全 文 ： 技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
DNA芯片技术研究进展及其在分子营养上的应用
阳成波1, 2 印遇龙 1* 龚建华 3 郁海 3
( 1中国科学院亚热带农业生态研究所,长沙, 410125;
2四川农业大学动物营养研究所,雅安, 625014; 3 Food Research
P rogram, Agriculture andA gri- Food Canada, Guelph, On tu rio, N1G 5C 9 , Canada)
摘 要: DNA芯片技术是近年发展起来的又一新分子生物学研究工具, 可使研究者得以自动化、快速、平行
地对大量的生物信息加以分析, 在基因组水平上研究基因表达。这种技术为从基因组水平研究基因表达水平与生
理反应及生理状况的改变之间的关系提供了强有力的手段。通过比较不同营养水平或不同环境条件下的组织细
胞基因达到表达谱差异, 可以从基因组水平阐明各种营养成分或环境因素对动物机体的基因表达的影响, 从而进
一步揭示营养生理的机制和环境对动物影响的机理。DNA芯片技术为分子营养的研究开辟了一条崭新的道路,在
从 DNA芯片的原理、种类、实验设计、统计方法及在分子营养上的应用作一综述。
关键词: DNA 芯片 DNA微阵列 表达 应激 分子营养
Advance and Application of DNA Chip Technology in
M olecular Nutrition
Yang Chengbo
1, 2 Y inYu long1 Gong Jianhua3 YuH ai3
( 1 Institute of Subtrop ical Agriculture, the Chinese A cademy of Sciences, Changsha, 410125;
2Anim alN utrition Institu te, S ichuan Agricultural Univer sity, Ya an, 625014; 3Food Research
P rogram, Agriculture and Agri-F ood Canada, Guelph, Onturio, N 1G 5C9, Canada)
Abstrac:t DNA chip techno logy is revo lution iz ing many aspects o f b io log ica l research, allow ing the expression of
m any thousands of gene transcr ipts to bem onito red s imu ltaneously. This prov ides pow erful too ls for the genom e-w ide co rre-
lation o f gene transcr ipt leve lsw ith physio log ica l responses and altera tion in phys io log ical sta tes. Com parative approaches to
understand ing the genom e-w ide co rre la tion o f gene transcr ipt leve lw ith d iffe rent d ie t nutr ition leve ls and env ironm ental con-
d ition can illustra te them echanism of e ffect of nutr ition and environment effecting on anim a.l DNA ch ip techno logy prov ides
a pow erfu l too l fo rm o lecular nutr ition. In this rev iew, w e show the advance o f DNA chip from pr inciple, c lassify, design
