全 文 ：海绵共生微生物研究中的分子技术*
胡叶 李志勇**
(上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室,上海 200240)
摘 要: 海绵共生微生物与海绵活性物质有紧密的关系,由于其大多不可培养,分子生物学技术成为海绵微
生物研究的有效方法。本文重点介绍了海绵共生微生物研究中经常应用到的 F ISH、PCR、16S rRNA 克隆测序、
DGGE、RFLP 等各种分子技术,对它们的特点及缺陷进行了分析与小结, 希望有助于海绵共生微生物分子研究的
进一步发展。
关键词: 分子技术 海绵 微生物
The Molecular Techniques in the Research of
Sponge-associated Bateria
*
H u Ye Li Zhiy ong**
( Mar ine B iot echnolog y L aborator y , S ch ool of L i f e Sc ienc e and Biot echnolog y ,
S hanghai J ia o Tong Univ ersi ty , S hanghai 200240)
Abstract: Sponge-asso ciated bacteria have special relations with sponge bioactiv e compounds. Because most o f
sponge-associat ed bact eria are uncultr ulable, so mo lecular t echniques as effectiv e str ategies should be applied. In
this article, some molecular techniques w hich have been used fr equently in the research o f sponge-associated bacteria
such as F ISH, PCR, 16S rRNA cloning and sequecing , DGGE and RFLP w ere rev iewed. T he advantages and dis-
advantages of these techniques have been mentioned. We hope this ar ticle can make fo r the fur ther development in
the r esear ch o f sponge-asso ciated bacteria.
Key words: Molecular techniques Sponge Bacteria
1 前言
海绵动物是多细胞动物当中结构最简单、形态
最原始的一类, 早在寒武纪以前就已经出现并一直
繁衍到了现代, 至今已发展到 1万多种,占海洋动物
种类的 l/ 15, 是一个庞大的/家族0。
从 1950年首次报道从海绵中分离到活性物质
至今,海绵作为天然药物的来源具有非常悠久的历
史了。迄今为止从海洋中发现的 6 000 多种代谢产
物中有很大一部分来自于海绵。这些从海绵中提取
得到的代谢产物具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、细胞毒
性等等各种强烈的生理活性。因此 20世纪 70年代
以来,国际上掀起了一股对海绵化学成分的研究热
潮,如1981年大学的 Muller 等人从海绵H alichon-
dr ia p anicea 中分离到血凝素[ 1] ; 1984年 F. J. Sch-i
tz等从海绵 Dysidea arenar ia的粗提物中分离出两
种新的萜类化合物 Arenaro l和 Arenarone[ 2] ; 1986
~ 1989 年期间 Matsunaga S 等从海绵中分离到具
有显著的抑制致病真菌活性的大环内酯类化合物
Kabir amde A-E[ 3] ; 1992 年 Fusetani从产自八丈岛
的 T heonella sw inhoei 中分离到有细胞毒活性的
T heopederin A [ 3] ; 2001 年 Carballeira 和 Pagan 从
加勒比海海绵 Cally spongia fallax 中分离得到新的
收稿日期: 2005-06-21
