全 文 ：第26卷 第11期
2014年11月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 26, No. 11
Nov., 2014
文章编号：1004-0374(2014)11-1108-12
DOI: 10.13376/j.cbls/2014160
收稿日期：2014-10-02
基金项目：国家自然科学基金项目(31170739)；国家重点基础研究发展计划(“973”计划)(2010CB912201，
2013CB911001)
*通信作者：E-mail: kongdc@pku.edu.cn
真核细胞DNA复制叉稳定性维持机制的研究进展
刘　阳1，孙静亚2，孔道春1*
(1 北京大学生命科学学院，蛋白质与植物基因研究国家重点实验室，北京 100871；
2 浙江海洋学院海洋科学与技术学院，环境科学系，舟山 316004)
摘　要：DNA复制是细胞最基本的生命活动之一，是生物体生存和繁殖的基础。从原核生物到真核生物，
DNA复制过程基本保守，分为复制起始和延伸两个阶段。复制叉是 DNA复制的基本结构，它容易遭受多
种内源或外源的 DNA复制压力影响而停顿，导致基因组不稳定，引起细胞凋亡、癌变或细胞死亡等严重
后果。为了维持复制叉的稳定，细胞进化出了一系列机制，其中最重要机制之一便是 S期细胞周期检验点。
就影响 DNA复制叉稳定的内外因素、S期细胞周期检验点与复制叉稳定性的关系以及复制叉稳定性与相关
疾病的发生、治疗等问题进行简要综述。
关键词：DNA复制；复制叉；S期细胞周期检验点
中图分类号：Q343；Q75 文献标志码：A
The progress in the mechanistic studies of maintaining
replication fork stability in eukaryotic cells
LIU Yang1, SUN Jing-Ya2, KONG Dao-Chun1*
(1 The National Key Laboratory of Protein Engineering and Plant Genetic Engineering, College of Life Sciences, Peking
University, Beijing 100871, China; 2 Department of Environmental Science, College of Marine Science, Zhejiang Ocean
University, Zhoushan City 316004, China)
Abstract: Chromosomal DNA replication is one of the most fundamental biological events, all cell or organism
孔道春，北京大学生命科学学院、北大 -清华生命科学联合中心教授，
“973”项目首席科学家，现任全国酵母协会会长。孔道春教授长期从事
DNA代谢研究，包括真核细胞 DNA复制起始、复制叉稳定性维持、DNA
复制叉里的 DNA合成反应、DNA重组、DNA损伤修复及细胞周期检验
点 (checkpoint)调控等方面的分子机制研究。孔道春教授及其团队在真核
细胞 DNA 复制起始、DNA复制源的结构及起始位点的选择、 复制叉稳定
性的维持、复制叉里的 DNA合成反应－冈崎片段的成熟、DNA重组及双
链 DNA断裂修复等方面，有突破性的发现，相关成果将陆续发表。该实
验室的研究方向包括：(1)真核细胞 DNA复制起始的具体机制及其调控；(2)
真核细胞 DNA复制叉稳定性的维持；(3) S期细胞周期检验点在 DNA代
谢中的作用；(4) DNA损伤修复机制，如 NER、HR、dsDNA break repairs等；
(5)组蛋白修饰和染色体重构蛋白与 DNA损伤修复的关系等。
孔道春　教授
刘　阳，等：真核细胞DNA复制叉稳定性维持机制的研究进展第11期 1109
growth bases on DNA replication. From prokaryotes to eukaryotes, the basic processes of DNA replication are
relatively conserved and divided into two major events, DNA replication initiation and extension. Replication forks
are a basic structure of DNA replication and vulnerable to internal and external factors such as DNA lesion, high
order of chromatin structure, DNA secondary structure etc. These factors could cause fork pausing and fork
collapse, which subsequently results in genomic instability, cancer or cell death. In order to stabilize stalled forks,
cells have developed a series of regulation systems, one of which is checkpoint. This article will give a brief review
related to fork pausing, fork stabilization and checkpoint control.