experim ent, sta tistic analysis and its app lication in m o lecu lar nutrition.
Key words: DNA ch ip DNA m icroarray Expression Stress M olecular nutr ition
作者简介:阳成波, ( 1978-) ,男,湖南衡阳人,在读博士研究生,主要从事分子营养研究
通讯作者:印遇龙, E-m ai:l yyu long@ hotm ai.l com,电话: 0731-4619703
DNA芯片 ( DNA Ch ip)又被称为生物芯片 ( B io-
log ica l ch ip)、DNA微阵列 ( DNA m icroarray )等 [ 1 ]。
世界上第一个 DNA芯片是定量研究芥菜 (A rab idop-
sis thaliana)基因表达的 cDNA微阵列 [ 2]。在此之后
国际上掀起了一阵 DNA芯片设计的热潮, 出现了多
种类型的 DNA芯片技术。在短短几年时间内 DNA
芯片技术不断完善,现已经显现出在基因序列分析、
基因诊断、基因表达研究、基因组研究、发现新基因
及各种病原体的诊断、分子营养学等领域中的应用
价值。DNA芯片制造技术充分结合并灵活运用了
寡核苷酸合成, 固相合成, PCR技术, 探针标记, 分
子杂交,荧光显微探测, 生物传感器及计算机控制、
2006年增刊 阳成波等: DNA芯片技术研究进展及其在分子营养上的应用
图象处理和统计等多种技术,充分体现了生物技术
与其他学科相结合的巨大潜力。其在营养学中也有
着潜在的广泛应用前景。下面就 DNA芯片技术的
原理、种类、实验设计、统计方法及在分子营养上的
应用作一综述。
1 DNA芯片技术的原理
DNA芯片 ( DNA Ch ip)又被称为生物芯片 ( B io-
log ica l ch ip)、DNA微阵列 ( DNA m icroarray) ,是指在
一个大约 1cm2面积的载体上,点布数以万计不同
的寡核苷酸或 cDNA, 将芯片与标记有荧光染料的
待测 DNA、RNA或 PNA ( Peptide nucle ic acid)杂交,
与靶序列配合好的探针会产生强烈的杂交信号,如
果有碱基错配信号就会减弱。然后用放射自显影或
激光共聚焦显微镜扫描, 对杂交结果进行计算机软
件分析,获得杂交信号的强度及分布模式图,以此反
映出所检测的样本中有关基因的表达强弱。由于大
量基因杂交的反应是在一张基因芯片上同时进行
的,因此同一次实验可以分析成千上万的靶基因。
2 DNA芯片的种类
DNA芯片种类较多, 根据微阵列上探针的不
同,可分为寡核苷酸芯片和 cDNA芯片两类 [ 3] , 寡核
苷酸芯片是将寡核苷酸原位合成或合成后固定在芯
片上, 暴露于标记样本 DNA杂交,根据杂交信号出
现部位的寡核苷酸序列推测与其互补的 DNA序列。
cDNA芯片是将 cDNA固定在芯片上。最初的寡核
苷酸芯片是用 20短寡核苷酸确定一个基因,现在发
展到用一个较长的寡核苷酸 (大约 50~ 70bp)确定
一个基因,此项改进可让一张芯片上可包含更多的
基因, 并简化了数据的分析。在 cDNA芯片上,由于
cDNA片段的长短不同, 杂交后的信号也由此引起
了误差, Nguyen等对此问题进行了讨论, 并指出可
以通过不同的标记方法来解决 [ 4 ]。最近出现了肽
核酸芯片 ( Peptide nucle ic ac id m iroarray, PNA m -i
croarray) ,肽核酸是以中性酰胺键为骨架的一类新
的 DNA类似物, 对核酸有着独特的序列识别功能。
它不带电荷,与核酸杂交时不存在静电排斥作用,故
PNA与互补的 DNA或 RNA杂交时,比类似的 DNA
寡聚物有着更高的亲和性,而且 PNA很稳定 [ 5]。
3 DNA芯片实验的设计 ( Des ign o f exper-i
men,t DOG )
DNA芯片技术使得我们能够同时对极大数目
的分子标志进行检测, 但同时也使研究往往在无特
定的科学假设状况下进行。这就使变异一方面可以
