全 文 ：细胞色素 P450的多样性与介导抗性的研究
罗浑金 傅童声
(湖南农业大学动物科技学院,长沙 410128)
摘 要: 细胞色素单加氧酶是一类广泛分布在生物体内的重要酶系, 在生物体内广泛分布, CYP450 参与多
种外源性化合物的代谢,内源性物质的合成, 在生物体起到十分重要的作用,对 P450 的研究已从最开始的功能与
定位深入到了它的分子机制和多样性等的研究, 就 P450 的多样性、介导抗性的机制和分离方法作一综述。
关键词: 细胞色素 P450 多样性 介导抗性的机制 分离方法
The Reserch of the Diversify and the Mediated-Resistant
Mechanism of Cytochrome P450
Luo H unjin Fu T ongsheng
( A nimal sci ence acad emy of hunan agr icu ltur al univ ersi ty , Ch angsha 410128)
Abstract: cyto chr ome P450-dependent monooxygenase a re a ver y impor tant enzymatic sy stem , which has been
found in all living or ganisms systems axamined, these monooxygenase are able metabolize a phenomenal number o f
endogenous and exogenous compounds , It is play a impo rtant ro le in the living o rganisms, the research of t he cy to-
chrome P450 star t f rom the founcation and or ientate to the mechanism of the meloc, div ersify Act, t he paper is elab-
o rating the above.
Key words: Cytochrome P450 Diver sify M ediated- resistant mechanism Method of separet
P450曾被冠以多种名称: 多功能氧化酶、细胞
色素 P450单加氧酶、微粒体氧化酶多底物单加氧
酶血红素硫蛋白等[ 1] ,它是广泛分布于生物有机体
中的一类代谢酶系,不仅对许多的外来物质如杀虫
剂及其它环境有毒物质具有代谢作用, 还参与一些
起重要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸的代
谢,在生物体中起着十分重要的作用。P450酶系由
多种成分组成,目前已知的成分有:细胞色素 P450
(以下简称 P450)、细胞色素 b5、NADPH-细胞色素
P450 还原酶、NADH-细胞色素 b5 还原酶以及磷
脂。其中细胞色素 P450以及细胞色素 P450 还原
酶起中心作用。
1 细胞色素 P450的多样性
1. 1 P450基因种类的多样性
自发现 P450至今,在 Genbank中登陆的 P450
核酸序列或氨基酸序列已有 1 200多个,据统计细
菌中 P450 基因家族有 75个 ( CYP101- CYP174.
CYP51) , 低等真核生物有 72 个 ( CYP51-CYP69、
CYP501-CYP526 ) , 植 物 中 有 52 个 ( CYP71-
CYP99、CYP701- CYP726、CYP51) , 动物中有 69
个,其中哺乳动物 18个,这 18个家族的基因(不包
括 CYP39家族)都存在河豚中 [ 2]。总之, 现今发现
的 P450基因来自于 256个不同的家族,预计随着一
种白色腐蚀性的真菌的 167个序列的命名完成。这
个数字还会增加( http: / / drnelson. utmem. edu/ cy-
