全 文 ：植物抗冻基因工程研究进展
黄文功1 殷奎德1 高中超2
( 1黑龙江八一农垦大学生命学院,大庆 163319; 2黑龙江省农业科学院土壤肥料研究所,哈尔滨 150086)
摘 要: 提高作物的抗冻性对于提高作物产量有着非常重要的意义。目前, 对冷诱导基因、CBF、ICE、抗冻
蛋白基因、脂肪酸去饱和酶基因、脯氨酸基因、SOD基因与抗冻的关系进行了广泛的研究, 研究表明对这些抗冻相
关基因进行转基因,可以提高植物的抗冻性。而一些抗冻基因应用到作物上,也可以提高作物的抗冻性。
关键词: 冷诱导基因 CBF ICE 抗冻蛋白 转基因植物
Advances in Gene Engineering of Plant for Cold Resistance
Huang Wengong
1 Yin Kuide1 Gao Zhongchao2
( 1 Coll eg e of L i f e , H ei long j iang A ugust 1st L and Rec lamat ion Univ er si t y , Daqing 163319;
2 The H ei long j iang A cademy of A g ri cul tural S ci ence s I nsti tute of S oi l and Fer ti l iz er , H ar bin 150086 )
Abstract: The enhancement o f fr eezing t oler ance for cr ops has significant meanings for the improvement o f
cr ops output. At pr esent, people has car ried out w idespread r esear ch on the COR, CBF, ICE, AFP genes, fatty
acid desat ur ate genes, pro line genes, SOD genes, fur thermore people has wo rked out the r elations bet ween these
genes and freezing to lerance. It turned out to pro ve to improve the freezing tolerance fo r plant by carr ying out tr ans-
gene for plant wit h these relev ant g enes. Some fr eezing to ler ance genes will be applied to the cr ops and could in-
cr ease the freezing to ler ance of cr ops.
Key words: Cold induced genes CBF ICE Antifr eeze pro tein T ransgenic plants
随着人口的增长和耕地面积的不断减少, 如何
提高作物的产量越来越受到人们的广泛关注, 而气
候条件是影响作物产量的重要因素之一。冻害一直
制约着作物产量的提高, 较为严重的冻害甚至造成
作物绝产,所以,如果能培育出抗冻作物品种, 就可
能延长作物的生育期, 同时也会抵御骤然低温对作
物造成的不良影响,对提高作物的产量有着非常重
要的意义。因此,培育耐寒和抗冻的作物品种无疑
是一种最佳的选择。但是通过常规育种方法很难培
育出抗冻的作物品种。近年来, 随着基因工程技术
在作物品种改良方面取得了重大进展, 具有可控性
强、效率高、周期短、成本低等优点的基因工程技术
已经成为新品种选育的一条全新而有效的途径。
1 冷诱导基因 ( COR)、CBF 转录因子、ICE
转录激活因子及它们三者之间关系
1. 1 COR( cold induced gene)基因
目前已知的植物抗冻基因主要为环境诱导表达
的基因及某些组成性表达的基因。前者指冷驯化
(植物自身适应环境的结果) ,后者是通过基因工程
技术克隆出抗冻基因, 连上强启动子或冷诱导启动
子转入植物,获得转基因植株,进而提高植株的抗冻
性。如有骤然低温或霜冻来得较早的年份,前者来
