全 文 ：第26卷 第4期
2014年4月
Vol. 26, No. 4
Apr., 2014
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2014)04-0423-07
DOI: 10.13376/j.cbls/2014062
大规模酵母双杂交技术的发展及其
在蛋白质相互作用组学中的应用
刘禹辰，贺福初，王　建*
(军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京蛋白质组研究中心 蛋白质组学
国家重点实验室 蛋白质药物国家工程研究中心，北京 102206)
摘　要：酵母双杂交技术作为研究蛋白质相互作用的主要方法，在规模化蛋白质相互作用研究中占据举足
轻重的地位。虽然蛋白质相互作用的数据逐年递增，但是还远不能满足“大数据”的实际需求。为了使蛋
白质相互作用组学研究更加高效、快捷、准确，以及使酵母双杂交适用于全基因组规模筛选和蛋白质相互
作用数据高度覆盖的研究需求，近年来对酵母双杂交技术进行了一系列的改进和发展。综述了近年来在规
模化蛋白质相互作用组学研究中，酵母双杂交技术的最新改进和发展。
关键词：大规模；酵母双杂交；蛋白质；相互作用组学
中图分类号：Q933；Q291；Q51 文献标志码：A
The development of large-scale yeast two-hybrid and its application in
interactome researches
LIU Yu-Chen, HE Fu-Chu, WANG Jian*
(State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Engineering Research Center for Protein
Drugs, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 102206, China)
Abstract: Yeast two-hybrid (Y2H) technology is the primary method to study protein-protein interactions. It plays
an important role in the large-scale interactome researches. Although the interactome datasets increased every year,
it still could not meet the needs of the big data by the researches of systems biology and biological functions. To
make interactome research more efficient, fast and accurate, in recent years, the Y2H technology was improved to
make it more suitable for whole genome scale screening and high coverage interactome studies. This paper reviews
the latest improvements and developments of Y2H technology in recent large-scale interactome studies.
Key words: large-scale; yeast two-hybrid; protein; interactome
收稿日期：2014-02-14；修回日期：2014-03-03
基金项目：国家高技术研究发展计划(“863”计划)
(2012AA020201)；北京市自然科学基金项目(512214)；
北京市科技新星计划(2011014)
