗脱峰
2. 3 纯化后的免疫活性
应用间接 ELISA 法,检测纯化前腹水的效价为 1 10- 6 ~ 1
10- 7 , 纯化后的效价仍维持在 1 10- 7左右。
3 讨论
1975年, Kohler 与 Milstein 成功地建立了单克隆抗体的制备
技术。近年来, 单克隆抗体技术已成为生命科学研究的重要手段,
在基因和蛋白质的结构和功能研究方面具有不可或缺的作用。
由小鼠杂交瘤所分泌的单克隆抗体类型与小鼠血清的免疫球
蛋白相同,常见的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白类型是 IgG、IgA、
IgM, 其中 IgG包括 IgG1、IgG 2a、IgG 2b及 IgG 3 4个亚类。腹水中除
了单克隆抗体成分外,还含有大量杂蛋白。在大多数情况下, 为了满足单克隆抗体在科学研究领域中的需
要,对细胞培养上清或腹水中的单克隆抗体需进行纯化。纯化单克隆抗体的方法多种多样, 主要有以下几
种: 1)盐析法,如硫酸铵盐析法[ 2] 、辛酸-硫酸铵盐析法 [ 2] ; 2)离子交换层析, 如羟基磷灰石层析[ 3] ; 3)亲和层
析:如 A 蛋白亲和层析、G蛋白亲和层析、免疫亲和层析; 4)凝胶过滤; 5)疏水层析; 6)高压液相层析等 [ 4]。
732005年第 5期 周华蕾等:应用 A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体
图 2 纯化 IgG的 SDS-PAGE鉴
定结果
a:标准蛋白 marker b:纯化的 IgG 2a ,
上下两条带分别为免疫球蛋白( IgG2a )
的重链及轻链 c: 5倍稀释腹水的条带
Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法的原理是, A 蛋白可与 IgG
上的 Fc段特异性地结合,与小鼠 IgG的各亚类表现为不同的结合力, 结
合的强弱程度依次是: IgG 2a> IgG 2b > IgG3 > IgG 1。A 蛋白的这种结合
也是具有 pH 依赖性的,即可利用改变 pH 及离子强度, 纯化与其结合较
弱的 IgG 1 [ 5]。这种亲和层析法适用范围很广, 可用于抗体的分离纯化,
实现一步法纯化单克隆抗体,所得到的抗体纯度很高。此外, 还可应用
于: 1)除去抗体液中的 IgG, 进行非 IgG类免疫球蛋白(如 IgM )的相关研
究[ 6] ; 2)除去胃蛋白酶或木瓜蛋白酶水解的 IgG 的 Fc段 [ 7] ; 3)回收或纯
化免疫复合物。A 蛋白亲和层析技术具有很多优点: 1)可以纯化小鼠
IgG的 4个亚类, 在一定条件下, 可以纯化人的 IgG; 2)实验操作方便快
捷,易于自动化连续工作, 可以少量制备, 也可以大规模生产; 3)纯化后
的单克隆抗体产率高,特异性强; 4) A 蛋白具有良好的再生性,其耐受低
pH 反复处理的性能极佳,可反复使用。若长期不用,则应保存于叠氮钠
或 20%的乙醇中, 4 存放。此项技术的主要缺点是该介质的价格昂贵。
本课题组制备的抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体的免疫球蛋白类别为
IgG, 亚类为 IgG 2a。适合采用 Protein A-Sepharo se CL-4B亲和层析作为
分离纯化抗体的方法。实验过程中应用 pH 7. 4的缓冲液,使 IgG 2a与 A蛋白结合, 应用 pH 4. 0的柠檬酸缓
冲液进行洗脱。实验结果显示,用 Protein A-Sephar ose CL-4B亲和层析柱分离提纯 IgG, 方法简便快捷,分
离后的 IgG纯度高,特异性强,并为后续工作的进行奠定了良好的基础。需要注意的问题是,在酸性条件下
洗脱的抗体必需立即中和到中性( pH 7. 0左右) ,以利于维持抗体的生物学活性,避免抗体失活。
参 考 文 献
1 萨姆布鲁克 J,弗里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T ,等著.金冬雁,黎孟枫,侯云德,等译. 分子克隆实验指南[ M ] .第 2版.北京:科学出版社, 1992,
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2 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法[ M ] .北京:人民军医出版社, 2000, 52~ 56.
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5 Brito Moren o AI, Acosta Bas C, Rod riguez M , et al . J H ybrid Hyb ridomics, 2003, 22( 6) : 393~ 396.
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7 L eon AD, Tellez Araiz a M , Arellano Garcia J, et al. J Cl in E xp Med, 2002, 2( 2) : 59~ 67.
74 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期