全 文 ：乳酸链球菌素的分子结构、抗菌活性及基因工程研究*
韩德强1, 2 丁宏标1** 乔宇1
( 1中国农业科学院饲料研究所,北京 100081; 2内蒙古农业大学动物医学与科学学院,呼和浩特 010018)
摘 要: 乳酸链球菌素( N isin)是一种由 34 个氨基酸组成的天然抗菌素, 对革兰氏阳性菌具有广谱抑菌作
用。Nisin 通过吸附于细胞膜, 在膜上形成孔洞杀菌。Nisin 的 11 个基因形成基因簇,负责其翻译后修饰、转运, 先
导序列的切除,成熟分子的外泌, 合成过程的调节等。Nisin 高产菌株的选育主要通过物理化学诱变,基因工程高
效表达技术的研究刚刚开始。Nisin 在食品和医药领域具有广泛的应用。本文主要就 Nisin 的分子结构、分泌机
制、抗菌活性、作用机理,特别是它的基因工程技术研究进展等作一概述。
关键词: Nisin 分子结构 抗菌作用 基因工程 应用
The Molecular Structure , Antibiotic Activties and
Genetic Engineering of Nisin
*
Han Deqiang
1 , 2 Ding Hongbiao1** Q iao Yu1
( 1 Feed r esearch insti tute , Chinese A cad emy of Ag ri cul tural Sc ienc es, B ei j ing 100081 ;
2 Coll eg e of A nimal S ci ence and M edicine , Inne r mongolia Ag ri cu ltural unive rsi ty , H ohhot 010018)
Abstract: Nisin is a ribo somally synthesized 34residue po lypeptide which is prima rily ag ainst a wide r ange of
gr am po sitive bacterium species. By adhering to the cytoplasmic membrane of sensitiv e bacter ia, Nisin forms po res
in the cy toplasmic membrane and lead to the deat h o f sensitiv e bacter ia. The elev en genes nisABTCIPRKFEG form
gene cluster , ex cept the st ruct ur al g ene nisA, the others are invo lv ed in the intracellular postt ranslational modifica
tion reactions ( nisBC) , expo rt ( nisT ) , and ext racellular prot eo ly tic act ivation ( nisP) and ext rusion. The screen and
cultivation of high yield nisinproducing species were obtained mainly by treatment w it h phy sica l and chemica l fac
to rs, and researches on the highefficient ex tra g ene expressing technolo gy are on the star ting stage. Nisin has been
ex tensively studied used on dairy fo od production, meat pr ocession, vegetables and fruit pr eser vation, as w ell as me
dicinal f ields. This r eview cover s the mo lecular structure, secr etion mechanism, ant ibiotic activ ity and t he mecha
nisms invo lved, and especially the genetic eng ineer ing techno lo gy of N isin.