* 基金项目:国家高新技术发展计划( 863)资助( 2002AA628080, 2004AA628060)、上海市青年科技启明星计划资助( 04QMX1411)和上海高
校优秀青年教师后备人才计划资助
作者简介:胡叶( 1980- ) ,女,硕士研究生。研究方向:海洋微生物
** 通讯作者:李志勇, T el: 021-27974893, E- Mail : zyli@ sjtu. edu. cn
生物技术通报
# 技术与方法# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
甲氧基化脂肪酸[ 4] ; 2005年日本和荷兰的研究人员
从海绵Hexadella sp.中分离出新的对鱼的致病菌有
抑制作用的化合物 Bromotyro sine Deriv at ive[ 5] ; 等
等。可见,海绵已经成为开发海洋天然药物的重要
资源。
在多年的研究中, 人们发现海绵中有大量与其
有共生关系的微生物,包括细菌 [ 6]、蓝细菌 [ 7, 8]、放线
菌[ 9, 10]、古细菌[ 11, 12] 等。这些共生体与海绵之间相
互依存、紧密联系[ 13~ 15] ,而且越来越多的研究揭示:
从海绵中提取得到的很有开发前景的活性物质其实
并不是由海绵产生的, 而是由海绵共生微生物产生
的。于是 20世纪 80年代之后, 各国科学家们开始
对海绵共生微生物展开研究。1988年美国蒙大纳州
大学的 St ierle A . C.等人对海绵T ed ania ignis 的共
生微生物进行研究, 第一次证实了海绵宿主的次级
代谢产物是由其共生微生物产生的 [ 16]。1993 年美
国加利福尼亚大学 Scripps 海洋研究所的科学家采
用质子核磁共振技术和 CG-M S 技术分析得拟草倔
海绵( Dysidea her baced )中的多氯化的活性物质是
由其共生蓝细菌产生的 [ 17]。2001 年美国科学家
Har rigan等从海绵 Dysidea sp. 中发现了新的多氯
化合物,并且证实这些化合物是由海绵共生蓝细菌
所产生的[ 18] 。海绵体内的微生物产生的各种活性物
质对其生存具有非常重要的功能: 菌种间的相互对
抗可以保持海绵体内微生物的多样性 [ 19] ; 活性物质
可以帮助微生物在海绵体内生存 [ 1] ; 微生物产生的
代谢产物还可以为宿主海绵提供营养[ 15] 等。1994
年,日本的 Kobayashi等人培养海绵 H yr tios al tum
的共生细菌 Vibr io sp . 获得一种全新的吲哚三聚体
抗生素 T risindoline[ 20] ; 1998 年 Sanja Perovic 等人
利用 NMDA 受体、互变异构谷安酸盐受体和 16S
rDNA 等技术证实海绵 H alichondria panicea 中的
细菌会产生神经活性化合物 [ 21] ; 1999年科学家采用
GC/ M S和 FAB光谱等技术证实海绵 Dysidea f ra-
gil i s 中的细菌P seudomonas / A l ter omonas 能产生饱
和烃、脂肪酸等化合物[ 23] ; 等等[ 23~ 26 ]。
目前,国际上对海绵共生微生物的研究, 比较普
遍采用的是分子技术的方法, 这是由于海洋独特的
环境,包括高盐、高压、低营养、低温等, 以及海绵体
内的特殊环境造就了海绵共生微生物有别于陆地微
生物的诸多特异性(如不易培养,形态多变且在保藏
和移种过程中很容易死亡等)而导致传统微生物方
法对它们种类区分的困难。传统的微生物系统分类
的主要依据是形态特征和生理生化性状, 采取的主
要方法是对微生物进行纯化培养分离, 然后从形态
学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定。
但是,由于培养条件与自然条件的差异,实际上培养
所得到的只是自然环境中的少部分菌种, 而且往往
加入了浓度远高于自然状况的营养物质, 其结果是
在新的选择压力下群落结构通常会发生变化, 适应
富营养条件的菌种成为优势种, 故以培养为基础的
技术无法全面地原位地研究海绵共生微生物的多样
性。20世纪 60年代开始,分子遗传学和分子生物学
技术得到了迅速的发展, 这为分子技术在海绵共生
微生物研究中的应用提供了很好的条件。微生物分
类学进入了分子生物学时代, 许多新的分子技术和
