全 文 ： 生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
小麦高分子量麦谷蛋白亚基的 SDS-PAGE方法
张丽 张建刚 潘登奎 薛春平
(山西农业大学,太谷 030801)
摘 要: 小麦高分子量麦谷蛋白亚基( H MW-GS)与小麦面粉的加工品质密切相关, SDS- PAGE 是其常用分
离方法。在前人工作的基础上摸索了一套适于分析 HMW-GS 的 SDS-PAGE 方法, 具有简便、快速、微量、不影响
种子萌发出苗、分辨率好、制成干板清晰、不皱缩、易保存等优点,以供有关工作者参考。
关键词: HMW-GS SDS-PAGE 小麦 方法
A New SDS-PAGE Method to HMW-GS of Wheat
Zhang Li Zhang jiangang Pan Dengkui Xue Chunping
( S hanx i Univ ersi ty of A g ri cul tu re , T aig u 030801)
Abstract: The processing quality of wheat f lour is closely r elated w ith HMW-GS, and SDS-PAGE is usually
used in it s` separat ion . A new SDS-PAGE method of high molecular w eight subunit of wheat glut enin was found and
it has been proved to have character s of simple, rapid to use , without destro y and small quant ity to seed and high re-
so lving , clear, w ithout shrink and easily preser ved to dr y slab.
Key words: HM W-GS SDS-PAGE Wheat Method
小麦谷蛋白只占面筋蛋白的 35% 左右, 但对面粉的烘烤品质起着重要作用。国内外大量研究证
实[ 1~ 3] , 高分子量麦谷蛋白亚基复等位基因控制,通常每个染色体上两个基因连锁遗传。控制所有 HMW-
GS 的基因位于部分同源群 1A、1B与 1D的长臂上, 统称为 GLu-1位点。关于 HMW 谷蛋白单个亚基等位
基因对品质的效应多数研究结果基本一致[ 4, 5]。自从应用 SDS-PA GE 分离蛋白质多肽混合物以来, 至今已
提出了许多用来分析 HMW-GS 的 SDS-PAGE 方法 [ 6~ 8]。SDS-PAGE 在小麦遗传育种、品种登记、鉴定等
工作中被广泛应用。WALKERJM [ 9] 详细介绍了一种适于分离 10~ 100KD 分子量范围的蛋白质 SDS-
PAGE方法, 该方法不能直接用来分离分子量在 90~ 147KD的 HMW-GS。栗站稳[ 10] 、李学军[ 11] 、等各自摸
索了一套分析 HMW-GS的 SDS-PAGE 方法,但某些步骤过于复杂, 且耗时较长。本研究通过切取小麦子
粒无胚端 1/ 4分离 HMW-GS方法, 有胚端进行播种,连续 3次回交。采用此法分析了 2 400份小麦子粒杂
交材料,取得了良好的效果。本文介绍了该方法的具体应用,以供小麦品质育种工作者参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 小麦样品 含有不同 HMW- GS 的小麦杂交种子,以中国春( CS)小麦做对照品种。
1. 1. 2 仪器 北京六一仪器厂 DYCZ-24D 型 8cm 10cm 双垂直电泳槽, 样品梳为 10或 15 槽。Hoefer
EPS电泳仪。金坛市富华有限公司生产的 HY-5回旋振荡器。河南巩义市英峪予华仪器厂生产的循环水多
用真空泵。Hoefer 凝胶干燥器。上海安停科学仪器厂生产的 TGL-16C 型离心机最大转速 16000r/ min.