不及反应就受到冻害, 而后者目的性强,对低温迅速
做出反应,因此,育种上经常采用此种方法来培育抗
冻作物品种。COR基因是冷诱导基因,在它的启动
子区域 含有具有五个碱基核心序列 CCGAC 的脱
水反应元素 DRE( dehydrat ion-responsive element )
DRE做为顺式作用启动子元素,能在低温胁迫时激
活 COR 基因的表达[ 1]。Masakazu Hara 等将 Cu-
COR19转入烟草,和对照烟草植株相比较,转基因
收稿日期: 2005-10-14
作者简介:黄文功( 1980- ) ,男,黑龙江鸡西人,在读硕士研究生
通讯作者:殷奎德, E-mail: yinku ide@ sohu . com Tel: 0459-6819291
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
植株电渗值较低、发芽率较高、抗冻性有所提高 [ 2]。
Tuula Puhakainen等于 2004 年将 RAB18, COR47
( pTP9) 以及 LT I29, LT I30 ( pTP10)分别构建到植
物表达载体 pDE1001, 之后分别电击转化到农杆菌
pGV2260中,以此农杆菌分别侵染拟南芥。低温条
件下,转基因拟南芥植株和对照植株相比降低了
LT 50 ,并且转基因植株的存活率也明显高于对照
植株[ 3] 。
1. 2 CBF( c-repeat-binding facto r)转录因子
一个典型的植物转录因子包括: DNA 结合域、
低聚糖位置、转录调节区域和一个核酸定位信号 [ 4]。
CBF 转录因子的发现是近年来植物抗逆研究方面
最具突破性的发现。拟南芥中的 CBF 家族包括
CBF1、CBF2和 CBF3, CBF2、CBF3与 CBF1 的基
因序列有较高的同源性, 分别为 81%和 84% , CB
F1、CBF2和 CBF3位于拟南芥的第 4号染色体, 并
且串联在上面[ 5] 。这三种基因的强表达使拟南芥生
长缓慢、花期延迟、脯氨酸和蔗糖含量增加, 同时使
拟南芥抗冻性也得到一定提高[ 6]。这三种 CBF 能
结合到 COR基因的 DRE 序列上, 从而诱导一系列
COR基因的表达, 因此有人把 CBF 转录因子看作
低温时激活一些 COR 基因的开关。目前已发现
CBF 调控的抗冻基因至少有十几种, 如: rd29A、
It i78、cor 78、cor15a、kin2、cor6. 6、er d10、kin1、rd17、
cor47、Fl3-5A3、Fl5-77、Fl5-94、Fl3-27、Fl-l 5-2122
和 er d14。
CBF1连上 CaMV35S启动子转入拟南芥,检测
未经低温处理的转基因植株发现: CBF1持续强表
达诱导了 co r6. 6, cor15a, cor47 和 co r48基因的表
达, 提高了拟南芥植株的抗冻性[ 5]。CBF2 在拟南
芥胁迫抗性中起重要作用, 有实验表明在 CBF2 被
破坏的拟南芥植株中 CBF1和 CBF3的表达增强,
这表明: CBF2是 CBF1和 CBF3表达的一个负调节
子[ 1]。拟南芥中的 CBF3能刺激 40多种胁迫诱导
基因的表达, 如 rd29, cor15A, co r47 等[ 7] , M ichael
F. Thomashow 等于 2001 年将拟南芥中的 CBF3
基因分别连上 CaMV35S 启动子、冷诱导启动子
rd29A,之后转入烟草中, 二者都提高了烟草植株的
耐低温能力[ 5]。
1. 3 ICE( inducer of CBF expression)转录激活因子
ICE是在低温时诱导 CBF 家族表达的转录激
活因子,它在低温时能特定地结合到 CBF 的启动子
序列上,诱导 CBF 的表达, 而后 CBF 结合到其下游
目的基因启动子的 DRE 序列上, 诱导 COR 的表
达,从而提高植株的抗冻性[ 5] 。V isw anathan Chin-
nusamy 等于 2003年已经从拟南芥中得到 ICE1( in-
ducer o f CBF expression 1) ,并且连上 CaMV35S启
动子转入拟南芥, 获得了含 ICE1基因的转基因拟