Key words: Nisin Molecular structure Ant ibiotic activit y Genetic engineering Application
乳酸链球菌素( Nisin) ,又称乳球菌肽或乳链菌
肽,是由某些乳酸链球菌( Strep tococcus lacti s )和乳
酸乳球菌( L actococcus lact i s )在代谢过程中合成、
分泌的具有很强杀菌作用的小肽。据报道迄今已发
现 3种 Nisin 天然异构体, 分别为 Nisin A, Nisin Z
和N isin Q。其中 Nisin A, Nisin Z 在结构上仅有一
个氨基酸差异, Nisin A 的第 27位氨基酸残基是组
氨酸[ 1] , N isin Z则是天冬酰胺, Nisin Q 是最新发现
的天然变异体,其结构与 Nisin Z 相差四个氨基酸,
与 Nisin A 相差三个氨基酸[ 2] 。
1 结构、性质与生物活性
1. 1 分子结构
Nisin分子式为C143 H 228 N 42 O37 S7 , 分子量约
收稿日期: 20050517
* 国家高技术研究( 863)发展计划项目( 2003AA241160)
作者简介:韩德强( 1979 ) ,内蒙古人,硕士研究生,主要从事微生物与基因工程方面的研究
**通讯作者:电话: 01062133407电子信箱: dinghongbiao@ mail . caas. n et . cn
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
3 510道尔顿, 是由 34个氨基酸组成的小肽。活性
分子常是二聚体或四聚体。Nisin的前体肽由 57个
氨基酸组成,其中 N端 23个残基构成信号肽, 信号
肽在细胞表面被肽酶水解去除后,释放出成熟的、有
生物活性的 Nisin。Nisin分子中含有一些修饰性的
氨基酸,包括羊毛硫氨酸( Lanthionine) , 甲基羊毛
硫氨酸 ( methy llanthionine ) , 脱氢丙氨酸 ( De
hydroalanine, Dha) , 甲基脱氢丙氨酸 ( Dehydrobu
ty rine, Dhb)。Nisin 分子高级结构中含有 5 个不同
于其它蛋白质的硫醚键构成的 5个环状结构。Nisin
分子除了存在 5个环外, 在肽链的 C端和 N端的顶
端区都具有一定的弯曲性。分子高级立体结构中
ABC 环在一边, D 和 E 环在另一边, 形成 绞链
区 [ 3] 。这些修饰性氨基酸的存在显示 Nisin在形成
过程中具有翻译产物的酶修饰作用。
1. 2 Nisin的性质
Nisin 有很高的热稳定性, 在 100 下加热
10~ 15m in 仍能保持 90% 以上的生物活性。由于
Nisin分子具有较强的阳离子特性, 因而对高离子强
度和低 pH 值均具有较强的抗性,在低 pH 时其分子
稳定性提高, 溶解度也提高, 具有很好的酸稳定性。
据 Tramer 报道,经 115. 6 高压灭菌的 Nisin在 pH
为 2. 0时是稳定的, 但在 pH 为 5. 0时失去 40%活
性, pH 为6. 0时失去90%的活性, pH 2. 5时溶解度
为 12% , pH 5. 0时下降到 4% , 在中性和碱性条件
下几乎不溶解。据研究, Nisin的这种热稳定性与其
分子中的 5 个硫醚桥密切相关, 但其具体机理还在
进一步探讨中。
1. 3 Nisin的生物合成模式
Nisin的生物合成过程, 首先由胞外的信号激活
位于膜上的组氨酸激酶( nisK编码) , N isK自身磷酸
化作用之后, 转移磷酸基到相关的调节因子 NisR,
NisR将前肽分子调节到膜上由修饰复合蛋白质
( nisB和 nisC 编码)进行修饰, 修饰肽与转运蛋白
NisT ( nisT 编码)相结合, 将修饰肽通过膜的转运,
附在膜外表面的 nisP 将前导序列切除, 释放有活性
的 Nisin 分子。NisI 通过脂蛋白锚定在细胞膜上,
在膜上浮动并与 Nisin 分子作用, 赋予细胞抗性, 阻
止孔洞形成。另外, 乳酸链球菌还通过 ABC 转运
蛋白质通道(由 nisF, nisE和 nisG 编码构成)起到自
我保护作用[ 4, 5]。
1. 4 Nisin的抑菌活性
Nisin能够抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢
的生长和繁殖, 如葡萄球菌属、链球菌属、乳酸球菌
属、梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌, 特别对金
黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌抑菌作用明
显[ 6]。Nisin对革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌无抑制
作用,但和某些络合剂(如 EDT A 或柠檬酸)等联合
作用或经超高压( UHP)和脉冲电场( PEF)处理, 可
以将其抑菌活性谱拓宽到部分革兰氏阴性菌 [ 7]。
1. 5 Nisin的抑菌机理
Nisin的作用位点为细胞膜, 许多研究者用多种
方法研究其作用机理。Nisin 可以抑制肽聚糖等物
质的生物合成, 使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻,
导致细胞内物质外泄, 使细胞裂解 [ 5]。有研究发现
Nisin单体中的脱氢丙氨酸( Dha)和甲基脱氢丙氨
酸( Dhb)可以与敏感型细胞膜中的某些酶的巯基发
生作用。Nisin能消耗敏感细胞的质子驱动力( Pro
to n Mot ive Force, PM F) , 导致 K + 、氨基酸从胞浆中
流出, AT P 泄漏, 胞外水分子进入, 引起细胞自
溶[ 8]。Nisin是一个带正电荷的阳离子分子, 在缺乏
阴离子膜磷脂的情况下, Nisin起阴离子选择载体的
作用,当存在阴离子膜磷脂时, N isin吸附在膜上,利
用离子间相互作用, 及其分子的 C 末端和 N 末端对
膜结构产生作用形成穿膜孔道,从而引起胞内物
质泄漏, 导致细胞解体死亡。Ralph 等人认为 Nisin
具有潜在的跨膜序列及高的偶极矩, 能使膜产生孔
道,同时使膜内外电位差丧失,破坏细胞通过电子传
递链产生能量的能力。因此 Nisin 主要通过破坏细
胞膜的完整性, 导致细菌产生穿孔死亡。
Nisin对芽孢具有杀死作用。研究表明, 当杀菌
过程完成后, Nisin 仍保持一定的活力。而且 Nisin
可提高芽孢对热的敏感性,这些残留的 Nisin 也能抑
制芽孢的发芽。经121 热处理3m in后存活下来的
孢子比未经加热损伤的孢子对 Nisin 敏感 10 倍以
上。这也是 Nisin特别适用于热加工食品防腐保鲜
的重要原因。
2 Nisin的基因工程研究进展
2. 1 乳酸菌表达系统
与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等目前常用的原核
36 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
表达系统不同, 乳酸链球菌和乳酸乳球菌是公认安
全的微生物。因此, 研究开发乳酸菌基因工程表达
系统,将一些有价值的基因在乳酸菌中表达, 已经成
为乳酸菌分子遗传学研究的热点。1992 年挪威的
Helen Dodd等首先从产Nisin 的乳酸乳球菌FI5876
出发,开发出一套乳酸菌表达系统, 该系统由 Nisin
诱导,用于表达外源基因 [ 9] , 尤其是类似于 Nisin的
细菌素通常能获得较好的表达。这样就为大量制备
细菌素提供了可能性 [ 10]。
2. 2 Nisin基因的克隆表达
Nisin基因本身位于乳酸链球菌或乳酸乳球菌
染色体的可接合转座子上, 转座子大小为 70kb, 称
为 Tn5031或 Tn5276 [ 4]。在其中 15kb的片段上分
布着 nisA、B、T、C、I、P、R、K、F、E 和 G 共 11个基
因[ 5] (表 1) , nis A为结构基因,其他基因与 nis A 紧
密连锁,它们涉及到 Nisin 的翻译后修饰, 修饰肽的
转运,先导序列的水解切割, 成熟分子的外泌, 以及
整个合成过程的调节和防止毒害的免疫性能等[ 11]。
这些基因构成一个长度约为 8. 5kb的多顺反子操纵
子,其中 5端有一个核糖体结合位点, 3端有一个
终止密码子和不依赖于因子的转录终止子。
表 1 Nisin基因簇功能及大小
基因簇 编码氨基酸数 功能 文献
ni sA 57 编码结构基因 [ 12]
ni sB 825 参与 Nisin前体的酶修饰, Ser、T hr 的脱水 [ 1]
ni sT 600 参与蛋白质转运 [ 1]
ni sC 414 与 nisB协同参与 Nisin修饰 [ 1]