Key words: DNA replication; replication fork; intra-S phase checkpoint
DNA是生命体最主要的遗传物质。生命的延
续在一定程度上表现为 DNA从亲代精确而完整地
传递到子代，这一过程依赖于 DNA复制 [1]。DNA
复制叉是真核生物 DNA复制的基本结构，它容易
受到体内或体外多种因素的干扰而暂时停顿，停顿
的复制叉容易垮塌，从而使得 DNA复制不完全，
影响基因组稳定性，进而导致细胞凋亡、死亡或细
胞癌变等严重后果 [2]。幸运的是，生物体已进化出
了一系列机制以维持复制叉的稳定，如细胞周期检
验点 (checkpoint)、DNA损伤修复、DNA同源重组
修复等，其中细胞周期检验点可能是稳定 DNA复
制叉最重要的途径。当细胞遭遇复制压力如复制叉
停顿时，细胞周期检验点调控复制叉稳定、调节细
胞周期进程，确保 DNA复制叉功能的完整，并促
使复制叉在复制压力解除时能快速而正确地完成
DNA复制。
本文主要讨论维持 DNA复制叉稳定性的具体
机制。首先，我们将阐释复制叉的基本进程以及影
响复制叉稳定性的内外因素。其次，我们将介绍 S
期细胞周期检验点在维持复制叉稳定性方面的一些
机制及目前在这方面的研究进展。最后，我们将讨
论复制叉稳定性与疾病治疗的关系。
1　DNA复制及复制叉
DNA复制是真核细胞在有丝分裂 S期过程中
发生的最重要的生物事件 [1,3]。真核细胞 DNA复制
起始发生在染色体的特定位点，即 DNA复制源
(replication origins) [1,4]。真核生物的 DNA复制源结
构在物种之间不保守。如在芽殖酵母 (S. cerevisiae)中，
其复制源平均长度为 100~150 bp，含有一个 11 bp
的保守序列，即 5′-(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)-
3′ [5-6]。而裂殖酵母 (S. pombe)的 DNA复制源为 500~
1 000 bp的DNA序列，它没有非常明显的保守序列。
但一般来说，它往往含有两段或以上富含 AT的不
对称序列，这些富含 AT的不对称序列在维持复制
源活性方面起着至关重要的作用 [7-9]。裂殖酵母
DNA复制源中含有 1~2个或多个 DNA复制源识别
复合物 (origin recognition complex, ORC)的结合位
点，除此之外，它还含有不被 ORC结合的必需序
列 [10-11]。最近，本实验室确定裂殖酵母 Sap1是一
个 pre-RC (pre-replication complex)的必需组分，它
结合到 DNA复制源特定的序列，并与 ORC相互作
用，协同招募 Cdc18 (Cdc6 在裂殖酵母的同源蛋白 )
到 DNA 复制源，直接参与复制前复合物 pre-RC
的形成 (未发表 )。在多细胞真核生物中，其复制
源平均大小为 1 000 bp左右，同样缺乏明显的保守
序列 [12]。最近，本实验室通过 CHIP-seq的方法，
在裂殖酵母和人细胞中已大规模确定其 DNA复制
源，为确定这两个物种，尤其是高等真核生物
DNA复制源的精细结构，奠定了基础 (未发表 )。
不同 DNA复制源的活性和强度各不相同，这决定
了其在 S期起始 DNA复制的效率 [13-14]。一般来说，
DNA复制源的数目远多于 DNA复制起始的数目。
因此，探索决定 DNA复制源强弱、是否在 S期起
始 DNA合成以及起始 DNA合成时间的因素将有
助于深入认识功能性复制源。尽管不同真核生物的
复制源结构特征差异显著，但 DNA复制的具体机
制在不同物种中基本上是保守的 [15]。
DNA复制过程主要分为两步：起始和延伸 [16]。
在 S. cerevisiae中， ORC蛋白首先识别并结合复制
源，作为 pre-RC组装的平台 [17]；然后募集 Cdc6和
Cdt1 (Cdc10-dependent transcript 1)到该复制源上，
最后Cdc6和Cdt1一起招募MCM2-7 (minichromosome
maintenance proteisns 2-7)，从而完成 pre-RC的组
装 [18-19]，此时的Mcm2-7并不具有解旋酶活性 (图
1A)。当细胞进入 G1-S的转折期，CDK (cyclin-
dependent kinase) 和 DDK (Dbf4-dependent kinase)
激酶 [20]将依次磷酸化一系列 PRC蛋白并激活 pre-
RC，从而促使 Cdc45(cell division cycle 45)和 GINS
(Go-Ichi-Ni-San)招募到 pre-RC上，形成具有解旋
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酶活性的 CMG复合物 (Cdc45-MCM-GINS complex)，
从而激活复制源 [19] (图 1A)。然后，RPA (replication