掩盖低表达水平基因之间的差异,另一方面可以获
得统计学显著意义而得出假阳性结果。DAN芯片
实验中的变异主要来自于三个方面:一是生物学变
异;二是芯片内部点点之间的变异;三是芯片与芯片
之间的变异 [ 6]。生物学变异主要是指由于个体之
间的差异、免疫、激素分泌和应激状况不同而引起的
变异。所以控制生物学变异的基本原则是严格控制
环境使实验在惟一差异因素的条件下进行。芯片内
部点点之间的变异和芯片与芯片之间的变异主要是
技术上和实验过程上的变异。这两种变异主要是通
过合理的实验设计来控制。变异的控制对 DNA芯
片实验是非常重要的, 而变异主要是通过良好的实
验设计来控制,不合理的实验设计使实验结果往往
不能说明问题,合理的实验设计可以使实验结果和
数据符合统计学的要求, 更能说明实际问题。为了
估计这三种变异,有学者提出采取三种相应的重复:
一是生物学重复 (如动物样品 ) ; 二是点与点的重
复;三是芯片与芯片的重复 [ 4]。DNA芯片通常还可
以分为单色 DNA 芯片 ( S ingle-co lo r DNA M icroar-
ray)和双色 DNA芯片 ( Tw o-color DNA M icroarray) ,
芯片实验的设计又分为单因素设计 ( S ing le-factor
design)和多因素设计 (M ultifactoria l design) ,本文以
双色 DNA芯片为例来讨论单因素芯片实验的设计。
常见的 DNA芯片实验设计方法有下列几种:
3. 1 样品配对杂交 ( Pairing samp les fo r hybrid iza-
tions)
样品配对杂交指在同一张芯片上直接比较两个
样品, 这是双色 DNA芯片 ( Tw o-co lor DNA M icroar-
ray)的特点。这种方法可以说明由于点的大小引起
的变异,但在所有的样品都进行两两比较是不现实
的。在这种方法中,最重要的步骤是决定一个样品
重复取几个和它们如何成对分布到芯片上 [ 7 ]。
3. 2 染料交换设计法 ( Dye sw aps)
染料交换设计是一种简单而有效地比较两个样
品的方法 [ 7] , 方法是用两个芯片来比较两个样品,
见图 2。在一个芯片中, 对照样品用红色染料 Cy5
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
标记, 待测样品用用绿色染料 Cy3。
图 2 两个样品直接比较的染料交换设计
A和 B是 DNA样品, A 1、B1、A 2、B2是样品 A和 B的重复。箭头代表样品 DNA与芯片的杂交,
箭头指向的样品用红色染料 Cy5标记,箭头尾部的样品用绿色染料 Cy3标记。 a:是染料交换设计 ( Dye sw ap );
b:有重复染料交换设计 ( a repeated dye sw ap ); c:重复样品染料交换设计 ( a rep licated dye sw ap) ;
d:简单的循环设计 ( a sim p le design)。标记,在另外一个芯片,正好相反。也可以对同一个样品重复
杂交比较 (图 2a) ,但要同设置两个独立的样品相区别 (图 2 c)。前者只能减少技术变异
( Techn ical variation) ,而后者即可以减少技术变异,也可以减少生物变异。
3. 3 参考样品设计 ( Reference samp le design)
在参考样品设计中, 各个样品都与参考样品进
行比较。参考基因一般选择在各组织中恒定表达,
而且不受试验处理影响的基因 [ 8 ]。这种设计方法
见图 3所示,可以减少实验误差, B rem等应用这种
设计方法研究遗传因素对酵母中基因转录水平的影
响 [ 9]。
图 3 参考样品设计的示意图
A、B、C和 Z代表待测样品, Ref代表参考样品。
箭头代表样品 DNA与芯片的杂交,箭头指向的样品
用红色染料 Cy5标记, 箭头尾部的样品用绿色染料
Cy3标记。
3. 4 环型设计 ( Loop design)
见图 4,在环型设计中,每个样品都要与其它样
品进行对比杂交,使每个样品所用的芯片数和染料
( Cy3和 Cy5)数一样, 比参考样品设计更具有统计