方法在微生物分类学中得到广泛应用。应用分子手
段来进行微生物的多样性研究已经极大地增加了我
们对自然微生物群落中种群结构的认识。1999 年
Mller应用 16S rRNA 序列作为诊断工具证明了海
绵 H alichondr ia panidea 与其细菌的共生关系[ 13] ;
2000年, Webster 和 Hill对大堡礁的海绵 Rhop al-
oeides odorabile 中的 NW001 菌株进行 16S rRNA
的序列分析后证明它是一种 A-蛋白细菌且和海绵是
共生关系 [ 6] ; Webster 等人还应用荧光原位杂交
( FISH )技术对海绵 Rhopaloeides 的共生细菌进行
了多样性分析[ 10] 。目前国际上对海绵共生微生物研
究得比较多的是美国、澳大利亚、德国、日本等国,他
们常用到的分子方法主要是荧光原位杂交( FISH )、
PCR、16S rRNA 克隆测序、DGGE、RFLP 等等, 以
下将一一对这些方法、特点及应用作出介绍。
2 海绵共生微生物研究中的主要分子技术
2. 1 FISH (荧光原位杂交)
荧光原位杂交技术( fluorescent in situ hybr id-i
aat ion, FISH )创建于 1986年, 是一种现代微生物技
术,使用荧光素标记探针,以检测探针和分裂中期的
染色体或分裂间期的染色质的杂交, 主要用于在人
工培养前鉴定和表征复杂自然样品中的单个菌体细
胞。为了检测到微生物在组织或者生物膜中的空间
自然分布状态, 在培养前进行荧光原位杂交是非常
572005年第 6期 胡叶等:海绵共生微生物研究中的分子技术
必要的。1999 年 Friedrich 等人就用 FISH 技术分
析了海绵 Ap ly sina caver nicola 体内微生物的多样
性[ 19] ; 2000 年, 德国的 Manz 等人采用 FISH 和
WDEM(亮视野去卷积落射荧光显微镜)相结合的方
法,观察到了地中海海绵 Chondrosia r enif ormis 微
孔中微生物的存在和空间分布[ 27] ; 2001 年, 澳大利
亚海洋科学研究院的Webster 等人采用 FISH 等方
法测定了铜离子对海绵 R . odor abi le体内微生物的
影响[ 28] 。研究人员在对海绵内部微生物进行研究时
使用荧光原位杂交技术可以原位地观察和了解它们
的种类、分布和比例, 这样可以使得后期的克隆、测
序、种属鉴定等研究工作少走弯路, 并且也可以验证
实验结果的正确性, 如 Webster 等人在对海绵 R.
od or abi le体内微生物的种群多样性进行研究时, 就
用了 FISH 来进一步确认 16S rRNA 测序结果的正
确性[ 10] 。
FISH 技术的优点是探针稳定、操作安全,可快
速、多色显示多个不同探针的杂交信号,在一次杂交
中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相
互关系。但是由于该技术是依赖于把已知序列作为
探针来研究自然环境中的菌群, 所以在研究时会有
一个最大的局限性, 很难探测到一些从未发现过的
菌种,而它检测出的菌群也只能鉴定到门、类的分类
级别, 再加上该技术在操作时很容易受到各种污染
的干扰,因此, FISH 技术往往是作为分子生物学研
究的一种辅助手段, 是连接细胞遗传学和分子生物
学的桥梁。
2. 2 PCR(聚合酶链反应)
PCR( Polymerase Chain React ion, 聚合酶链反
应)是一种选择性体外扩增 DNA 或 RNA 的方法。
其原理是利用人工合成的引物介导的 DNA 聚合酶
链式反应,根据不同水平的特异性, 仅需知道两段已
知序列,就可以扩增出未知的 DNA 区域。PCR 技
术是 16S rRNA 克隆测序、RFLP、DGGE 等等分子
方法的基础。2002 年, 美国南佛罗里达大学的
Donaldson等人在研究海绵体内病毒时就是先通过
实时反转录聚合酶链反应( rea-l t ime RT-PCR)来得
到病毒的反转录 DNA,再进行克隆测序等后面的研
究工作[ 29]。
PCR技术的优点是可以从微量的样品中快速得
到大量的我们研究的目的序列片段, 便于我们后期
研究工作的进行,但是由于 PCR是一种体外循环扩
增过程, 使用的 DNA 聚合酶一般没有纠错功能, 所
以当循环数比较多时,出错率比较高,所以在操作过