tochrome p450. htm l)。
1. 2 细胞色素 P450分布的多样性
细胞色素 P450首先在哺乳动物肝微粒体中发
现,最初被认为它仅存在于动物组织的微粒体中。
到 20世纪 60年代后期,细胞色素 P450在微生物中
的发现证明了血红蛋白在生物界的分布要比想象中
的广泛。至今在各种动物、植物、真菌和细菌中都发
收稿日期: 2005-10-19
作者简介:罗浑金( 1981- )女,湖南农业大学硕士研究生 Email: guagua0229@ 126. com
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
现有 P450的存在。P450不仅存在于不同的生物体
中,同种生物的不同组织中也发现多种 P450, 其中
以肝脏含量最为丰富,在昆虫中肠、脂肪体马氏管等
器官或组织中的 P450的含量也十分丰富。
1. 3 细胞色素 P450基因表达的多样性
P450基因的表达也十分复杂。有些昆虫在生
长发育的各个阶段都能表达, 有些基因只在生长发
育的某个阶段表达, 如 CYP6B2只在幼虫中表达,
CYP6D1只在成虫中表达, 有些基因甚至只在某个
生长发育阶段的某一时刻表达,大部分昆虫的 P450
基因都在雄性个体中表达, CYP6D1 在许多昆虫的
多个组织中表达,此外不同的抗性品系其基因的表
达情况不尽相同 [ 3]。
2 P450介导抗性的机制
到目前为止只有一个 P450( CYP6D1)清楚地
被证明在抗性中起作用。但许多重要的发现也可以
从 P450和杀虫剂抗性研究结果中总结出来。P450
单加氧酶介导昆虫抗性的可能机制包括( 1) P450的
超量表达, ( 2) P450的氨基酸替换, ( 3) P450的超量
表达和氨基酸的替换联合作用。
2. 1 P450的超量表达与杀虫剂抗性
许多研究表明, P450相关的抗性昆虫往往表现
出某种 P450 的超量表达 [ 4] , 感性家蝇 CYP6D1
( P450Ipr)只占总 P450的 7%, 而对拟除虫菊脂抗
性的家蝇, 这一 P450 的含量上升为总量的 67%异
源表达的 CYP6A1、CYP6D1、CYP6A2、CYP12A1
具有对杀虫剂代谢的活性 [ 5] ,直接证明了这些 P450
的超量表达在杀虫剂抗性形成中起作用,目前,关于
P450超量表达的遗传基础了解的还不够全面, P450
转录增强可以增强 P450 蛋白的表达和加强对杀虫
剂的解毒作用, 转录过程又受顺式和反式调控,所以
调控基因的变异被认为是 P450超量表达的主要原
因。有机磷杀虫剂抗性的家蝇, 其抗性与 2 号染色
体相关, CYP 6A 1则位于 5号染色体, 杀虫剂抗性基
因组中作图不同于参与杀虫剂代谢的 P450的基因
位点,如家蝇的拟除虫菊酯抗性相关的 CYP6D1 基
因位于 1号染色体, 而其表达位于 2号染色体上的
因子调控,这些事实说明,抗性昆虫 P450的超量表
达很可能是反式遗传因子作用的结果。这一因子的
突变使在感性昆虫中表现为低表达的 P450,在抗性
昆虫中表现为超量表达 [ 6]。
2. 2 P450氨基酸替换与杀虫剂抗性
不同于酯酶介导的抗性, P450超量表达不是基
因扩增的结果,但不能排除在抗性品系中不超量表
达的P450与抗性有关。因为在某些 PBO 增效的抗
性品系家蝇中并未发现 CYP6A1mRNA 的超量表
达, P450介导的抗性很可能还存在其他的抗性机
制。例如 P450 氨基酸残基的改变就可能导致抗
性,先在已仅知一个氨基酸变化就可以彻底改变一
个 P450的底物特异性, 通过比较果蝇的不同抗性
水平的 3个品系的 CYP 6A 2序列, 发现存在 3个氨
基酸替换, 推测这 3 个氨基酸突变可能影响
CYP6A2活性中心位点[ 7]。因此,仅根据超量表达
这一现象来决定某一 P450介导的抗性有关是不正
确的。
2. 3 P450超量表达与氨基酸替换联合作用
P450的超量表达对家蝇和果蝇抗药性的形成