学意义 [ 7]。
图 4 环型设计示意图
A、B、C、D和 E代表样品。箭头代表样品 DNA
与芯片的杂交,箭头指向的样品用红色染料 Cy5标
记,箭头尾部的样品用绿色染料 Cy3标记。
对 DNA芯片试验的设计上,除用重复和随机控
制误差外, 还要注意 DNA芯片试验的特殊性, 如超
过两个以上的处理。试验就是不完全区组设计, 因
为一张芯片可被看作一个区组,只能容纳两个处理,
对不完全区组设计有专门的统计方法。
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2006年增刊 阳成波等: DNA芯片技术研究进展及其在分子营养上的应用
4 DNA芯片实验数据的统计分析方法与结
果的验证
DNA芯片可以在一个实验中同时对几千个基
因的表达进行分析,但由于自然的复杂性,产生的数
据非常多,如何从这么多的数据中选择出感兴趣和
有意义的数据,以及如何对这些数据进行统计分析,
是非常必要的。DNA芯片实验数据的统计分析方
法一般可分为监督方法 ( Superv isedm ethods)和非监
督方法 ( Unsupervised methods) , 前者需要一些外部
信息 (如实验目的及样品来源等 ) , 适用于对与处理
因素有关的关键基因进行统计分析, 从而简洁的对
样品进行分类; 后者适合发现新的基因转录变
化 [ 10]。非监督方法主要是指聚类分析法 ( C lustering
analysis ) , 包 括: 自 组 图 分 析 ( Sel-f o rgan izing
maps)
[ 11]、系统聚类分析 ( H ierarch ial) [ 12]和逐步聚
类分析 ( K-m eans) [ 13 ]。
DNA芯片的试验结果必须用其它技术去证实
其准确性。从 DNA芯片试验中发现的表达有差异
的基因,其可靠性需要进一步验证。目前验证 DNA
芯片结果的技术有 rea-l tim e RT-PCR和蛋白质抗体
反应, 特别是利用 rea-l time RT-PCR来验证试验结
果的比较多 [ 14, 15 ]。
5 DNA芯片技术在分子营养学上的应用
随着分子生物学的发展及其在营养学中的应
用,从分子水平上弄清养分的代谢过程和规律,准确
确定动物群体及个体的营养需要, 掌握养分摄入过
量及缺乏的后果,预防和治疗营养代谢疾病以及解
决其他营养问题,即分子营养学。
5. 1 营养与基因表达研究
营养与基因表达的关系及其作用机制已成为分
子营养学研究中的重要内容。最近, 一个代表着营
养学和基因组学相结合的新学科名词 基因组营养
学, (Nutrigenom ics) 开始为人所知。 2002年初, 第
一届国际基因组营养学会议在荷兰召开, 突出地显
示的基因因素,目前已经成为营养学研究中不可忽
略的一个重要组成部分 [ 16 ]。基因组营养学的一个
显著特征是一系列能够监测极大数目的分子表达、
基因变异等的基因组技术和生物信息学在营养学研
究中应用。虽然 Northern点杂交、原位杂交、RNA
酶保护试验、实时定量 RT-PCR等技术经常被用来
定量检测细胞基因表达 [ 17 ] ,但都是针对单个或几个
有限的基因进行监测,不能反映整体基因表达情况,
不符合系统生物学的概念。基因组营养学的研究将
按照系统生物学的概念,关注整个机体、整个系统或
整个生物功能分子水平上的通路的轮廓 ( pro file)变
化,而非单个或几个孤立生物标志物的改变。DNA
芯片技术的引入使分子营养学家们将能检测到营养
素对整个细胞、整个组织、或整个系统及作用通路上
的所有已知和未知基因的影响。因此,这种全面的
检测无疑将使得研究者能够真正全面了解营养素的
作用机制。DNA芯片技术不但改变了营养学研究
的效率,而且改变了研究者的思路。最近几年, DNA
芯技术应用于分子营养学研究的例子非常多, 主要
集中在应用 DNA芯技术研究能量、蛋白质、脂肪酸、
微量元素、维生素与基因表达之间的关系 [ 18~ 21, 23]。
最早的是 Lee等人 [ 18 ] 1999年报道的有关衰老
及能量限制 ( ca loric restriction)抗衰老作用的研究。