protein A)、RFC (replication factor C)、PCNA
(proliferating cellular nuclear antigen)以及 DNA聚合
酶 (DNA polymerase)将顺序结合到被激活的复制
前复合体，从而开始DNA复制 [1]。在 S. cerevisiae中，
已经实现从 ORC 到 Mcm2-7 的体外顺序组装
pre-RC [18]。但在其他真核生物中尚未重复出 pre-
RC组装这一过程，这暗示其他真核生物中可能有
其他 pre-RC组分还未被发现。最近本实验室发现
裂殖酵母 Sap1蛋白及其在人细胞中的同源蛋白
Girdin (girders of actin filament)也参与到 pre-RC的
组装过程，这一发现将极大地促进我们对 DNA复
制起始的完整认识和理解 (未发表 )。
DNA复制叉是 DNA复制的基本结构，功能性
的复制叉由“Y”字形的 DNA以及结合在该处的
DNA复制相关蛋白组成 [21]，包括具有解旋酶活性
的 CMG复合物、具有 DNA聚合酶活性的复制延
伸因子 (如 Polα、Polε和 Polδ等 )、DNA聚合酶结
合蛋白 (如 RFC等 )、PCNA以及其他复制蛋白，
如 Mcm10、Mrc1 (mediator of replication checkpoint
protein 1)、Tof1 (topoisomerase 1-associated factor 1)、
Csm3 (chromosome segregation in meiosis protein 3)、
拓扑异构酶 Top1 (topoisomerase 1)、Top2以及冈崎
片段成熟蛋白，如 RNaseH (ribonuclease H)、Dna2
(DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease 2)、
Fen1 (flap endonuclease 1)、Cdc24 (cell division cycle
24)和 DNA ligase等 [22-23] (图 1B)。当 DNA复制延
伸时，CMG复合物首先解开 DNA双螺旋，为后续
的 DNA半保留合成提供模板链；同时，Top1和
Top2位于复制叉前后以解开 DNA超螺旋结构，方
便复制叉的顺利移动；RFC和 PCNA则连接 DNA
聚合酶 Polε和 Polδ，这两种聚合酶分别合成连续的
前导链和不连续的后随链；后随链的成熟则需要
Dna2、Fen1、Cdc24、DNA ligase等的共同作用而
形成完整连续的双链 DNA。
复制叉结构复杂而精密，因此，复制叉非常容
易受到多种因素的影响，从而导致复制叉暂时停顿
(fork pausing)。比如，在芽殖酵母中，当复制叉遭
遇 DNA-蛋白复合物或羟基脲 (hydroxyurea, HU)引
起的 dNTPs浓度降低时，复制受到胁迫而停顿，此
时Mrc1和Tof1将限制复制速度，同时Mec1 (meitotic
checkpiont protein 1) 和 Rad53 (radiation-sensitive
mutants 53)将稳定停顿的复制叉，阻止复制叉蛋白
的解离，避免复制叉垮塌 (fork collapse) [24-26]。如果
不能稳定停顿的复制叉，将有可能造成复制叉的
倒转，从而形成病理性的“鸡爪”(chicken-feet)结
构 [27-28]，这也是导致复制叉死亡的原因之一。在裂
殖酵母中，本实验室已经证实 S期细胞周期检验点
中 的 Cds1Chk2 (checking DNA synthesis protein 1) 蛋
白可以直接磷酸化调控 Dna2蛋白，从而防止复制
叉的倒转 [28]；同时 Dna2蛋白还可以与 Hus2 (hydro-
xyurea sensitive protein 2)蛋白一起打开倒转的复制
叉，从而让这种病理性结构得以修复，保证了
图1 DNA复制起始模型和DNA复制叉
刘　阳，等：真核细胞DNA复制叉稳定性维持机制的研究进展第11期 1111
DNA复制的精确和完整进行 (未发表 )。
2　影响复制叉稳定性的因素
DNA复制叉容易受到多种内源性或外源性因
素的影响而停顿，内源性因素主要包括 DNA动态
结构 (如 DNA修饰、DNA-蛋白质复合物的形成、
DNA拓扑结构、染色体重构、转录等 )和部分
DNA顺式元件 [23]；外源性因素主要为紫外线 (UV)、
电离辐射 (IR)和 DNA损伤药物，如 HU和甲磺酸
甲酯 (MMS)等造成的 DNA损伤 [28]。
2.1　DNA超螺旋结构和转录
在 DNA复制过程中，CMG复合物将 DNA双
链打开，这将造成 DNA链的拓扑结构和构象的改
变 [29]。B型双链 DNA分子以右手双螺旋的形式稳
定存在，因此，在同一条 DNA双链中，其中一条
单链与另一条单链必然在空间结构上发生多次交
叉；同时，这条双链 DNA分子由于空间扭曲也使
其不同部分在空间结构上会构成交叉，这种交叉则