SYNGENE凝胶成像系统。
收稿日期: 2005-11-24
基金项目:山西省自然基金项目,编号 20021806
作者简介:张丽( 1977- ) ,女,山西农业大学硕士研究生, Tel: 13835487139
1. 1. 3 试剂 丙烯酰胺( Acr ylamide)超纯级; N , N-亚甲基双丙烯酰胺( Bis- A cry lam ide)超纯级;三羟甲
基氨基甲烷( T ris)超纯级;十二烷基硫酸钠( SDS)超纯级; N, N, N, N一四甲基乙二胺( TEMED)超纯级;
考马斯亮兰 G250( Coomassie blue)超纯级; 过硫酸铵( AP)超纯级; -巯基乙醇( 2-M ercapto ethano l)生物技
术级;甘氨酸( Glycine)生化试剂级; 甘油 ( Gly cerol )分析纯; 异丙醇( Isopropanol )分析纯; 冰醋酸 ( A cetic
acid)分析纯;盐酸( HCL)分析纯; 溴酚蓝( Bromophenol blue)分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 溶液的配制及与有关方法的比较 有关溶液配制的详细情况,及其与栗站稳 [ 10]、李学军 [ 11]等实验方
法的比较,见表 1。
表 1 本研究与栗站稳、李学军等实验方法的比较
溶液 试剂 栗站稳方法 李学军方法 本实验方法
样品提取液 SDS 2. 000g 2. 000g 2. 000g
-巯基乙醇 50. 000ml 5. 000ml 4. 5000ml
甘油 Glycerol 10. 000ml 10. 000ml 10. 000ml
溴酚蓝 0. 001g 0. 002g 0. 025g
Tri s pH = 6. 8 0. 800g 0. 757g 1. 039g
凝胶贮藏液 T = 20% T= 30% T = 30%
C= 2. 6% 4 保存 C= 2. 67% 4 保存 C= 2. 67% 4 保存
分离胶缓冲液 0. 4% SDS 18. 2% Tris 1mol/ L t ris- HCL 3mol/ L t ris-H CL
pH 6. 8 4 保存 pH 8. 8 4 保存 pH 8. 8 4 保存
浓缩胶缓冲液 0. 4% SDS 6. 0% Tris 1mol/ L t ris- HCL 1mol/ L t ris-H CL
PH 6. 8 4 保存 PH6. 8 4 保存 PH 6. 8 4 保存
电极缓冲液 Glycine 14. 4g Tris 3. 0g Glycine 14. 4g T ris 3. 0285g Glycin e 11. 4g T ris 3. 000g
SDS1. 0g 1000ml定容 SDS1. 0g 1000ml 定容 SDS1. 0g 1000ml定容
染色液 R 250 0. 25g R2500. 1g G 250 0. 1g
甲醇 125ml 甲醇 160ml 异丙醇 25ml
冰乙酸 25ml 冰乙酸 28ml 冰乙酸 10ml
蒸馏水 100ml 蒸馏水 212ml 二次蒸馏水 65ml
脱色液 甲醇 100ml 甲醇 320ml 异丙醇 250ml
冰乙酸 100ml 冰乙酸 56ml 冰乙酸 250ml
蒸馏水 800ml 蒸馏水 424ml 二次蒸馏水 650ml
1. 2. 2 电泳程序 HMW 麦谷蛋白的提取: 小麦子粒无胚端切取 10 2mg 胚乳,钳碎装入编号的 Eppen-
dorf管中(其余部分装入编号袋中,根据 HMW-GS指纹分析结果,作为单粒传育种取舍依据) ;加入 150l
样品提取液,旋涡震荡 10m in, 3 000r/ m in离心 10s, 室温下浸提 2h(或过夜) ;沸水浴煮 2~ 3m in, 冷至室温,
8 000r/ min离心 4min,上清夜备用上样。
灌胶及点样: ( 1)将两块 8cm 10cm的玻璃板三边夹一整体的硅胶管, 构成胶室。( 2)配制分离胶工作
液,按表 2先将除 TEMED 以外的溶液混合。将混合液放入玻璃真空干燥器中抽真空 10m in, 然后加入
TEMED迅速摇匀。灌入胶距玻璃板 1. 5~ 2. 0cm 时,加压水层至满。作用其一是隔绝空气, 其二是压平胶
面,室温聚合 25~ 30m in。( 3)待分离胶聚合后,倒掉压水层, 并用滤纸吸干余水。( 4)滤纸千万不要接触胶