程中要把循环数控制在适当的范围内(一般是 25~
35) , 最好能够使用一些纠错能力比较好的 DNA 聚
合酶,不过这样会增加研究成本。
2. 3 16S rRNA 序列测定
在海绵微生物研究中, 最常用的是 16S rRNA
序列测定[ 30, 31] ,因为海绵中的微生物主要为细菌和
放线菌, 它们都含有 16S rRNA, 而 16S rRNA 基因
具有高度保守性, 不同的科、种、属间的菌类 16S
rRNA 基因的同源性达 97%以上。根据这一特性,
研究人员就可以选用针对性引物, 以被检测样品为
模板,进行 PCR扩增, 从而得到大量 16S rDNA 片
段。得到单菌的 16S rDNA 片段后, 可以直接对其
进行测序和序列分析, 像 Usher 等人在研究来自澳
大利亚和地中海的 8种海绵体内的共生蓝细菌时采
用的就是 16S rRNA 直接测序的方法[ 32]。不过如果
得到的是混和菌的 16S rDNA, 则必须先通过克隆转
化来使不同菌种的 DNA 片段得以分离,然后再进行
测序和序列分析, 比如Webster 等人就是直接提取
了海绵 R. odor abi le体内微生物的总 DNA, 然后用
16S rRNA 克隆测序的方法对其种群多样性进行研
究[ 10] ; 2004年中国热带农业科学院的方再光等人也
是用这种方法对海绵 Pachy chal ina sp . 体内细菌的
多样性进行了研究[ 33] 。
应用 16S rRNA 序列测定技术, 可以检测和计
数海绵中不可培养的微生物, 确定其细菌群落的结
构、功能和动力学, 建立海绵共生微生物的宏基因
组。到目前为止, 在探索微生物多样性并确定混合
微生物生物群落的种群分类方面, PCR扩增 16S rD-
NA 的克隆测序是最成功的方法。不过, 由于 16S
rRNA 基因序列测定成本很高, 所以一般先用一种
廉价、有效的方法对所有菌株的遗传多样性进行初
步筛选,之后,再将遗传型不同的 16S rRNA 基因测
序, 从而避免或减少由于重复测序而造成的人力财
力大量浪费。在海绵共生微生物研究中, 用的最多
的两种初步分型方法就是 DGGE 和 RFLP。
58 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
2. 4 DGGE(变性梯度凝胶电泳)
DGGE ( Denaturing gradient gel elect rophore-
sis,变性梯度凝胶电泳) 技术是使用一对特异性引
物 PCR 扩增微生物自然群体的 16S rRNA 基因,产
生长度相同但序列有异的 DNA 片段的混合物, 由
于序列不同影响融点行为,因此在包含线性梯度变
化的聚丙酰胺凝胶中不同序列的分子就停留在了不
同的位置,从而使得产物混合物得以分离。近几年
来 DGGE 技术被运用在海绵共生微生物研究
中[ 34~ 37] , 以确定自然环境中微生物群体的遗传多样
性。2004年,澳大利亚新南威尔士大学的 T aylor 等
人采用 16S rDNA-DGGE 的方法对澳大利亚三种海
绵体内微生物的多样性及其宿主特异性进行了研
究[ 35] ; 之后, 他们又用同样的方法对其中一种海绵体
内微生物的地理特异性进行了深入研究 [ 37]。
DGGE 技术应用到海绵共生微生物的研究中,
可以避免对多个无遗传差别或差别很小的菌株重复
进行繁琐的各种表观特征研究, 从而大大降低了工
作量,同时,条带亮度的不同也使得优势菌种可以在
混合菌群体中展现出来。其局限性在于只能分离比
较短的 DNA 片段,而且由于它分离的依据是 DNA
融点, 因此有些序列不同而融点相同的 DNA 片段得
不到分离,一条谱带中很可能包含着不止一种片段。
2. 5 RFLP和 T-RFLP
RFLP( Rest riction Fragment Length Po lymo r-
phism, 限制片段长度多态性)方法是 Grodzicker 等
人于 1974年发明的,是一种利用限制性核酸酶切片
段长度差异来检测生物个体之间差异的分子标记技
术。RFLP 标记具有共显性的特点, 结果稳定可靠,
重复性好。此法能够反映多个酶切位点所包含的
DNA 序列信息,因此可以根据限制性内切酶消化后
的 16S rDNA 基因型的种类及频率对微生物进行密
度或多样性分析。Webster 等人在作海绵共生微生
物作为铜离子浓度的生物指示剂[ 28] 及 5种南极海绵