形成了 DNA分子高度有序的超螺旋结构 [30]。DNA
复制时，CMG复合物将双链 DNA解旋为两条单链
DNA，由于 DNA超螺旋结构的存在，将导致复制
叉前端的 DNA超螺旋结构越来越致密，而真核生
物染色体非常巨大，因此，染色体不能简单地通过
旋转 DNA链的两端来松散这种结构。如果在 DNA
复制过程中，缺乏减少 DNA链交叉次数的机制，
将会在 DNA复制叉的前端形成紧密的超螺旋，或
在复制叉分支点处的后方形成扭转，这都将严重影
响 DNA复制叉的稳定，甚至直接导致 DNA复制
叉的垮塌。为了保证复制的顺利完整进行，细胞进
化出了一系列机制来解决这一问题，其中最重要的
就是拓扑异构酶 [31]。复制叉前的正超螺旋可以被
Top1 (I类拓扑异构酶 )和 Top2 (II类拓扑异构酶 )
解除 [32]。而在复制叉分支点处后方的扭转并不影响
DNA双链的解旋，但是复制叉分支点后方的扭转
将会导致新形成的姐妹染色单体相互缠绕，影响随
后姐妹染色单体的正常分离，从而严重影响基因组
的稳定性，而细胞主要通过 II类拓扑异构酶来解决
这一问题 [31]。
真核生物 DNA合成是在多位点几乎同时发生
的，因此，一条染色体上将同时存在多个 DNA复
制叉。当相邻两个复制叉逐渐接近时，未复制的双
链 DNA逐渐减少，能容纳正超螺旋的空间也越来
越少，因此，复制叉必须依赖复制叉分支点后方形
成的扭转来保证复制的完整进行 [33]。在姐妹染色单
体分离之前，这种由于相邻复制叉融合而导致的姐
妹染色单体交错，最终也会被 DNA拓扑异构酶解
除 [34]。抑制 Top1和 Top2的活性将导致复制叉分支
点处损伤的积累，这可能是染色体易碎点形成的原
因之一。
在 DNA代谢过程中，DNA复制叉与转录复合
体的偶然遭遇是不可避免的，这主要有两种方式：
相向和同向相遇。相向碰撞为 DNA复制叉的头部
与转录复合体的头部相碰；同向碰撞为 DNA复制
叉的头部与转录复合物的尾部相碰。不论 DNA复
制叉是相向还是同向遭遇转录泡，都将使得 DNA
复制叉速度减慢，这可能是由于转录复合体与核膜
相互作用，从而导致转录复合体的可动性减弱，进
而引起复制叉在转录泡处的暂停 [35-36]。相向碰撞有
可能导致复制叉死亡以及与转录相关的染色体重组
发生。而同向碰撞可能导致 DNA聚合酶以 RNA为
引物，引发不正常的 DNA复制 [37]。同向碰撞可能
还与 DNA损伤修复密切相关，当同向碰撞发生在
DNA损伤位点附近时，DNA复制复合物可以跳过
DNA损伤位点，重新开始 DNA合成，从而防止复
制叉停顿或垮塌。
2.2　独特的DNA结构和染色体易碎点
DNA重复序列，如微卫星序列、反向重复序列、
镜像或串联重复序列等，通常容易形成特殊 DNA
的结构，比如 H-DNA、Z-DNA 和 S-DNA 等 [34]。
这些异常的 DNA结构都将影响 DNA复制叉的稳
定，导致重复序列的扩增，这是很多人类疾病或遗
传紊乱发生的机理之一 [38]。重复序列的扩增还将导
致染色体易碎点的形成。当 DNA合成受到部分抑
制时而出现缺口或断裂的染色体位点被称为染色体
易碎点 [39]。易碎点分为常见型 (所有个体都有 )和
稀有型 (在少于 5%的个体中存在 )两种。稀有型
的易碎点主要是由于重复序列的扩增造成，目前已
有大约 30种人类遗传疾病与稀有型易碎点相关 [40-41]。
而常见型的 DNA易碎点通常是富含 AT的 DNA序
列，它们虽然是正常的染色体组分但却能直接抑制
DNA复制过程，影响复制叉稳定 [39]。酵母中的复
制减缓区 (replication slow zones)也是影响复制叉稳
定性的重要因素，同时也被认为是常见型 DNA易
碎点的一种，但复制减缓区并不富含 AT序列，当
这些区域的 DNA复制叉停顿或发生损伤时，ATR
(酵母中为Mec1/Rad3)将被激活，从而维持停顿复
制叉的稳定 [42]。在酵母中，对复制压力敏感的其他
DNA序列主要为 Ty元件 (Ty elements)和 tRNA基
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因。减少 Polα的量，将导致 Ty序列处染色体移位
频率的增高 [43]。在 S期细胞周期检验点缺失株中，
富含 tRNA基因的序列将导致复制叉停顿并促进该
位点的 DNA断裂和移位的发生 [44]。酵母中还存在
复制叉障碍区 (replication fork barriers)，它通常是
位点特异的区域，比如端粒、着丝粒、tRNA基因、
rDNA和裂殖酵母中的性别转换区域 (mating type
locus)。停顿的复制叉将导致同源重组诱导产生的
染色体重排。如将复制叉障碍 RTS1序列定点导入
裂殖酵母 S. pombe中的性别转换区域，可以通过调
节复制方向而高效地促使性别转换的发生 [45-46]。
目前仍不清楚 DNA复制在复制易碎点处受到
抑制的具体机制，可能是这些位点处的 DNA形成
异常结构或构象。正如前文提到，DNA的高级结