*通信作者：E-mail: wangjian@bmi.ac.cn
蛋白质是生命活动的执行者，生物体生物功能
的发挥绝大部分是通过蛋白质相互作用实现的。人
类基因组计划得到了大量基因的信息，但是对于其
编码产物蛋白质的系统性、综合性的研究才刚刚开
始。全面深入研究蛋白质 (群 )的组成、相互作用、
结构和功能才能揭示生命活动的规律，因而使得近
年来蛋白质组学蓬勃发展。随着研究的深入，小规
模的“一对一”检测蛋白质相互作用已不能够满足
科学研究的需求，大规模的蛋白质相互作用组研究
是当今蛋白质组学研究的重要发展方向。同时，蛋
白质相互作用组的研究也从单纯定性向获得更深
入、具体的数据方向发展。相互作用数据不仅需要
简单的定性其“有”或“无”，一些新筛选方法引
入了包括揭示活性中心、相互作用对间的距离、产
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生相互作用的强弱等更加具体的相互作用信息的数
据 [1-2]。
蛋白质相互作用网络研究不仅是得到一组组的
相互作用，蛋白质功能的发挥依赖于与之相互作用
的蛋白质 (群 )，了解与之存在相互作用的蛋白质
属性也能够更好地揭示蛋白 (群 )的功能 [3]。与单
一蛋白质相互作用研究能够阐明作用机理一样，对
大量数据进行网络化、综合化的处理能从全蛋白质
组水平揭示蛋白质群体之间的相互作用规律和机
理。整合不同物种间的蛋白质相互作用数据也能为
进化、发育生物学研究发掘大量的线索 [4-5]。
1　酵母双杂交技术
1.1　酵母双杂交技术的原理
酵母双杂交系统是一种直接的细胞内检测蛋白
质相互作用的方法 [6]，其基本原理是基于转录因子
GAL4可以分离为独立的具有活性的两个结构域：
DNA结合结构域 (DNA binding domain, BD)和转录
激活结构域 (activation domain, AD)。DNA结合结
构域能识别特异的 DNA序列，而转录激活结构域
能够启动靶基因的转录。利用基因克隆技术分别构
建含 BD融合蛋白和 AD融合蛋白的表达载体，通
过转化使同一酵母细胞内表达带有 BD和 AD的两
个融合蛋白，如果两个蛋白质能够发生相互作用，
则会使 BD和 AD结构域靠近，形成具有完整活性
的转录因子并激活整合到酵母基因组上的报告基因
转录，通过检测酵母的报告基因表达与否，可以反
映两个蛋白质之间有无相互作用。
1.2　酵母双杂交技术的特点
酵母双杂交系统能在活细胞内检测蛋白质之间
的结合，具有很高的敏感度。由于表达质粒具有高
拷贝数和强启动子，使得 BD和 AD融合蛋白在酵
母中有较高的表达水平，因此，此技术能检测到瞬
时和低亲和力的相互作用。检测的方法是分析报告
基因的激活，蛋白质相互作用激活报告基因，使酵
母在营养缺陷培养基上生长或表达特定的显色报告
分子。与免疫共沉淀、GST pull-down等体外检测
蛋白质相互作用的技术相比，酵母双杂交技术具有
独特的优势：(1)不需要进行洗涤，因而信号衰减小；
(2)酵母双杂交技术仅需要构建表达载体和文库，
无需进行蛋白质抽提和纯化等繁琐的操作，降低了
工作量和成本；(3)酵母双杂交技术可以根据靶蛋
白的表达部位、条件和时相的不同有针对性地构建
筛选文库，加大了得到真实阳性相互作用的几率。
另外，酵母细胞是真核细胞，可对表达的蛋白质进
行适当的折叠和修饰，蛋白质的空间结构更贴近于
体内的生理条件下的状态。
1.3　酵母双杂交的局限性
为了适应高通量筛选的研究需要，开发了诸多
酵母双杂交技术策略，使得酵母双杂交的通量从简
单的一对一扩大到了一组蛋白，甚至基因组水平，
更能满足后基因组时代的研究需求。另外，这些策
略也使得酵母双杂交不仅能够完成任意两组蛋白质
间的相互作用筛选，更能够完成某些特定病理相关
的蛋白质群之间的相互作用筛选，使科研工作者能
够获得更多的线索，最典型的例子是以病原微生物
蛋白质组和宿主蛋白质组之间的病原 -宿主相互作
用组 (parasite-host interactome)数据获得病原微生物
