全 文 ：doi:10． 3969 / j． issn． 1000-484X． 2014． 07． 011
·免疫学技术与方法·
大籽蒿花粉过敏原的分离、鉴定与纯化①
李兴永 肖小军② 孙宏治 何韶衡 杨平常② 刘志刚②
(辽宁医学院附属第一医院，锦州 121000)
中图分类号 Ｒ593. 1 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2014)07-0913-04
①本文为国家自然科学基金(No. 811160129、81302553)、广东省高等
学校国际暨港澳台科技合作创新平台项目(No. 2012gjhz0009)、深圳
市科技计划国际科技合作项目(No. GJHZ20130408174 112021)。
②深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，深圳 518060。
作者简介:李兴永(1989 年 － ) ，男，主要从事消化道肿瘤及过敏性
疾病过敏原的研究，E-mail:lxylnmu@ 126． com。
通讯作者及指导教师:刘志刚(1959 年 －) ，男，教授，主要从事过敏
原疫苗及过敏性疾病研究，E-mail:lzg@ szu．
edu． cn。
［摘 要］ 目的:对我国蒿属花粉中常见的大籽蒿花粉进行分离、鉴定与纯化。方法:提取大籽蒿花粉粗浸液，通过聚
丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质组分，并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量(Mr) ;免疫印迹(Western
blot)鉴定花粉主要过敏原;通过 DEAE-Cellulose DE-52 离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)对大籽蒿花粉过敏原
进行纯化和免疫印迹鉴定。结果:分离后得到 20 多种蛋白组分，其中分子量(Mr)为 62、57、38、29、25、14 kD 6 个条带蛋白含
量最丰富，其中 Mr为 62 kD和 16 kD的蛋白条带与确诊的蒿属花粉过敏患者血清特异性 IgE结合率最高(均 ＞ 50%) ，为其主
要过敏原，离子交换层析纯化后可得到 Mr为 62、16 kD的过敏原。结论:大籽蒿花粉的主要过敏原为 Mr 62 kD和 16 kD的蛋
白组分，离子交换层析技术可以对 Mr为 62 kD、16 kD的主要过敏原成分进行纯化。
［关键词］ 大籽蒿花粉;过敏原;SDS-PAGE;Western blot;离子交换层析
Identification and purification of major allergens in Artemisia sieversiana pollen
LI Xing-Yong，XIAO Xiao-Jun，SUN Hong-Zhi，HE Shao-Heng，YANG Ping-Chang，LIU Zhi-Gang. First Affiliated
Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China
［Abstract］ Objective:To isolate，identify and purify the Artemisia sieversiana pollen，the mostly widespread pollen among the
Artemisia pollens in China. Methods:Artemisia sieversiana extract was precipitated by saturated ammonium sulfate and then electro-
phoresed by SDS-PAGE. The molecular mass of each protein band was determined by gel media system. The primary allergen proteins
were identified by Western blot. Allergen proteins were purified and identified by DEAE-cellulose DE-52 ion exchange chromatography
(IEC)and Western blot. Ｒesults:We isolated more than twenty protein bands from Artemisia sieversiana pollen extract，including the
most abundant six bands whose Mr were 62 kD，57 kD，38 kD，29 kD，25 kD，14 kD espectively. The protein bands with Mr were 62 kD
and 16 kD had the highest binding capacity with the specific IgE from Artemisia pollen allergic patients. The DEAE-cellulose DE-32
IEC was used to purify the primary allergen proteins with Mr 62 kD and 16 kD. Conclusion:The primary allergens of Artemisia siever-
siana include the allergen proteins whose Mr are 62 kD，16 kD and the allergen of Mr 62 kD and 16 kD can be purified by chromatogra-
phy.