构将直接抑制复制叉的进行。在这些易碎点附近，
由于 DNA序列简单，当复制叉移动到此处时，后
随链由于有部分单链的存在，将很容易形成发夹结
构或其他类似结构，从而影响复制叉的稳定。同时，
存在于这些 DNA序列周边的异常染色体结构也可
能是抑制复制的原因之一。有实验室报道，被扩增
的 DNA重复序列附近的 DNA甲基化水平明显升
高，从而导致异染色质化 [47]。特异的蛋白质结合到
这些 DNA序列附近也将影响该处复制叉的稳定性，
如芽殖酵母中的 Hmo1蛋白结合 CAG重复序列，
从而改变染色体结构，促使该区域基因组的不稳定
性增加 [48-49]。
2.3　直接影响复制叉稳定性的理化因素
除了上述多种内源性因素可以影响 DNA复制
叉的稳定性外，多种外源性的理化因素也能直接导
致复制叉的停顿，从而影响复制叉的稳定。羟基脲
(HU)是一种常用抗肿瘤药物，它通过清除酪氨酰
自由基而抑制核糖核苷酸还原酶M2亚基的活性，
从而抑制 dNTPs的合成，进而降低细胞内 dNTPs
浓度，形成复制压力，造成 DNA复制叉的停顿，
最后抑制整个 DNA复制过程 [50]。用低浓度的 HU
处理细胞，细胞将被可逆地阻滞在 S期早期；如果
用较高浓度 HU处理细胞，将造成复制叉不可逆的
垮塌，导致复制不完全，最后引起细胞凋亡或死亡。
目前发现，在 HU处理的情况下，S期细胞周期检
验点缺失株中的 DNA复制还能继续缓慢完成一部
分 DNA合成 [51]。甲磺酸甲酯 (MMS)是一种烷基
化试剂，同时也是一种致癌物。MMS可以甲基化
修饰 DNA链中的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸的 N7和腺
嘌呤脱氧核糖核苷酸的 N3。起初发现同源重组缺失
株对于MMS特别敏感，因此，人们认为这种 DNA
甲基化修饰可以直接造成 DNA双链断裂 (double-
strand DNA breaks, DSBs)[52]。但是，现在认为，
MMS直接停顿复制叉，而同源重组缺失株很难修
复受损的复制叉，从而表现出对MMS的敏感性 [52]。
当同时使用MMS和 PARP (poly(ADP-ribose)polymerase)
抑制剂时，则会在基因组上产生双链 DNA断裂 [53]。
UV是自然界最普遍存在的一种能造成 DNA损伤
的因素，它可以使 DNA 链中相邻的胸腺嘧啶偶
联在一起，从而干扰双链 DNA的正常配对，导致
DNA结构的异常，最终造成 DNA复制叉的停顿。
3　S期细胞周期检验点
细胞周期检验点 (checkpoint)是指维持细胞周
期各时相的正常秩序并确保各时相顺序转换的生化
调控机制 [54]。人们在研究 UV和电离辐射引起的细
菌基因突变时发现，细菌 (E. coli)可以自我感知并
修复 DNA突变，而首先发现原核细胞存在一种调
控系统，被称为细菌的 SOS系统 [55-56]。真核生物
细胞周期检验点的研究则始于 Hartwell实验室和
Nurse实验室。Hartwell实验室以芽殖酵母为模型，
筛选出大量的温度敏感株。他们发现，其中一些温
度敏感株在限制性温度下生长时，细胞会停滞在某
一特定的细胞时期；通过遗传分析发现，这些突变
蛋白主要与细胞周期和随后命名为细胞周期检验点
的调控系统相关 [57-58]。Nurse及其同事在裂殖酵母
中进行了类似的筛选，他们也筛选出一批与细胞周
期检验点相关的蛋白质；并且，他们首先在人细胞
中确定并证明了 Cdc2蛋白是高度保守的细胞周期
调控蛋白 [59]，这也暗示了细胞周期检验点在真核生
物细胞中是比较保守的。
细胞周期检验点调控通路由三部分组成：感知
信号、信号转导和效应产生 [60]。这三个过程紧密相
关，确保细胞周期有序而完善地进行。细胞周期检
验点主要包括 G1/S检验点、S期细胞周期检验点
和 G2/M细胞周期检验点，其中 S期细胞周期检验
点是维持 DNA复制叉稳定的最重要机制，本文将
着重概述。
前面我们已经提到，HU、MMS和 UV可以直
接导致复制叉的停顿，在停顿的 DNA复制叉附近，
会产生一些较长片段的单链 DNA (图 2A)。RPA蛋
白可以识别并结合这些单链 DNA，进而募集其他
相关蛋白，促使 ATR蛋白自身磷酸化，完成 S期
细胞周期检验点通路的激活，稳定停顿的复制叉，
刘　阳，等：真核细胞DNA复制叉稳定性维持机制的研究进展第11期 1113
并最终完成 DNA损伤修复 [61]。因此，被 RPA结合
的较长单链 DNA是 ATR通路激活的重要信号。S
期细胞周期检验点的信号转导主要依赖于 ATR-
Chk1、ATR-Chk2等信号通路顺序磷酸化一系列相
关蛋白质而实现。
3.1　ATR蛋白
1996年，Schreiber和 Carr实验室分别在人细
胞和裂殖酵母中独立发现了ATR (Ataxia telangiectasia
and Rad3-related protein)蛋白 [62-63]。不久之后，ATR
的相互作用蛋白 ATRIP (ATR interaction protein) 也