ni sI 245 与 Nisin免疫性有关 [ 1]
ni sP 682 编码丝氨酸蛋白酶,切除前导肽 [ 1]
ni sR 228 编码调控蛋白 [ 1]
ni sK 446 编码组氨酸激酶,参与调控 [ 1]
ni sF 225 参与蛋白转运,与免疫性有关 [ 5]
ni sE 241 参与蛋白转运,与免疫性有关 [ 5]
ni sG 214 编码疏水蛋白,参与 Nisin通道形成 [ 5]
Nisin 是传统天然抗菌肽, 生物安全性很高, 具
有非常广泛的应用价值, 但其供应量有限, 因而妨碍
其广泛使用。如果通过生物工程技术将 N isin的结
构基因克隆到高效表达的重组菌株中, 那将具有更
广的应用价值。目前越来越多的研究者尝试通过基
因工程方法生产天然抗菌肽。1988年 Buchman 等
人首次从 L actococcus lact is 克隆到 N isin 基因[ 11]。
中国科学院微生物研究所于 1995年利用 PCR技术
从乳酸乳球菌 A TCC11454中克隆到 Nisin 的前体
基因[ 13] ,其后他们又从 Nisin高产菌株 AL2扩增了
Nisin的前体基因, 并将其转化到乳酸菌表达系统
中,成功的表达了 N isin, 经测定为 Nisin Z, 且具有
生物活性和很好的稳定性[ 14] ;并尝试利用定点突变
技术来提高 Nisin 产量, 通过构建含 nisZ 基因的质
粒 pHJ201, 将 NisinZ 分子中 B 环第 8位 Thr 定点
突变为 Ser, 第 2位 Dhb 突变为 Dha, 第 27 位 Asn
突变为 Lys, 第31位 His突变为 Lys,以 pMG36e为
载体,电击转化乳酸乳球菌 N Z9800 进行表达,结果
表明,突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化[ 15] 。
2. 3 Nisin高产菌株的诱导选育
也有许多研究者利用物理化学等诱变方法培育
筛选 Nisin 的高产量、高活性菌株及特殊用途的菌
株,如无耐药因子的乳酸菌菌株、风味好的和促进发
酵食品成熟的乳酸菌菌株、产生特殊酶系的乳酸菌
菌株、耐氧性能强的乳酸菌菌珠、具有粘附性和定植
能力的乳酸菌菌株等 [ 16]。中国科学院生态环境研究
中心环境生物技术室以乳酸乳球菌 ( L actococcus
lact is subsp. lact is)为出发菌株,采用理化诱变因子
反复诱变处理, 获得一株高产 Nisin 菌株, 通过发酵
条件优化、添加 Nisin合成的刺激因子及改变代谢条
件,已将 Nisin发酵单位成功地提高到 4 100~ 4 800
IU / m l的水平。山东大学也从酸乳酪中筛选出 Ni
sin高产菌株。根据国外最新文献报道, Nisin 的发
酵单位已达到 8 200IU / m l以上[ 5]。随着 N isin产量
的增加,生产成本大幅度降低,必将产生显著的经济
和社会效益。
372005年第 5期 韩德强等:乳酸链球菌素的分子结构、抗菌活性及基因工程研究
3 Nisin在食品和医药领域的应用
3. 1 Nisin在食品生产中的应用
Nisin在高热和胃酸的 pH 条件下有很大的稳
定性,具有很强的抗革兰氏阳性病原菌的活性,特别
是能抑制梭菌和杆菌形成芽孢,所以 Nisin作为对人
体安全、无害的天然防腐剂, 是惟一被允许用于食品
防腐的抗菌肽, 广泛地应用于乳制品、肉制品等的生
产上。
近年来高价值海产品养殖业, 如对虾、扇贝、鱼
类和鲍鱼等的养殖快速发展,但水质恶化、病菌增殖
使得养殖环境变差, 养殖业蒙受巨大的损失。人们
对引起鱼虾病害的主要病原菌之一的海洋弧菌进行
研究,发现乳链菌肽对其具有显著抑制作用[ 17] ,因而
Nisin的应用范围正在进一步扩大。
此外 Nisin还可以用于防治苹果收获后灰葡萄
孢菌( Botr y ti s ciner ea)和扩展青霉( P enici ll ium ex
p ansum )引起的腐烂 [ 18]。Cai等人从豆芽中分离产
Nisin的乳酸菌,用这些分离物改进蔬菜加工的安全
性。Fang等人对真空包装蔬菜用 Nisin和山梨酸钾
联合处理, 能有效地抑制金黄色葡萄球菌 ( S. au
reus)和蜡状芽孢杆菌( Bacil lus cereas )的生长繁殖,
延长蔬菜食品的货架期[ 19] 。
3. 2 Nisin在医药领域的应用
人们也正在探索将 N isin 应用于医药领域。