南芥植株,通过检测证实转基因拟南芥植株的抗冻
性有很大的提高[ 7] 。
2 抗冻蛋白基因及其转基因植物
近年来, 人们对植物抗冻基因进行了深入的研
究,揭示了植物抗冻性除受多基因协同控制外, 某些
单基因也起了重要作用。因此, 这些单基因有可能
用于植物抗冻基因工程。在不影响作物产量、品质
的情况下,利用植物转抗冻蛋白基因手段培育抗冻
品种已成为一条全新而有效的途径。
抗冻蛋白( antif reeze pr otein, AFP)是 20世纪
60 年代从极地海鱼的血清中发现的一种具有阻止
体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态
的高效抗冻活性物质。抗冻蛋白存在于不同的生物
体中,包括鱼类、昆虫和植物,但对鱼类抗冻蛋白的
研究较多[ 8]。James G. Wallis等人于 1997年将植
物凝集素和 AFP 共同构建到植物转化载体 pKY-
LX35S
2中, 之后在转化马铃薯中发现, 在-2 条件
下,非转基因马铃薯叶片的电渗值比转基因马铃薯
叶片的高 2倍多, 而且非转基因植株遭受到了严重
的冻害[ 9] 。T ao Huang 等人于 2002 年将树状抗冻
基因 dafp-1基因转入拟南芥, 而后和对照植株相比
转基因植株的抗冻性提高了 0. 6~ 3. 3 [ 10]。Con-
gm in Li等于2005年从云杉蚜虫中分离得到抗冻蛋
白 CfAFP-501,并且分析出此蛋白的结构[ 11]。
2. 1 鱼类 AFP及转鱼类 AFP 基因植物
对鱼类 AFP 研究的较多并且起步较早, 早在
20世纪 70年代初期就已经从海洋鱼类的血清中发
现了抗冻蛋白, 并且已作了比较系统深入的研究。
Georges F. 等将人工合成的黄盖鲽鱼 AFP 基因导
入玉米原生质体,并在植物细胞中获得了表达[ 12]。
Hightow er R.等利用农杆菌将比目鱼体内 AFP 基
因转入番茄,结果表明这种转基因番茄的组织提取
2 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
液在冰冻条件下能有效阻止冰晶增长[ 13]。
2. 2 昆虫 AFP 及转昆虫 A FP 基因植物
由于昆虫 AFP 的热滞活性明显高于鱼类和植
物,因此,其 AFP 基因的导入可能更有效地提高转
基因植物的抗冻性。冬季某些昆虫血淋巴的热滞活
性为 3~ 6 ,最高达到 8~ 9 , 明显高于血清抗冻
蛋白的热滞活性( 1~ 2 )。T yshenko等于 1997年
从甲虫和云杉卷叶蛾中分离到的抗冻蛋白的活性是
鱼类抗冻蛋白的 10~ 100倍 [ 14]。2001年 Holmberg
等第一次将云杉蚜虫 AFP 基因与 CaMV35S 及胭
脂碱合成酶基因组成重组基因后转入烟草, 发现转
基因烟草中质外体云杉蚜虫 AFP 的表达能抑制冰
重结晶,并且提高了热滞值[ 15]。
2. 3 植物 AFP 及转植物 A FP 基因植物
与鱼类和昆虫抗冻蛋白相比, 植物 AFP 研究的
较晚。直到 1998年 10月, Daw n Worr all 等在Sc-i
ence上发表了胡萝卜 AFP 及其基因的研究论文,
这标志着第一个植物 AFP 基因的发现, 并且将此
AFP 基因连接在表达载体上转化烟草, 获得了表达
并且产生了 AFP, 提高了转基因烟草植株的抗冻
性[ 16] , 1999 年 M ichael 等从桃树 ( Prunuspersica)
的树皮中提取到一种脱水蛋白 PCA60, 这是第一次
发现具有脱水素蛋白特性的抗冻蛋白, 其富含赖氨
酸、甘氨酸,分子量为 50ku,具有较强的修饰冰晶能
力[ 17]。最近克隆到的植物抗冻蛋白基因还包括黑
麦草 1117kD 的 AFP 的 cDNA [ 18] ; 冬黑麦[ 19] 中
3117kD的 AFPs的 CHT 基因, 2418kD的 AFPs的
CH T46基因。其中来自冬黑麦中的这两个抗冻蛋
白基因,均已被转化到大肠杆菌中, 检测结果表明,
表达蛋白具有抗冻活性。2002年 Y. Fan 等以胡萝
卜幼苗为模板进行 PCR扩增,克隆到一个1, 099-bp
的抗冻蛋白基因, 连上 CaMV35S 启动子, 构建到
pCAMBIA2300载体上后转入烟草, 0 条件下, 转