可能的致病机理线索 [7-10]；或者将致病突变基因和
野生型基因相互作用组之间的差异比对，寻找基因
突变疾病的致病机理等 [11]。
酵母双杂交技术在相互作用组学和系统生物学
研究中发挥日益重要的作用，然而也有其自身技术
的局限性：首先，酵母双杂交技术检测蛋白质相互
作用通过激活报告基因，然后在营养缺陷型培养板
上培养，此过程涉及自激活检测、共转、回转以及
检测报告基因的多个操作，鉴定相互作用需要多次
培养和生长的过程，整体工作量大、周期长 [12]；其次，
规模化相互作用组研究中，报告基因检测结果主要
为定性数据，较少定量数据，不易精确判断蛋白质
相互作用的强度和变化 [13]；最后，酵母双杂交技术
自身也导致了一定的假阳性和假阴性相互作用 [14-15]。
关于这些局限性及其解决办法，后面将详细阐述。
1.4　酵母双杂交技术现状
尽管酵母双杂交检验所检验的相互作用阳性
是指其结构上存在相互作用的可能，确认相互作用
仍需要其他相互作用研究手段的共同检验，但是作
为广泛寻求研究线索的最常用相互作用检验手段，
其地位在相互作用研究中是不可撼动的。随着系统
生物学、蛋白质组学和蛋白质功能研究对于蛋白质
相互作用数据的巨大需求，规模化蛋白质相互作用
的研究数据和高水平的研究论文的发表也逐年递
增。不仅针对重要信号转导通路相关的蛋白质相互
作用网络被人们所揭示，而且病原体 [7-8]、模式生
物 [14,16-20]，乃至人类的蛋白质相互作用图谱也纷纷
被绘制出来 [4,20-21]。
然而，由于酵母双杂交自身的原因，酵母双杂
交数据仍然存在一定的不准确性，特别是组学水平
刘禹辰，等：大规模酵母双杂交技术的发展及其在蛋白质相互作用组学中的应用第4期 425
的相互作用数据之间覆盖度极低 [20, 22-23]，需要大量的
数据整合工作。尽管组学水平的相互作用研究非常
多，但是仍有相当部分的相互作用数据没有检测出
来。另外，针对同一组蛋白质的筛选，BD和 AD构
建融合蛋白的载体进行互换，所得出的结果往往大
相径庭 [24]。还有，针对不同的载体，即使是相当成
熟的酵母双杂交系统，所得的筛库结果仍有出入 [25]。
2　酵母双杂交技术的改进，以提高工作效率
酵母双杂交相比其他相互作用筛选手段最大的
优势是其能够适应基因组水平的高通量筛选。而在
基因组水平的相互作用筛选中，减少工作量提高效
率尤为重要。酵母双杂交技术的分子生物学操作是
非常复杂的，从基因的载体构建、蛋白质的自激活
检测到多次酵母转化和相互作用的确认。为了降低
工作量使其更适于高通量筛选，人们对酵母双杂交
技术进行了一系列的改进。
2.1　酵母双杂交阵列筛选技术
从传统的酵母双杂交技术基础上发展而来的酵
母双杂交文库筛选技术能够支持一个诱饵与整个
cDNA文库的筛选，可以用于筛选 1个蛋白质与整
个 cDNA文库中的相互作用 [23]；但是，该技术并
不适用于基因组水平的相互作用筛选。首先，基因
组水平的相互作用筛选需要成千上万的诱饵，而对
这些诱饵一一进行文库筛选工作量极大；其次，由
于 cDNA片段的不同，筛库过程中呈劣势生长的菌
株不容易得到筛选结果；最后，筛库同样面临单次
筛选只能获得文库中极少部分的相互作用结果 [23]。
为了适应基因组水平的相互作用筛选，人们开发
了酵母双杂交阵列筛选技术 (yeast two hybrid array
screening)。
最早的阵列筛选是用于检测一组蛋白质互相之
间的相互作用，诱饵和猎物顺序排列，组成阵列，
因此，该方法也称为酵母双杂交阵列 (Y2H array)。
高通量阵列筛选是将若干个诱饵混合成一个亚库
(pool)，一个诱饵筛选几个至几百个诱饵，当出现阳
性后，再通过一对一方法逐一检验最终找到相互作
用对，该方法兼顾了一对一杂交的特异性、敏感性
和筛库的通量，更适于完成大规模的相互作用筛选。
近年来，基因组水平的酵母双杂交筛选蛋白质相互作
用的数据几乎都是通过阵列筛选手段完成的 [17, 26-27]。
另外，与传统酵母双杂交文库筛选大量依靠人