研究者使用代表着 6 347个基因的高密度寡核苷酸
芯片。通过比较成年小鼠 ( 5个月 )和老年小鼠 ( 30
个月 )的腓肠肌基因表达的轮廓 ( pro file)变化, 从而
发现与老龄化有关的基因。并且在此基础上进一步
观测能量限制对老化过程的影响。随后, 2001年
R ichard等人使用代表着 6 347个基因的高密度寡
核苷酸芯片对雄性 C57BL /6老鼠基因表达发现随
着年龄的增长,与应激有关的基因 (如 DNA损伤诱
导基因和与热应激有关的H sp基因等 )表达上调, 而
能量限制可以预防和减轻这种变化 [ 19]。
在传统营养中,蛋白质的营养价值评定主要通
过生长试验和氮平衡试验, 而蛋白质的其它功能的
机理仍然不知道, 如大豆蛋白的降胆固醇作用 [ 24] ,
酪蛋白的促进 Ca2 +吸收作用 [ 25] , 迄今日粮蛋白质
仍然有许多功能没有被发现, 但可能通过 DNA芯片
技术发现。为了研究蛋白质的质量和数量对机体生
理和病理状况的影响, 通过比较分别饲喂无氮日粮
( P ro te in free)、12%麸质日粮 ( G lu ten,蛋白质含量为
80% )日粮和 12% 酪蛋白日粮 ( Case in, 蛋白质含量
为 85% )的三组老鼠的肝脏基因表达情况, 不但发
现以前靠常规方法鉴定的与蛋白质营养有关的基因
( IGF系列基因和受体基因 )表达情况有变化 [ 20] , 而
且发现更多的与生长、代谢和细胞结构、信号转导的
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
基因表达情况的改变,其中变化最大的是抑制 DNA
结合蛋白 ( inhibitor o f DNA b ind ing )的基因和一系
列与胆固醇生物合成与降解的基因。为蛋白质营养
影响基因表达提供了一个全面的基因表达图谱,更
加有利于研究者发现和解释蛋白质营养机理。
在另一个研究中,研究者们应用 DNA芯片技术
分析了鱼油摄入对机体的影响。尽管鱼油可以降低
心血管疾病的发病率, 但一个有争议的问题是鱼油
摄入可能会增加氧化损伤 [ 21 ]。事实上, 研究发现鱼
油对氧化损伤的促进作用并不明显。这表明鱼油的
摄入可能同时也提高了机体抗氧化防御系统的作
用。Takahash il等人通过对饲喂高鱼油日粮的小鼠
肝中 6 521个基因表达的检测发现,鱼油可以降低
与活性氧有关的因子如羟化固醇和芳香酚形式的硫
转移酶的基因表达。同时鱼油可提高一些抗氧化剂
的基因表达,如 Mo-SOD、谷胱甘肽转移酶和 UCP-2。
此外,高鱼油日粮可能通过活化 PPAR alpha而增加
氧负荷 ( ox idative stress) , 它同时又可以通过一种负
反馈机制来抑制这个活化作用。
为了进一步了解硒对肿瘤发生的抑制作用的可
能机制, Rao等人 [ 22]采用代表 6 347个鼠类基因的
A ffymetrix高密度寡核苷酸芯片对喂饲低硒日粮的
C57B I/6J小鼠的小肠基因表达水平进行了检测。
相对于高硒的日粮饲喂小鼠组, 在所有被检测的基
因中, 84个基因的表达增高了超过两倍而 48个基
因的表达降低了四分之三。其中表达增高的包括
DNA 损 伤 /氧 化 诱 导 的 基 因 如 GADD34 和
GADD45,以及细胞增殖基因;而表达降低的则包括
一些硒蛋白基因及解毒酶,如谷胱甘肽过氧化物酶
( GPX1) P4503A1、2B9等。研究结果表明硒的营养
状态可能影响与肿瘤发生有关的多个途径。
5. 2 建立营养素需要量上应用
基因组营养学的另一项重要的应用是建立营养
素需要量。传统的用来估测营养素需要量的方法,
如平衡实验或因子分析并非适用于所有营养素,尤
其是那些具有较强稳态作用,涉及到复杂分子调控
的营养素 [ 26]。而对于营养学家来讲, 寻找合适的用
于反映营养状态的指标一直是此类研究的难题。
DNA芯片技术将有助于发现大批分子水平上可特
异地反映营养素水平的指标,从而大大推动这方面
的工作。而且可使营养需要量的建立基于更科学的
分子机制基础之上。此外,在将来的工作中,基于不
同品种的动物基因组特征的对营养素需要的概念将