面,以防损伤凝胶床面。按表 2配制浓缩胶,真空排气 10m in, 加入 TEMED, 摇匀后,立即灌入备好的模具
中,插入梳子,静置聚合 25~ 30min。( 4)浓缩胶聚合后, 小心拔出梳子, 用电极缓冲液冲洗样槽两次, 并用微
量注射器吸掉样槽缓冲液。( 5)上样,用移液枪向样槽内加 15l样品浸提液,然后加入电极缓冲液。
电泳: 接通电泳仪,在稳压条件下 70V, 电流每板约 20mA, 电泳 3. 5~ 4h, 溴酚兰指示剂行至下边沿
0. 5cm,停止电泳。
染色、脱色: 电泳结束后,取下玻板,将胶小心剥下,并用小刀切掉一个角作为加样顺序的标记。将胶片
置于染色槽,去离子水洗胶一次,然后加入染色液约 50ml, 置于摇床, 以 30~ 40次/ min轻摇 15~ 20min(小
心勿损坏凝胶)。回收染色液(可重复使用 2~ 4次)后,再加入约 50ml脱色液脱色两次, 每次约 15m in, 最后
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用 7%冰醋酸固定。拍照记录可以在固定之前也可在后, 不影响结论,也可制成干胶长期保存。
表 2 本研究的凝胶系统
试剂 分离胶工作液 浓缩胶工作液
10% 6%
凝胶贮藏液( 30% T, 2. 67% C) 6. 6ml 4ml 0. 6m l
蒸馏水 8. 0ml 11ml 3. 2m l
T ris H cl ( 1. 0mol/ L, pH 7. 0) 0. 75m l
T ris H cl ( 3. 0mol/ L, pH 8. 8) 2. 5ml 2. 5ml
20% SDS 100l 100l 34l
0. 56%过硫酸铵 2. 5ml 2. 5ml 1. 5m l
TEMED 20l 20l 6l
总体积 20ml 20ml 7m l
在本实验条件下所做结果见图 1。
图 1 小麦杂交种子高分子量麦谷蛋白亚基的 SDS-PAGE电泳效果图谱
本系统亚基编号按 PAYNE [ 12]等方法进行编号。
2 结果与讨论
本方法在总结前人工作的基础上作了如下调整: ( 1)用小型的电泳槽, 8cm 10cm 的玻璃板, 既节约电
泳时间,又节省试剂。在研究 HMW-GS时,此宽度分离效果已相当好。( 2)此电泳系统组装玻璃板时, 不用
涂凡士林密封, 只需将硅胶管夹紧,省去一些步骤,也不用担心漏胶、漏液。( 3)将染色液、脱色液中的甲醇用
异丙醇替换,这样可以降低毒性。因为甲醇属于剧毒性试剂, 极易挥发, 使用不慎时轻则致失明, 重致死亡。
将水、异丙醇、冰醋酸的比例调整,可大大缩减染色、脱色时间(由 3~ 5h 缩减到 1h) ,减少了做大量检测时非
人力因素带来的不便。
该方法是建立在种子蛋白质组成差异基础上的生化测定方法,涉及到化学、生化、遗传学和植物学等多
方面的知识,因此在电泳过程中应注意以下几个问题: ( 1) Glu-A1 编码的 2* 亚基与 Glu-D1 编码的 2 亚基
在上述 T 为 10%的分离胶中难以辨认,需用低体积分数 T 为 6%的分离胶进一步分离尚可辨认, 其他因素
不变。( 2)分离胶和浓缩胶均需充分抽气,既可以避免灌胶时产生气泡, 又可用来防止分子氧因消除游离基
而抑制或阻止凝胶聚合。
实践证明该技术简便、快速、微量、不影响种子萌发出苗、成功率高, 仪器和药品易在国内买到。近年来
国内外已将小麦种子谷蛋白电泳分析广泛应用到小麦品种鉴定、纯度检验、亲缘关系分析、异代换系、品质预
测等方面,尤其是小麦品质改良的工作者应重视这一技术, 用以提高育种效率。 (下转第 84页)
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5 邢世岩,孙霞.武汉植物研究, 1996, 14( 3) : 279~ 286.
6 姜玲,蔡礼鸿.植物生理学通讯, 2000, 36( 4) : 340~ 342.
7 潘伟明,梁红,余胜康.仲恺农业技术学院学报, 2002, 15( 2) : 45~ 48.
8 钟海文,杨中汉.果树科学, 1982, 18( 1) : 1~ 4.
9 四川省林科所种源组. 四川林业科技, 1981, ( 4) : 12~ 13.
10 何梅,李懋学.遗传, 1996, 18( 3) : 3~ 5.