工操作不同，酵母双杂交阵列筛选主要以自动化移
液工作站为手段，通过机器进行点样、加液等操作。
根据实验需要，自动化移液器调整规格，可以一次
进行 96、384、1 536个样品的同时处理，其中体系
偏大的操作采用 96通道移液器在 96孔板中进行，
而小量微量的操作则采用 384道移液器在 384或
1 536孔板中进行，相比一对一加液，缩短了相当
一部分实验时间 [28]。另外，工作站同时整合了许多
其他自动化模块，如振荡器模块可自动对反应体系
进行震荡混匀、重悬沉淀等操作；加热模块自动进
行加热、温育等操作，而不用停止程序将反应容器
反复放入拿出水浴锅，这样也减少了人为原因造成
的错误和污染。自动化移液工作站可以完成诸如质
粒提取、细菌和酵母的化学转化、自激活检测、蓝
白斑筛选等分子生物学操作，甚至有部分工作站已
经可以完成自动化智能挑菌等过程。通过自动化移
液工作站点样，将多个转化体系直接点在平板上培
养，再从对应位置挑菌。相比传统转化，可以将需
要在几十板上完成的培养集中到1个培养板上完成，
既降低了实验成本、试剂用量、菌种保存空间，也
简化了人工操作。经过多年的努力，自动化酵母双
杂交阵列筛选已经形成了标准程序 [20, 28-30]。
2.2　规模化载体构建方法
规模化酵母双杂交筛选需要构建大量的表达载
体，因此，载体构建工作的质量和速度对于后续的
酵母双杂交筛选至关重要。传统的构建载体方法是
限制酶切 -连接方法，可以有效地将目的片段插入
载体，然而其操作时间长，需要酶切、连接两步反应，
构建成功后的重组质粒需要进行 DNA测序来验证
其正确性，表达载体的构建过程中存在载体自连、
连接困难等缺点，这些缺点使得限制酶切 -连接方
法不能用于高通量的载体构建。
相比之下，同源重组方法构建载体操作相对简
单、易行 [32]。在对表达载体进行改造之后，可直接
通过 PCR检测，根据片段大小确认目的 DNA是否
插入，而且重组成功率极高。同时，对于不同插入
DNA片段所需的操作几乎相同，更适宜规模化酵
母双杂交实验的大量载体构建工作，其中最有代表
性的是 Gateway方法 [3]。该方法是通过 attB、attP、
attL、attR位点之间在 BP、LR重组酶的作用下可
以发生同源重组，从而将插入片段从一个载体引入
到另一个载体 [16]。
Gateway方法有如下优点，使其适用于规模化
酵母双杂交的载体构建：首先，由于致死基因 ccdB
的引入，空载体几乎不能生长出菌落，给鉴定降低
了难度 [31]；其次，同源重组的反应在 DNA片段长
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度差异不大的情况下 (<3 000 bp)，几乎可以用同样
的反应时间和条件得到良好的重组结果，而无需像
酶切 -连接方法中反复摸索反应条件；最后，由于
重组臂位点长度大约为 25 bp，远长于一般限制性内
切酶的识别位点长度，在重组过程中，极难发生在
目的 DNA片段中存在重组位点相同或同源性较高
的序列，不需要像酶切 -连接方法逐一检查目的
DNA片段选择合适的酶，因而工作量也大大减少 [21]。
3　高覆盖度和低假阳性率的酵母双杂交技术
酵母双杂交技术得到的相互作用数据中包含了
一定的假阳性和假阴性相互作用 [32]。假阴性即两个
蛋白质发生相互作用，但在酵母体系中筛选不到或
报告基因不表达、表达程度低以至于无法检测。假
阳性数据可分为技术和生物学假阳性，简单的概括
就是，第一类假阳性相互作用由非蛋白质相互作用
原因引发；第二类假阳性则是相互作用不能在生理
状态下发生 [24]。
高覆盖度，即能够用酵母双杂交技术尽可能高
比例地将蛋白质相互作用检测出来，即低假阴性率。
传统方法认为，提高覆盖度的最佳方法是进行尽量
多的重复筛选。Yu等 [27]研究表明，重复检测 3~5
次可以使酵母双杂交结果覆盖整个可检测的相互作
用组的 80%。因此，能够高效地完成多次重复检测
无疑是降低假阴性率的理想手段，但是，对基因组
水平的规模化酵母双杂交来说，重复检验意味着巨