Kojima等人研究认为, N isin可以作为抗 HIV(人体
免疫缺损病毒 ) 的活性成分用来治疗艾滋病。
Mont ivulle等人研究了 Nisin 对结核菌(Mycobacte
rum smegmat is )的作用,认为 Nisin有望成为一种新
型的抗结核菌试剂[ 20] 。此外 Nisin 还可以添加到卫
生用品和化妆品中, 愈来愈与人类的日常生活紧密
结合。
4 前景展望
在饲料中添加抗生素严重破坏动物肠道的微生
态平衡,并且易在动物体内残留, 严重影响畜产品品
质和人类健康。抗菌肽作为一种有抗菌活性的蛋白
质,具有高效、安全的特性,在食品、医药等行业已得
到初步的应用, 但在饲料行业中还未有商品化生产
和实际应用。随着对动物产品安全性问题的日益关
注,开发一些新型、高效、安全无残留的抗菌物质成
为目前的研究热点, 其中 Nisin 是最具应用潜力的候
选者之一。作为一种经典的针对食品和饲料有害微
生物的高效、广谱食用抗菌剂,据报道 Nisin能杀灭
至少 100种以上的细菌, 如果利用基因工程技术构
建高效表达 Nisin的生物反应器,解决其在天然生物
体中含量低,生产成本昂贵的问题, 将为人们提供一
种有效安全的抗菌新途径。
参 考 文 献
1 Kuiper OP, Beerthuyzen M M, S iezen RJ, et al. J Bio Chem ,
1993, 216: 281~ 291.
2 Zendo T , Fukao M, Ueda K, et al. Biosci Biotechnol Biochem ,
2003, 67: 1616~ 1619.
3 Chung KT , Dick son JS, Crouse JD. Appl E nviron Microbiol ,
1989, 55( 6) : 1329~ 1333.
4 贾士芳,还连栋,王连琴. 生物工程进展, 1997, 17( 4) : 35~ 39.
5 M arja Tolon en. Doctoral Diss ertation , Finland, 2004: 17~ 22.
6 Cleveland J , M ontvill e TJ, Nes IF, et al. Food Microbiol, 2001,
71: 1~ 20.
7 李平兰, 张篪, 郑海涛.中国乳品业, 2000, 28( 4) : 50~ 53.
8 M cAulif f e O, Ross RP, Hil l C. FEMS M icrobiol Rev, 2001, 25
( 3) : 285~ 308.
9 Helen M Dodd, Nikki Horn, Zh ang H ao. A ppl En vi ron Mictobi
ol, 1992, 58(11) : 3683~ 369.
10 J oerger M C, Klaen hammer T R. J Bacteriol, 1990, 171: 1597~
1601.
11 Ingram L . Bioch em Biophys Acta, 1970, 224: 263.
12 Buchman GW, Banerjee S, H an sen JN. Biol Chem, 1988, 263
( 11) : 16260 ~ 16266.
13 还连栋, 陶勇,田宇清,等. 生物工程学报, 1995, 11( 4) : 389~
391.
14 陈秀珠,胡海箐,杨巍,等.遗传学报, 2001, 28( 3) : 285~ 290.
15 袁静,陈秀珠,张震中, 等.生物工程学报, 2003, 19 ( 2) : 185~
189.
16 孙超, 陈秀珠, 还连栋, 等. 生物工程学报, 2001, 17( 1 ) : 20~
23.
17 姜英辉,李光友. 海洋科学, 2002, 26( 2) : 54~ 58.
18 Neshaw y SM, W ils on CL. Postharves t Biol T echnol, 199710: 9
~ 14.
19 Fang TJ , Ch en CY. FoodSafe, 1999, 62: 1123~ 1127.
20 Mont ivill e T J, Chung HJ , Chikindas ML. Appl M icrobiol ,
1999, 28: 189~ 193.
38 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期