被发现 [64]。在 ATR众多相互作用蛋白中，ATRIP起
着非常重要的作用，它与 ATR的稳定、定位和激
活都有直接关系。ATR蛋白在高等真核生物发育中
起着重要作用，它的缺失会直接导致小鼠在胚胎期
的死亡，这可能是由于 ATR与 DNA复制和 DNA
损伤修复息息相关 [65-66]。这里，将着重介绍 ATR
蛋白在稳定停顿复制叉中的作用。
当用 MMS和 HU等药物处理细胞后，DNA
复制叉由于受到复制压力会停顿下来，在停顿的
DNA复制叉附近会产生较长的单链 DNA片段。
RPA是单链结合蛋白，可以感知并结合到这些单链
区域。随后，9-1-1 (Rad9-Hus1-Rad1)、TOPBP1 (topo-
isomerase-binding protein 1) 和 ATRIP 相继结合到
RPA-ssDNA区域。然后，ATRIP募集 ATR到达该
位点，并与 TOPBP1蛋白一起激活 ATR蛋白 [67] (图
2)。2011年，Elledge实验室报道了一个新的人细
胞蛋白 RHINO，能和 9-1-1和 TOPBP1相互作用，
他们发现 RHINO也是 ATR激活过程所必需的蛋白
质之一 [68]。ATR是一个自激活的过程，其 1989位
丝氨酸的磷酸化是其激活的主要标志 [69]。在人细胞
S期细胞周期检验点激活过程中，ATR蛋白被激活
之后，ATR激活的下游核心蛋白激酶不是 Chk2蛋
白，而主要是 Chk1蛋白。ATR蛋白通过调控 Chk1
蛋白，从而达到控制细胞周期、稳定停顿复制叉并
修复 DNA损伤的目的。在酵母的 S期细胞周期检
验点中，Chk1和 Chk2蛋白的激活都依赖于 ATR
蛋白 [70-71]。
3.2　Chk1蛋白和Chk2蛋白
Chk1 (checkpoint kinase 1)蛋白是 ATR蛋白激
酶的下游底物之一，它接收 ATR的信号并传递给
控制细胞生命活动的其他重要效应蛋白质。从酵母
到人，Chk1蛋白都比较保守，都在 S期细胞周期
检验点过程中发挥重要的作用，但是，Chk1及其
同源蛋白在人和酵母中的功能却有所差异。在爪蟾
和人细胞中，被激活的 ATR通过 Claspin介导 Chk1
的激活 [72]。在裂殖酵母中，ATR主要激活 Cds1蛋
白而不是Chk1蛋白，以维持复制叉的稳定。1998年，
Carr和 Russell实验室几乎同时发现 Cds1蛋白参与
图2 ATR-Chk1通路激活过程及效应发生
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DNA损伤应答 [73-75]。Cds1蛋白与人细胞的 Chk2
蛋白序列同源，但其功能却与人细胞的 Chk1蛋白
更为接近。Rad3/Rad26ATR/ATRIP和Mrc1蛋白促使 Cds1
蛋白的激活 [76-77]，激活后的 Cds1蛋白可以稳定停
顿的复制叉，并启动 DNA修复系统，还可以直接
磷酸化 Cdc25以调控裂殖酵母细胞周期 [73]。因此，
Cds1蛋白在维持 S期基因组稳定性方面发挥着关
键的作用。
在裂殖酵母中， Chk1蛋白缺失会导致细胞在
DNA损伤存在的情况下直接通过而不停留在 G2/M
期，这暗示Chk1蛋白功能的发挥主要在G2/M期 [78]。
但是其他实验发现，裂殖酵母 Chk1蛋白在 S期中
也有比较重要的作用。比如，在 Cds1蛋白缺失的
情况下，UV、MMS引起的细胞损伤也可以激活
Chk1蛋白从而使细胞停留在 S期 [79]；即便在 Cds1
蛋白存在并被激活的情况下，Chk1在 S期晚期也
会被磷酸化 [80]。这暗示 Chk1蛋白很可能作用在
Cds1蛋白之后，负责 S期晚期对细胞基因组完整
性的检测，决定细胞是否进入 G2期。另外，其他
实验室还发现 Chk1蛋白被激活后，可以导致细胞
停留在 G1/S期 [81]。这表明 Chk1在 S期早期也发
挥着重要作用。也就是说，裂殖酵母 Chk1蛋白在
S期开头和结尾处都起到检查的作用，而 Cds1则
是在 DNA复制过程中发挥着关键作用。
相对于 ATR蛋白激酶，Chk1和 Cds1蛋白则
是更加直接的细胞周期调控因子，它跟细胞多项生
命活动都有紧密而又重要的联系。Chk1和 Cds1蛋
白的缺失会引起细胞对 HU、MMS、UV和电离辐
射的敏感，罹患癌症的几率也相应增高。目前认为
Chk1和 Chk2蛋白都是抑癌因子，也是比较有潜力
的能控制癌症的靶标蛋白 [82-84]。
3.3　S期细胞周期检验点的效应发生
S期细胞周期检验点对于稳定停顿的复制叉具
有极其重要的作用。但是，S期细胞周期检验点的
相关蛋白主要都是蛋白激酶，这些蛋白激酶不能直
接稳定停顿的复制叉以维持基因组的稳定性，它必
须通过磷酸化调控其他蛋白以发挥其功能 [85]。
在人细胞中，S期细胞周期检验点通过磷酸
化 p53和 Cdc25蛋白，调节细胞周期相关蛋白的
表达或活性，从而将细胞周期停滞或延迟在 S期，
为细胞修复损伤的 DNA提供充足的时间 [86]。在 S.