被广泛地接收。因为不同动物品种基因组差异对营
养素吸收、代谢、储存等的影响已逐渐为人们所认
识。
5. 3 如何应用 DNA芯片技术研究非模型动物营养
与基因表达
商业上制作的芯片在研究应用上已经非常广泛
了,但大部分集中在模型生物 (M ode lO rgan isms)中,
如人的细胞、老鼠、果蝇和酵母等 [ 10] ,其它非模型动
物 ( N onmodel O rganisms)则报道甚少, 如猪、鸡、牛
等。因为缺少全部基因序列阻碍了 DNA芯片技术
在非模型动物上的应用。制作非模型动物的基因芯
片的首要条件是得到并鉴定动物的 cDNA, 这些 cD-
NA可以用 PCR扩增并点到芯片上。最简单的方法
是从 cDNA文库里随机 cDNA克隆, 然后把它们排
列在芯片上,但是由于真核生物基因组相当庞大,且
含有大量的重复序列, 高丰度的基因还将会被反复
出现,所以随机选取的大部分 cDNA很可能只是小
数高丰度的基因,而许多低丰度的基因将容易被遗
漏,从而形成了一个代表性较差的 DNA芯片 [ 27]。
解决这个问题的有效方法是表达序列标签 ( Ex-
pressed sequence tag, EST )测序技术, EST代表的是
表达基因的一段序列, 整个基因组中所有表达基因
的功能及其调控即构成功能基因组 [ 28]。EST分析
的一般步骤是:建立生物体特定组织或细胞的高质
量 cDNA文库→从文库中随机挑取足够量的 cDNA
克隆进行 5端或 3端测序→生物信息学分析 (即将
测序所得的 EST数据与 dbEST等数据库中的数据
比较,鉴定 cDNA克隆 )。为了增加获得有代表的
EST和减少测序工作,必须提高 cDNA文库的质量,
减少高丰度表达的基因, 提高低丰度表达基因所占
的比例。这就涉及到 cDNA文库的前加工技术, 例
如: 消减杂交 ( Subtractive hybr id izat ion ), 均等化
( Normalization)
[ 29 ]。通过文库前加工, 一方面可以
减少高丰度 cDNA克隆的数量, 另一方面可以使文
库中所有的基因序列所占的比例大致相等。到目前
为此,未见应用 DNA芯片技术全面分析 ( g loba l a-
na lysis)猪和鸡的基因表达情况的报道。但现在加
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2006年增刊 阳成波等: DNA芯片技术研究进展及其在分子营养上的应用
拿大圭尔夫大学有两个研究小组,就用人的 DNA芯
片研究猪和牛的基因表达,其中应用人的 DNA芯片
研究牛的基因表达情况, 从而鉴定牛的高的抗体免
疫应答和低的抗体免疫应答 [ 30]。
6 问题与展望
DNA芯片技术为我们指引了一条深入研究营
养素生理功能分子机制的捷径。目前, 国外已经有
10多家从事 DNA芯片研究的公司, 它们的芯片技
术各具特色,应用目的也不尽相同。但大部分集中
在模型生物中, 而利用 DNA芯片技术研究动物
(猪、鸡、牛等 )分子营养依然是空白,而弥补这个空
白的首要前提是建立猪、鸡、牛等的 cDNA芯片。同
时如何通过试验设计来减少变异、如何通过统计分
析使得从 DNA芯片得到的数据更能说明问题也需
进一步研究。DNA芯片技术发展到今天不过短短
几年时间,虽然还存在这样或那样的问题,但基于它
对生命信息进行大规模平行处理的能力, 利用 DNA
芯片可快速、高效、并行地获得空前规模的生命信
息, DNA芯片将成为今后生命科学研究和医学诊断
中革命性的方法。DNA芯片最有可能将 100 000个
基因集成到 1cm2的载体上,通过这样的芯片可以
精确地完成营养物质对动物基因表达变化影响的分
析,探索营养与免疫之间关系、营养物质的功能、营
养代谢分子机理和营养生理机理, 从而估测动物健
康快速生长的营养需要量, 提高动物生长性能。其
在分子营养领域已呈现出广阔的应用前景, 随着研
究的不断深入和技术的更加完善, DNA芯片一定会
在分子营养学研究领域发挥非凡的作用。
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