具有重要的作用, 而果蝇的抗药性有可能是
CYP6A2 超量表达和氨基酸替换联合作用的结果,
即抗性昆虫超量表达了对杀虫剂具有较高催化效应
的 CYP 6A 2等位基因[ 8] 。
3 分离细胞色素 P450的方法
应用不同的方法(如分子生物学或蛋白纯化)已
成功地分离到了昆虫细胞色素 P450 的基因或蛋
白,下面主要介绍这些方法。
3. 1 对整个基因组测序
对生物体的基因组测序, 如果蝇和冈比亚按蚊
的测序是鉴别 P450 最系统的方法, 测序与微阵列
的分析结合是获得一个生物体所有的 P450表达谱
信息的最有效的手段的序列。另外, 对整个基因组
测序还可以提供其他的有效信息如侧翼端的序列,
内含子和每个 P450 在染色体的确切的位置, 然而
目前对大部分昆虫来讲,这种方法都不现实。
3. 2 蛋白纯化
早期科学家们在研究生物体中 P450 的异构体
时常用蛋白纯化的方法来提取 P450蛋白, 这些纯
化后的 P450蛋白能够被用来制成抗体, 用这些制
成的抗体去筛选 cDNA 表达文库,另外也可以用这
种纯化后的蛋白进行蛋白测序, 然后根据蛋白测序
设计此基因的特异引物扩增得到短的 cDNA 片段,
152006年第 2期 罗浑金等:细胞色素 P450的多样性与介导抗性的研究
再用此 cDNA 片段做探针进行文库的筛选,还可以
基于这种特异的引物利用 RACE 的方法克隆基因。
值得一提的是用这种方法克隆基因,原则上可以得
到一个纯化蛋白的特异基因, 但有时侯相类似的其
他的 P450基因也会被分离出来。
3. 3 以已知基因为探针
考虑到 P450基因之间的相似性, 可以把已知
克隆出来的 P450 基因作为探针去分离新的 P450
基因, 例如 CYP6B 1 作 为探 针 成 功 筛 选 到
CYP 6B3 [ 9] ,利用这种方法可以在种间扩增新的基
因,如 CYP 6B8基因和 CYP 9A 1基因的克隆。
3. 4 设计简并引物
尽管 P450具有多样性, 但是所有的 P450基因
在氨基酸水平上都存在相对保守的区域。例如血红
素结合区域, 这是 P450 的高度保守区域, 尤其是
FXXGXXXCXG结构,成为人们判断 P450的标志.
其中的半胱氨酸表现出高度的保守性, 在所有已知
的 P450中均有发现, 而且被认为是与血红素铁结
合的第 5 配体, EFRL 序列(残基 363-366)是所有
CYP6家族成员的保守序列, 但在许多哺乳动物
P450中也有发现, 而且残基 E 和残基 R表现出很
高的保守性,根据保守区域的氨基酸设计简并引物
,能够获得部分的 P450序列,得到大量的片段后可
以有选择性的把他们制成探针, 进而筛选文库 [ 10] ,
另外也可以采用 PCR/ RACE 的方法克隆全长基
因。
3. 5 mRNA差异显示技术
基于 P450表达的多样性(不同的生命阶段, 不
同的品系,不同的生理条件下其表达的 P450 基因
也会不同) [ 11] , 可以采用差异显示方法获得一系列
的靶基因,它是近几年来发展起来的用于研究基因
诱导后表达变化的有效的方法。因其操作简便, 快
速,一次性能分析多个样品而成为分离新的首选方
法。细胞色素 P450酶系是广泛存在于生物体中的
一类代谢酶系,是多功能氧化酶的重要的组成部分,
起着与底物结合以及末端氧化酶的作用, 具有底物
氧化性和功能多样性的特征,可以代谢多种内源性
物质和外源性物质, 其中对植物次生物质的代谢在
昆虫对寄生植物适应性方面起了主要作用,而对杀
虫剂的代谢是昆虫产生抗药性的主要的机制,一直
是生物学研究的一个重要对象。对 P450 酶系的深
入研究本身也是对目标生物进行深入认识的过程,
这将有助于我们不断深入地认识目标生物体内的各
种生理、生化反应过程以及生物体的各种特性。
参 考 文 献
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16 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期