pombe中，Chk1或Cds1蛋白直接磷酸化Cdc25蛋白，
抑制 Cdc25的磷酸酶活性，从而导致 CDK的活性
被抑制，最后使得 S期被延长 [73] (图 2B)。
S 期细胞周期检验点还可以抑制晚复制源
(late origin)的起始。在 S. cerevisiae中，Rad53可
以直接磷酸化 Sld3 (synthetic lethal mutations with
dpb11-1)蛋白，阻碍 Sld2-Dpb11-Sld3复合物形成，
导致 Cdc45不能定位到被激活的 MCM蛋白处，
抑制晚复制源处 DNA的复制起始 [87-88] (图 2B)。
S期细胞周期检验点还可以直接稳定停顿的复
制叉，防止其倒转或垮塌。2012年，本实验室发现，
在 S. pombe中，Cds1蛋白可以直接磷酸化 Dna2蛋
白，被磷酸化的 Dna2蛋白可以更好地结合在染色
质上，直接防止停顿复制叉倒转 [28]。有证据表明，
Cds1/Rad53可以磷酸化 Exo1和Mus81蛋白，使得
它们从染色质上掉落下来，以免它们利用自身的核
酸酶活性破坏正常的复制叉结构 [89-90] (图 2B)。
S期细胞周期检验点也可以直接减慢复制速
率，以降低复制压力对复制叉稳定性的影响。2012
年，Botchan实验室发现，在非洲爪蟾中，Chk2蛋
白可以在体外直接磷酸化Mcm3/4、Psf2蛋白，从
而抑制 CMG复合物的解旋酶活性，降低 DNA的
合成速率 [91]。不仅如此，S期细胞周期检验点还可
以抑制不正常同源重组的发生，并促进复制叉在复
制压力解除后重新开始 DNA合成 [2] (图 2B)。
3.4　S期细胞周期检验点与DNA复制的关系
前文已经提到 S期细胞周期检验点在稳定停顿
的复制叉方面具有重要作用，除此以外，其在正常
DNA复制过程中也发挥着显著作用。S期细胞周期
检验点与 DNA复制的关系具体表现在以下几方面。
(1)保障 DNA复制的正常进行。S期细胞周期
检验点不只是在 DNA复制受到外界胁迫时才被激
活，在正常的 DNA复制过程中，S期细胞周期检
验点也是被微弱激活并发挥其功能。在正常的
DNA复制过程中，Chk1蛋白依赖于 ATR而被激活，
然后 Chk1可以调节 Cdc25A的活性，从而调节细
胞周期的正常进行 [92]。在正常的 DNA复制过程中，
S期细胞周期检验点主要调节复制起始源的起始
时间和顺序，即促进早复制起始源的复制起始，抑
制晚复制起始源在 S期早期的复制起始，并确保
着丝粒和端粒在染色质其他区域完成复制后再复
制 [93]。有实验证实，在 HU 处理的情况下，ATR或
Chk1 缺失株中的晚复制起始源的复制起始将不
能被调控，从而导致 DNA复制异常 [94]。ATR−/−或
Chk1−/−将导致小鼠在胚胎时期就死亡 [95]。在 S.
cerevisiae 中，Mec1 (ATR 的同源蛋白 ) 和 Rad53
(Chk1的同源蛋白 )的缺失株不能存活，除非将
刘　阳，等：真核细胞DNA复制叉稳定性维持机制的研究进展第11期 1115
Sml1一起敲除 [96]。而这些蛋白质被敲除后，主要
影响了 DNA复制的正确进行，从而导致细胞和个
体的死亡。
(2)促进 DNA复制叉跨越天然复制障碍。染色
质中存在很多的转录泡和天然元件，如简单重复序
列、复制缓慢区、复制障碍区、染色体易碎点等，
这些都会胁迫 DNA复制的正常进行，影响基因组
的稳定性。在 DNA复制叉跨越复制屏障等天然元
件过程中，S期细胞周期检验点发挥着非常重要的
作用。当复制叉在 DNA复制屏障处停顿时，S期
细胞周期检验点将被激活，来稳定这些停顿的复制
叉；如果 S期细胞周期检验点不能发挥其正常功能，
将导致大量 DSB的产生，从而引发高频率的 DNA
重组发生 [97]。实验证实，S. cerevisiae中，在Mec1
功能缺失的情况下，DNA复制叉穿过复制屏障的
速度明显减缓，并且有大量 DNA断裂产生 [98]。
(3)稳定停顿的 DNA复制叉。S期细胞周期检
验点除了能维持内源性的因素造成的 DNA复制叉
停顿外，还在维持由各种外源性因素造成的 DNA
复制叉停顿中发挥着重要作用。如果停顿的 DNA
复制叉不能被有效稳定，将造成复制叉的坍塌，引
起 DNA复制不完全，最后导致细胞凋亡、死亡和
癌变等。当 DNA复制叉遭受复制压力而停顿下来
后，S期细胞周期检验点通路将被快速而有效地激
活，被激活的 S期细胞周期检验点可以维持 DNA
聚合酶在 DNA复制叉处的结合，使得 DNA复制
叉在复制压力解除后可以继续完成 DNA合成。
Diffley实验室发现，用MMS 处理 S期细胞周期检
验点缺失的 S. cerevisiae菌株，将导致 ~16%的停
顿复制叉垮塌，并且晚复制起始源也将在 S期早期
开始复制起始 [99]。Foiani实验室则发现，在用 HU
处理的 rad53突变株中，大约有 10%的 DNA复制
叉倒转 [100]。因此，他们认为 DNA复制叉的倒转是
复制叉垮塌的主要原因。2012年，本实验室在 S.