大的工作量，下面将介绍如何最优配置重复检验以
减少工作量，并同时降低假阴性率。
3.1　Pooling技术
在酵母双杂交阵列筛选中将数个猎物混合在一
起，形成亚库 (pool)，当诱饵与亚库中的任何一个
蛋白质发生相互作用，整个亚库筛选结果呈阳性，
若每个猎物均不能与诱饵发生相互作用，则整个亚
库呈阴性。此技术被称为 pooling技术。之后进一
步检测亚库中的每个猎物，找到与该诱饵发生相互
作用的一个或几个。在基因组水平，蛋白质之间两
两发生相互作用的比例很低，pooling技术可以快速
剔除没有相互作用的蛋白质对，缩小筛选范围。一
个亚库中的诱饵越多，完成一次筛选所需的筛选次
数也就越少。此技术可以看成是介于一对一酵母双
杂交与酵母双杂交文库筛选之间的方法，提高了一
对一双杂交的筛选效率，使其能够满足更高通量的
实验需求，同时也解决了文库筛选中灵敏度的不足。
由于该技术设计简单，并且提高了筛选效率，所以
该策略在规模化酵母双杂交筛选中广泛采用。
3.2　Smart-pooling技术
Smart-pooling技术是从 pooling技术中发展而
来的，并将亚库的优势更加充分的发挥。该技术将
以一定的排列规律使得若干猎物形成一个亚库，而
其中每一个猎物又能够出现在若干个亚库中。这样
在第一次筛选过程中，每个亚库中的猎物已经筛选
了多次，增加了重复次数；这些筛选又是同时进行
的，降低了批次间由于操作导致的实验误差 [33-34]。
Smart-pooling技术相对于传统的 pooling技术优势
明显，但是其短板在于设计困难，特别是寻找一个
有效的规律性排列亚库的方法，需要大量的数学计
算，而仅从算法出发，不同的亚库排列设计难分优
劣 [35]。比较有代表性的设计是 shifted transfer design
smart-pooling。研究者根据基因库的基因总数，通
过数学和生物信息学方法，设计亚库的大小 (size)、
冗余度 (redundancy)以及排列组合的规律，以达到
每个相互作用都能在不互相影响的情况下被检验多
次，同时筛选次数不变 [36]。通过这种设计，每个诱
饵筛选后都会有产生阳性的特异性亚库序列，称为
签名 (signature)。当诱饵与猎物发生相互作用时，
理论上每个存在的亚库都会出现阳性，这些阳性亚
库会符合之前亚库中的某个猎物的排列组合签名，
可以直接通过签名定位到猎物，无需进行二次筛选。
该设计在相同实验工作量和筛选次数的情况下，最
大化提高实验重复次数，最终将假阴性控制在较低
范围内 [37]。
4　新的酵母双杂交技术
随着蛋白质相互作用组学研究的深入，对于相
互作用数据的需求也在增加，不仅是数量规模越来
越大，细节上也要求能够展示越来越多的信息。传
统的相互作用往往只能给出简单的阳性和阴性，而
缺乏更加具体的信息，诸如相互作用强弱等。酵母
双杂交经过长期的发展，形成了一套体系，以及适
合该体系的报告基因，然而对于当今的实验需求，
需要新的筛选策略。
4.1　基于荧光报告基因的酵母双杂交技术
在二元相互作用 (binary interaction)筛选中，
荧光报告基因有着广泛的应用：双分子荧光互补技
术 (BiFC)、荧光能量共振转移技术 (FRET)等的运
用也显示出荧光报告基因的优势。虽然这些新兴的
体内相互作用技术目前还没有推广到相互作用组学
研究中，但是已经有将荧光蛋白作为报告基因进行
刘禹辰，等：大规模酵母双杂交技术的发展及其在蛋白质相互作用组学中的应用第4期 427
筛选的酵母双杂交研究报导。
与 BiFC技术不同的是，基于荧光报告基因的
酵母双杂交的原理仍然是融合蛋白发生相互作用使
转录因子 GAL4激活荧光报告基因。因此，只需改
变酵母受体菌株而不用大幅度地改构载体；但是相
比传统的报告基因 LacZ、His3等不同的是，荧光
报告基因只要在酵母内检测到荧光即可认为发生了
相互作用，甚至可以根据发生荧光的强弱推测相互
作用的强弱。荧光报告基因发光至多需要 24 h，相
比传统方法在缺陷培养基上生长出菌落至少需要