基因烟草所受的冻害明显轻于对照烟草 [ 20]。
3 脂肪酸去饱和酶基因及其转基因植物
很多研究表明,低温冻害导致生物生物膜的透
性改变。低温引起膜脂的物相发生变化, 使膜脂由
正常的液晶态变为凝胶态, 如果在低温下能保持膜
脂的液晶状态, 则植物的抗冻性提高;而增加膜脂中
不饱和脂肪酸的比例即可维持膜的液晶状态, 防止
膜类固化,即能提高抗冻性。
Mur ata N. [ 22] 等将南瓜藤和拟南芥中得到的甘
油 3-磷酸酰基转移酶基因导入烟草中, 明显改变磷
酸酰甘油的脂肪酸组成, 并提高其抗冻力。Polas-
hock J.等将酵母的-9 脂肪酸去饱和酶基因, Ko-
dama H .等将拟南芥的编码 -3脂肪酸去饱和酶的
fad基因, Ma J.等将菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱
和酶 SAD基因, 分别导入烟草中均增强了转基因烟
草的抗冻性 [ 23~ 25]。Kodama H . 等将拟南芥叶绿体
-3脂肪酸脱氢酶基因 fad7导入烟草中增强转基因
烟草抗冷性[ 26] 。
4 脯氨酸基因及其转基因植物
冷驯化后脯氨酸含量增加, 表明脯氨酸可能与
植株抗冻性有关。脯氨酸是水合能力较强的氨基
酸,其含量增加有助于细胞持水和生物大分子结构
的稳定。Leslie A. w anner 等报道,低温处理 5天的
拟南芥植株中脯氨酸含量比未低温处理的对照拟南
芥植株高 3~ 5倍 [ 27]。
未经低温处理 CBF3强表达的拟南芥植株中脯
氨酸的含量比对照植株高 5倍, 其含量相当于低温
处理对照植株的脯氨酸含量。低温处理条件下,
CBF3强表达的植株中脯氨酸的含量也比对照植株
高 2~ 3倍[ 28]。C.-Y. He 等于 2002 年从大豆 cD-
NA 中克隆到一个编码脯氨酸的基因, 将此基因命
名为 SbPRP, 此基因对抗冻起到一定作用[ 29]。D.
Par vanova等于 2004年将脯氨酸基因转入拟南芥,
转基因和对照植株经过-2 处理 12h, 转基因植株
存活而对照植株死亡 [ 30]。Deir dre Gleeson 等于
2005年利用农杆菌将 V igna aconit ifo lia 基因转化
到落叶松,结果转基因植株的脯氨酸含量比未转基
因的对照植株高 30倍,转基因植株的抗冻性得到很
大提高[ 31] 。
5 SOD基因及其转基因植物
低温条件下,细胞内活性氧的产生和清除平衡
遭到破坏,膜系统稳定性受到影响, 活性氧积累, 使
膜脂发生过氧化和脱脂作用, 从而破坏膜结构, 而
SOD可清除活性氧, 维护膜系统稳定性。
将含有 SOD的 cDNA 转入烟草、番茄等植物
中,强表达后都提高了植物的耐氧化能力,这对植物
抗冻具有重要意义。Mckersie 将烟草中克隆的
32006年第 2期 黄文功等: 植物抗冻基因工程研究进展
MnSOD的 cDNA 置于 35S 启动子下转化苜蓿, 结
果转基因植株的抗冻性有所提高[ 32] 。H.-S. Lee
等于 1999 年从木薯的 cDNA 中克隆到 mSOD1,
mSOD1编码 152 个多肽, 将 mSOD1 基因转入木
薯,转基因植株和对照植株相比抗冻性有一定提
高[ 33]。F. Bagno li等于 2001年从桃树 cDNA 中克
隆到 MnSODs [ 34]。
6 展望
提高植物的抗冻性, 培育抗冻作物品种对于农
业具有十分重要的意义。然而, 作物的抗冻性状一
般受多基因控制,且与品质低劣性状(如矮化、倒伏、
结实率低等)紧密连锁。解决这个问题有两个办法:
( 1)转化那些翻译后修饰的转录因子基因,如非低温
胁迫时 35S: DREB2A ( DRE-binding protein)植株
只表现轻微的生长阻碍, 在低温时这种转录因子才
诱导 COR基因表达; ( 2)使用冷诱导型的启动子,
如使用冷诱导启动子 rd29A 的 CBF3转基因时, 拟
南芥的不利性状大大减小[ 35]。尽管现在有关抗冻
基因及转抗冻基因植物方面的研究不多, 但是我们
相信在不远的将来转入抗冻基因的植物一定会得到
飞速的发展。
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