［Key words］ Artemisia sieversiana;Allergen protein ;SDS-PAGE;Western blot;Ion exchange chromatography
据世界卫生组织(WHO)报道变态反应性疾病
(过敏性疾病)是当前世界性的重大卫生学问题，此
类疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎
等，是临床常见病、多发病［1，2］。花粉是一种重要的
致敏原，且在世界范围内花粉过敏性疾病的发病率
不断增加［3］。近年的花粉调查显示，蒿属花粉仍为
中国北方地区夏秋季最重要的致敏花粉［4-6］，由于
蒿属花粉种类繁多且具有地区差异性，因此对蒿属
花粉过敏原有必要进行深入研究。大籽蒿花粉是我
国蒿属花粉中常见且致敏性较强的一种，但有关大
籽蒿花粉主要过敏原成分的分析鉴定未见报道。本
研究通过 SDS-PAGE、Western blot 和离子交换层析
对大籽蒿花粉过敏原进行分离、鉴定与纯化，为临床
过敏性患者的诊断及治疗提供依据。
1 材料与方法
1. 1 材料 大籽蒿花粉采自辽宁锦州市郊区，过敏
·319·李兴永等 大籽蒿花粉过敏原的分离、鉴定与纯化 第 7 期
性患者及正常人血清由辽宁医学院附属第一医院检
测并采集，在深圳大学医学院过敏反应与免疫学研
究所保存备用，过敏性患者血清均为蒿属花粉皮肤
点刺试验阳性患者的血清。
1. 2 主要仪器与试剂 垂直电泳槽、转膜电泳槽
(Model 1 000 /500)、凝胶成像及分析系统;亚甲基
双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二铵
(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、联苯二胺
(DAB)为 AMＲESCO公司产品;上样缓冲体系、蛋白
Marker 为 MBIFermentas公司产品;硝酸纤维膜(NC
膜)、透析带、生物素标记的 IgE 二抗、链霉亲和素
(HＲP)购自 Sino-American Biotec;DEAE-Cellulose
DE-52 为 Amersham Pharmacia公司产品。其余均为
国产分析纯试剂。
1. 3 大籽蒿花粉粗提液的提取 花开季节收集花
粉，取 10 g大籽蒿花粉，用液氮充分研磨成粉末，加
丙酮浸泡脱脂脱色，去丙酮风干后用 PBS 溶液充分
溶解，4℃搅拌过夜，然后 12 000 r /min，4℃，离心 15
min，取上清，重复 2 次，将上清液过 0. 45 μm 滤膜，
冷冻干燥存储备用。
1. 4 大籽蒿花粉粗提液的 SDS-PAGE 用 SDS-
PAGE体系分离大籽蒿草花粉粗提液蛋白组分，并
测定其分子量。分离胶为 12%，浓缩胶为 5%，考马
斯亮蓝 Ｒ-250 染色液染色，脱色后用凝胶成像及分
析系统拍照并分析其分子量。
1. 5 大籽蒿花粉粗提液的免疫学特性鉴定 取备
用的蒿属花粉过敏患者和非蒿属花粉过敏正常人血
清各 11 份，进行 Western blot 检测。实验步骤:用
Bio-Ｒad转移槽将凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤
维膜上，TBS 洗涤 2 次，5 min /次，将膜用 3% BSA
封闭液封闭(4℃冰箱过夜) ;倒去封闭液，TBST 洗
膜 3 次，5 min /次;加入 1% BSA-TBST 5∶ 1稀释的一
抗，37℃孵育 2 h，倒去一抗，同上洗膜 3 次后加入
2 000∶ 1稀释的二抗-生物素，室温孵育 2 h，倒去二
抗，同上洗膜 3 次后加入 5 000 ∶ 1稀释的链酶亲和
素-HＲP，室温孵育 2 h，同上洗膜 5 次，DAB显色，拍
照并分析其 Mr。
1. 6 大籽蒿花粉粗提液的离子交换层析与检测
大籽蒿花粉提取液冷冻干燥后用 0. 02 mol /L Tris-
HCl(pH7. 2)缓冲液透析 12 h并过 0. 45 μm滤膜备
用。DE-52 离子交换层析柱以 0. 02 mol /L (pH7. 2)
的 Tris-HCl缓冲液充分平衡，待穿透峰后的基线走
平后上样，改用洗脱缓冲液(0. 5 mol /L NaCl、0. 02
mol /L Tris-HCl)进行线性离子梯度洗脱，用 EP管收
集各峰液，并进行 SDS-PAGE、Western blot，拍照并
确定各峰收集液中蛋白的免疫活性。
2 结果
2. 1 大籽蒿花粉粗提液的 SDS-PAGE 结果 大籽
蒿花粉粗提液经 SDS-PAGE 可见 20 多种蛋白条带
(图 1) ，主要集中在 10 ～ 16 kD和 25 ～ 70 kD之间，
其中分子量(Mr)为 62、57、38、29、25、14 kD 等 6 个
条带蛋白含量最丰富。
2. 2 大籽蒿花粉粗提液的 Western blot结果 11
例蒿属花粉过敏患者的血清进行免疫印迹检测，
均有阳性反应条带出现，其中 Mr 62 kD 和 16 kD
的过敏原与过敏患者血清特异性 IgE 结合率最高
(均大于 50%) ，为其主要过敏原(图 2) ;而无蒿
属花粉过敏的正常人血清呈阴性反应，未见阳性
反应条带。
2. 3 大籽蒿花粉过敏原的纯化
2. 3. 1 花粉过敏原的离子交换层析结果 用 DE-
52 离子交换层析缓冲液透析的大籽蒿花粉粗提液
上柱。可见大籽蒿花粉提取液主要有 5 个峰。见
图 3。
2. 3. 2 各峰 SDS-PAGE和 Western blot结果 分析
表明，大籽蒿花粉提取液经离子交换层析后，其蛋白
主要分布在Ⅰ ～ Ⅴ峰。见图 4。免疫印迹结果显
示，Mr 16 kD 的主要过敏原组分在Ⅱ峰，而 Mr 62
kD的主要过敏原组分在Ⅲ ～Ⅴ峰。见图 5。
图 1 大籽蒿花粉粗提液 SDS-PAGE图
Fig． 1 SDS-PAGE of Artemisia sieversiana pollen extract
Note:M. Standard molecular weight markers;1. SDS-PAGE of Artemisia
sieversiana pollen.