2~3 d，采用荧光报告基因可以使筛选周期大大缩短，
直接使筛选效率大大提高 [12]。
高通量自动化流式细胞检测技术的出现，促进
了基于荧光报告基因的酵母双杂交技术的应用。为
了降低荧光蛋白在流式分选过程中的背景噪音和增
强信号，有研究者结合酵母表面展示技术，将表达
后的荧光蛋白展示在酵母表面，更加方便分选。通
过流式细胞仪直接将酵母双杂交液体培养体系按照
一定的荧光强度分选后进行培养，相比传统缺陷培
养基培养方法的 2~3 d的实验周期，结合流式技术，
384个液体样本只需 20 min的分析时间。将固体培
养基培养转化成液体样本处理，其速度上的飞跃是
显而易见的 [38]。
4.2　基于DNA微阵列技术的酵母双杂交技术
在基因表达和 DNA-蛋白质相互作用数据领
域、高通量药物定量筛选领域，DNA微阵列技术
已经有着广泛的应用。通过 DNA微阵列方法获取
大量定量数据，同样能够满足酵母双杂交对于大量
定量数据的需求，因此，研究者发展出了一种基于
DNA微阵列技术的酵母双杂交技术。
研究者将所有需要筛选的猎物混合成一个基因
库，与待筛选诱饵和空载体进行大规模接合 (mating)。
筛选后的猎物会分为诱饵特异性 (bait-dependent)或
无特异性 (unspecific)两种。经过质粒提取、PCR
富集，生物素标记的 PCR产物与 DNA微阵列进行
杂交。获得结果在与阳性对照 (基因库直接与 DNA
微阵列杂交结果 )和阴性对照 (空载体与 DNA微
阵列杂交结果 )进行基于模型的阵列分析结果，与
阳性对照比对显示出发生相互作用的诱饵的富集
度；与阴性对照比对显示出诱饵的特异性。
借助 DNA微阵列产生的信号，可以将发生相
互作用的蛋白质数据进行生物信息学分析，从而找
到高可信度的相互作用。引入两组对照则可以同时
筛选 Y2H阳性和过滤非特异性自激活猎物。该方
法相比其他酵母双杂交有着两大优势：首先，相互
作用是由不同参数的打分呈现出来，重复抽样策略
和两个对照组的引入可以排除潜在的假阳性结果；
其次，该方法中酵母接合和筛选的体系更小，以及
DNA微阵列数据获取相互作用的效率相比营养缺陷
培养基培养更高，这些都降低了人工和实验成本 [39]。
5　展望
酵母双杂交数据之间的覆盖度相对较低，很多
相互作用组学研究需要多次筛选、重复验证。尽管
基于酵母双杂交技术的相互作用组学工作已经很
多，但是组学水平上的酵母双杂交数据需求量仍然
很大 [22]。很多经典相互作用方法，诸如蛋白质片段
互补技术 (PCA)[40]、表面等离子共振技术 (SPR)、
荧光共振能量转移技术 (FRET)[41]、免疫共沉淀技
术 (Co-IP)等，由于自身的原因无法推广到高通量
水平进行筛选，因而酵母双杂交仍然在未来的相当
长时间内保持活力。
在后基因组时代，不仅需要了解是否存在相互
作用，而且希望得到更加详尽的相互作用信息。然
而，酵母双杂交的缺陷在于其只能给出有限的相互
作用信息。因此，如 PCA或者 FRET、SPR等能展
现蛋白质相互作用动态信息的方法能够应用于组学
水平研究，将对蛋白质相互作用研究起到巨大的推
动作用。另外，传统的酵母双杂交只能检测发生于
核内的相互作用 [23]，因此，对于筛选蛋白质的种类
有着较大的限制。尽管近年来，膜酵母双杂交技术
(MYTH)有了一定的发展，但是推广到高通量水平
仍需过程。
酵母双杂交技术在蛋白质组学的研究中仍然占
有重要的地位，但是该技术的局限性使得它必须做
出一定的改进，以便降低假阳性率、减少工作量和
成本、获得更丰富的相互作用数据。近年来，通过
RNA-seq[42]、二代测序 [43]等方法更有效地获取规模
化酵母双杂交数据，给规模化酵母双杂交技术研究
注入了新的活力。人们对规模化酵母双杂交技术进
行了改进，兼顾高效率和低成本、高覆盖度和低假
阳性率，因此，它仍将在很长时间内在相互作用组
学研究中占据重要位置。
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