基因干预治疗的新星 RNAi 信息交流
第四军医大学王立峰、李莹、刘新平、药立波科研工作者快速发展了 RNA i( RNA inter ference)技术,为
选择性抑制特异性基因的表达提供了有利的工具。RNA i是外源的 ds RNA ( double st rand RNA, > 19 bp)
进入细胞后,激活细胞内的自然存在的加工活性, 引起对侵入的外源 ds RNA 及具有同源序列的单链 RNA
降解(包括内源性的 mRNA)的现象。RNAi技术目的多作为基因功能研究的有利工具,随着 RNAi分子机
制研究的不断深入, 它将成为最有潜力的基因干预治疗方法。
RNAi的简要机制:在动植物细胞中, 细胞内暴露 ds RNA ( double st rand RNA)会导致与其同源的
RNA 的转录后基因沉默 ( PTGS) ; RNAi简单模型: 当 ds RNA 导入细胞后, 被 Dicer 所激活。它是一种
RNase Ⅲ样的酶, 含有一个螺旋结构域 helicase domain 切割成为 21~ 25bp的 siRNA( small interference
RNA, siRNA)。这一个过程需要 ATP 能量, 被切割成 21 ~ 25bp 的 siRN 再与 RNA 诱导沉默复合物
( RNA-induced silencion complex , RISC)结合并激活, s iRNA 在 ATP 提供能量后解链, 以它的反义链作为
模板识别目的 mRNA,引导 RISC对其进行降解,最终抑制目的基因的表达。反义的 siRNA 可能是通过传
统的Watson-Cr ick碱基配对原则,与目的基因特异性结合而执行相应功能。siRNA 的反义链结合到目的
mRNA 后,不仅诱导 RISC 对该基因进行降解, 同时还激活 RdRp( RNA-dependent RNA Polymer ase)介导
的单链 RNA 的合成, 产生大量的 dsRNA。这些 dsRNA 再次被 Dicer 切割成许多 siRNA, 进入下一个
RNAi的循环。为此, 只需要少量的 dsRNA 就可产生高特异性的、高效的基因沉默作用。另外, dsNRA 的
导入还必须避免它介导产生 PKR抑制效应。然而对质粒、病毒载体的改造已提高了转染 RNA或 DNA 的
组织特异性与效率, 若加入布此卡因麻醉剂到 DNA 和脂质体复合物中, 就能提高对哺乳动物的转染效率。
对 RNAi与基因组功能的研究,可找到特异受体, 酶或其他效应分子与激活效应的关系。早期实验通过
转染长链 dsRNA 诱导 RNAi,引起基因沉默,从而可在果蝇中分析胰岛素的信号转导途径。RNAi可以抑
制病毒的复制和感染;若用 RNAi,以 M-BCR/ ABL 的融合处作靶位点,可封闭 M-BCR/ ABL 的表达。因为
M-BCR/ ABL 的融合只在白血病细胞中才存在, 且 M-BCR/ ABL 的敲除强烈诱导细胞已凋亡, 故可间接起
到选择性杀伤白血病细胞的作用。
RNAi技术是一种很有用的研究工具,且在基因干预治疗应用中有很大的潜力,它将会在应用前景中超
过反义核酸技术和三链结构复合体技术,不久很快成为一种最有效的基因治疗手段应用于临床。 秦春圃
(上接第 80页) 参 考 文 献
1 Lukow OM, Payn e PI, T kachuk R. Sci Food Ap ric, 1987, 40: 51~ 65.
2 Roger WJ, Payne PI, H arin der. Plant Breeding, 1989, 103: 89~ 100.
3 马传喜,吴兆苏.作物学报, 1993, 19( 16) : 562~ 566.
4 Payne PI, Law CN, Mudd EE. T heor Appl Genet , 1980, 58: 113~ 120.
5 毛沛.小麦高分子量麦谷蚕白亚基组成及其与面包烘烤品质关系的研究.河北农业大学硕士论文, 1993.
6 Payne P I, H olt LM , Law CN, et al . Theor Appl Genet , 1981, 60: 229~ 236.
7 M oon en JH E, Scheepsst raa, Graveland A. Euph ytica, 1982, 31: 677~ 690.
8 U hlen AK. Norw egian J ou rnal of Agriculture S cien ces, 1990, 4: 19~ 26.
9 Walker JM . Proteins, 1984, 1: 41~ 45.
10 栗站稳,阎旭东,卢少源,等.河北农业大学学报, 1994, 17( 2) : 19~ 23.
11 李学军,曹丽华,王辉,等.河南农业大学学报, 2003, 37( 3) 209~ 212.
12 Payne P1, Law rence. Cereal Research Communication s, 1983, 11( 1) : 29~ 35.
84 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期