·419· 中国免疫学杂志 2014 年第 30 卷
图 2 大籽蒿花粉粗提液免疫印迹图
Fig． 2 Western blot of Artemisia sieversiana pollen ex-
tract
Note:M. Standard molecular weight markers;1. Western blot of Artemis-
ia sieversiana pollen;2-11. Mr 62 kD and Mr 16 kD which posi-
tive rate ＞ 50% are the major allergens.
图 3 大籽蒿花粉粗提液离子交换层析图
Fig． 3 Ion exchange chromatography(IEC)of Artemisia
sieversiana pollen
3 讨论
气传致敏花粉是引起呼吸道变态反应性疾病，如
过敏性鼻炎、过敏性哮喘等花粉症主要过敏原。来自
菊科的蒿草花粉颗粒是全世界的主要过敏原来源之
一［7］，而大籽蒿花粉是蒿属花粉过敏的重要致敏性花
粉之一，也是我国北方最重要的过敏原之一。自从
John Bostoek(1989)首次提出花粉症以来，国内外学
者发现花粉中最主要的致敏成分是蛋白质［8］，并通过
制备主要致敏花粉过敏原浸液，用于诊断和治疗呼吸
图 4 大籽蒿花粉粗提液离子交换层析后Ⅰ～Ⅴ峰液的 SDS-
PAGE结果
Fig． 4 SDS-PAGE of ion exchange chromatography(IEC)
peakⅠ-Ⅴ of Artemisia sieversiana pollen
Note:M. Standard molecular weight markers;1-5. Peak Ⅰ-Ⅴ of ion ex-
change chromatography(IEC).
图 5 大籽蒿花粉粗提液离子交换层析后Ⅰ ～Ⅴ峰液的免
疫印迹结果
Fig． 5 Western blot of ion exchange chromatography
(IEC)peakⅠ-Ⅴ of Artemisia sieversiana pollen
Note:M. Standard molecular weight markers;1-5. Peak Ⅰ-Ⅴof ion ex-
change chromatography(IEC).
道的过敏性疾病，并取得了一定的疗效［9］。由于天
然粗提浸液过敏原的成分非常复杂，不仅含有引起
花粉症的致敏原蛋白组分，而且还含有多种其他成
分，且容易为外源性的毒性物质、病原微生物污染，
影响其安全性;同时某些致敏蛋白组分具有蛋白酶
·519·李兴永等 大籽蒿花粉过敏原的分离、鉴定与纯化 第 7 期
活性，可降解其他致敏蛋白组分，影响效价［10］。因
此分离纯化花粉主要过敏原，确定其免疫学特性对
研究呼吸道过敏性疾病的病因和治疗是极其重
要的。
本研究通过 SDS-PAGE凝胶电泳可以看到大籽
蒿花粉分离后可得到 20 多种蛋白组分，其中 Mr 为
62、57、38、29、25、14 kD 的 6 个条带蛋白含量最丰
富，Mr 62 kD 和 16 kD 的蛋白组分与蒿属花粉过敏
患者血清特异性 IgE 结合率最高(均 ＞ 50%) ，为主
要过敏原。该花粉主要过敏原 Mr 62 kD 的蛋白条
带与杨慧等［8］对艾蒿花粉过敏原进行分离鉴定检
出的 Mr 62 kD的蛋白条带相同。另外从 SDS-PAGE
与 Western blot 两实验结果比较分析，我们发现
SDS-PAGE实验中蛋白含量高的条带与蒿属过敏患
者血清特异性 IgE结合率并不一定高，如 Mr 29 kD
的蛋白条带未检测到与蒿属花粉过敏原特异性 IgE
结合，同时也发现不同种类的蒿属花粉也具有其特
异性的过敏原成分，如大籽蒿花粉主要过敏原 Mr
为 16 kD 与 Nilsen 等［11］检出的 Artemisia vulgaris L
花粉主要过敏原 Mr 为 22 kD 不同，与杨慧、刘志刚
等［12］对青蒿花粉过敏原进行分离鉴定出的主要过
敏原 Mr 43 kD的蛋白条带亦不同;而且针对不同花
粉过敏患者而言，其致敏的过敏原亦不尽相同，本研
究结果表明蒿属花粉虽然种类繁多，但各种花粉之
间可能存在共同过敏原成分。所以对不同的蒿属花
粉过敏原进行分离、鉴定与纯化具有重要的临床意
义。因此，本实验为进一步研究变态反应性疾病的
特异性过敏原制剂及探讨呼吸道变态反应性疾病更
快速、安全、有效的诊断和治疗方法提供理论支持。
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［收稿 2013-12-15 修回 2014-02-08］
(编辑 张晓舟)
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