pombe中发现，S期细胞周期检验点通过磷酸化调
控 Dna2蛋白来防止被停顿复制叉的倒转，这使得
我们更深入地认识了 S期细胞周期检验点在维持停
顿的复制叉中的重要功能 [28]。
(4)促进停顿复制叉重新开始 DNA合成。当复
制压力解除后，S期细胞周期检验点还将促使停顿
复制叉继续完成 DNA合成。DNA复制的重新起始
依赖于 ATR和 ATM蛋白，而且 Mre11、BLM和
PARP在其中也起着至关重要的作用 [101]。在 DNA
复制重启过程中，S期细胞周期检验点将调节一系
列相关蛋白，其中最重要的是 CMG蛋白复合物和
DNA聚合酶等。复制叉停顿时，ATM和 ATR蛋白
可以直接磷酸化MCM蛋白，被磷酸化后的MCM
复合物可以有效地继续结合在被停顿的复制叉
处 [102]；同时，S期细胞周期检验点中的其他蛋白
也将磷酸化 GINS和Mcm2-7中的部分亚基从而抑
制其解旋酶活性 [91]。ATM、ATR和 Sgs1蛋白促进
DNA聚合酶与停顿复制叉的稳定结合 [103]，如果
DNA聚合酶从停顿复制叉上解离，其与停顿复制
叉的再次结合则依赖于 ATM和 ATR蛋白的直接调
控 [104]。总之，S期细胞周期检验点在整个 DNA复
制过程中都发挥着极其重要的作用，维持了复制叉
的稳定并保证了 DNA复制的精确、完整、有序的
进行。
4　复制叉稳定性与疾病的发生发展和治疗
DNA复制叉的稳定与基因组的稳定密切相关。
不稳定的基因组通常将导致疾病的发生，甚至细胞
或个体的死亡，因此，研究稳定 DNA复制叉的具
体机制有助于认识相关疾病的发生并指导相关疾病
的治疗。ATM蛋白突变后将导致 AT综合症 (Ataxia
telangiectasia)，Seckel综合症则是由于 ATR蛋白突
变而造成的，这两种疾病都是神经退行性疾病，严
重威胁人类健康 [105-107]。Chk1蛋白则与乳腺癌、结
肠癌、肝癌、胃癌和鼻咽癌的发生和形成有重要相
关性，因此，Chk1蛋白被认为是癌症治疗的重要
靶标 [108-109]。一些癌症通过高表达 Chk1蛋白从而能
耐受由于治疗而产生的 DNA损伤，针对这类癌症，
通过抑制 Chk1的表达，可以很好地解决其对放疗
或化疗的耐受 [110]。由于肿瘤细胞的增殖分裂速度
高于正常细胞，因此，能影响复制叉稳定性的药物
或手段都可以成为控制肿瘤细胞的潜在方法。HU
最初就应用于治疗骨髓及外骨髓增殖紊乱，特别是
真性红细胞增多症和血小板增多症，它还被应用于
降低镰刀形红细胞贫血症的疼痛频率，也曾被应用
于艾滋病的治疗；MMS之前也被用作抗肿瘤药物。
因此，关于 DNA复制叉稳定性的研究将有效地指
导癌症治疗。
5　展望
目前，我们已经知道停顿复制叉的稳定需要一
系列生化事件的协同作用。当复制叉发生停顿时，
S期细胞周期检验点将阻滞细胞周期进程，直接调
控复制叉相关蛋白而保证复制叉的功能完整性，并
生命科学 第26卷1116
抑制晚复制源的起始；同时，S期细胞周期检验点
还调控其他蛋白质，如一些核酸酶或解旋酶等直
接或间接稳定复制叉，其他蛋白质，如染色质重构
蛋白 (chromatin remodeling proteins)、组蛋白变体及
组蛋白修饰蛋白等都能影响复制叉的稳定 [111-114]。
但是，我们对维持复制叉稳定性的机制仍然有很多
不清楚之处，如转录与停顿复制叉稳定的关系、S
期细胞周期检验点具体调控哪些复制相关蛋白来稳
定停顿的复制叉、复制叉稳定性与其他类型 DNA
损失的相互联系等。最近的研究主要集中在探寻能
维持复制叉稳定性的新蛋白质或新机制以及进一步
阐明维持复制叉稳定的调节机制，如已知蛋白质的
翻译后修饰调控以及重要蛋白质的定位调控等。虽
然这些研究取得了进步，但这只是冰山一角，DNA
复制叉稳定性的维持机制仍需进一步深入探索。
[参　考　文　献]
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