体内共生微生物差异性时都用到了 RFLP 技术[ 36] ;
2003年,韩国的研究人员用 RFLP 技术对 8种不同
海绵体内的共生微生物进行了多样性研究[ 38]。由于
RFLP 分析估计微生物多样性时, 图谱的谱带比扩
增 DNA 的谱带要多, 因此会过高估计群落成员数
目。不过,该难题可用荧光标记 PCR产物来克服。
T-RFLP(末端限制性酶切片段长度多态性)技
术就是使用荧光引物, 在扩增进程中使产物被末端
标记。扩增基因由限制性内切酶降解, 随后在自动
DNA 测序仪上检测。仅有那些荧光标记的末端限
制片段才会被检测到。因此 T-RFLP 分析也是在海
绵共生微生物研究中经常被用到的一种 RFLP 技
术,比如美国的 Ahn 等人在研究海绵共生细菌的还
原脱卤作用时就用到了 T-RFLP 技术[ 39] ; 韩国的
Lee等人也在海绵共生微生物多样性研究种用到了
这一分析方法[ 38]。该技术的优点在于: 1)在 DNA
自动测序仪上有高分辨率的分离; 2)有不同荧光标
记的 int ra- lane 标记,有利于样本间的比较; 3)有直
接定量带或者峰的可能性。但是由于片段不能切离
或者收集,不可能进一步对群落成员进行鉴定。此
外,该技术需要的仪器也很昂贵。
2. 6 活性物质相关基因来源及表达的研究
随着海绵体内越来越多的生物活性物质被发
现, 人们开始对编码这些活性物质的基因及其真正
的生产者产生了兴趣, 于是设计特定引物进行 PCR
来得到相关序列进行研究 [ 40]。
2004年 11月, 德国的 Piel等人根据他们从甲
壳虫中得到的相似活性物质的基因序列设计特定引
物得到了从海绵 T heonel la sw inhoei 中发现的
po lyket ide类抗癌抗菌素的基因序列,经过序列分析
发现该序列的一些机构和功能特征,比如基因簇,缺
少启动子、多腺苷酸位点和内含子,含有 S-D序列和
细菌转位酶基因等, 都显示了该基因应该属于细菌。
这是科学家第一次从海绵中分离得到其自然产物的
生物合成基因, 并基本证实了这类活性物质的真正
生产者是海绵共生菌产生的, 他们接下去还将进一
步研究这种生物合成机制 [ 41]。
科学家们发现从海绵中发现的很多生产这些活
性物质的菌种是很难在人工条件下培养的,如果想
要深入研究和开发利用这些活性物质, 就需要采用
分子的方法对其编码序列进行克隆转化, 让它们在
我们可以培养的菌体中实现表达。最近, 德国的科
学家们就在这克隆表达方面作了成功的尝试。他们
应用克隆转化的方法使得从海绵 A p ly sina aero-
p hoba的共生芽孢杆菌中发现的两种新的酯酶在大
肠杆菌体内成功表达, 并对其进行了深入研究[ 42]。
592005年第 6期 胡叶等:海绵共生微生物研究中的分子技术
虽然此次转化的基因来自海绵体内可培养的芽孢杆
菌, 但是这次成功的克隆转化实验也为将来进一步
转化不可培养海绵共生菌的活性基因提供了非常有
用的经验。可以预见,在今后的一段时间内, 海绵共
生微生物的研究热点将主要集中在采用克隆转化等
分子生物学技术研究及其相关活性产物的表达方
面。
3 结论
海绵共生微生物及其产生的活性物质是近年来
国际海洋生物领域的研究热点。由于海绵共生微生
物大多不可培养, 所以在各国科学家对海绵共生微
生物的研究过程中, 各种分子方法被广泛应用其中,
最常见的就是以上几种方法, 其他一些如核酸杂
交[ 43]、ARDRA [33]等等分子技术,也有时会被应用其中。
由于这些分子方法各有优缺点(表 1)。因此在
实际研究过程中,最好是把这几种方法综合应用,取
长补短,以便得到最科学的研究结果。目前, 比较普
遍采用的综合研究方法是:先用 FISH 技术, 这样可
表 1 海绵共生微生物研究中的分子技术一览表
技 术 优 点 缺 点
FISH 快速、直观,能原位反应微生物分布情况 探针限制大,只能鉴别到门类,且易受污染干扰
PCR 简易、快速 出错率高
16S rRNA测序 无需培养,重复性好,可鉴定种属 费用高,易重复测序
DGGE 群落可能成员的鉴定 片段短,不稳定,无法分离融点行为相同的不同片段
RFLP 高分辨率,不需昂贵设备 带数同群落成员数无直接相关性,无法获得系统发育信息
T-RFLP 片段直接定量 仪器昂贵
以原位得了解和确定海绵体内微生物的种类和比
例;然后根据 FISH 的结果, 选择合适的研究对象,
使用适当的引物进行 PCR 扩增以得到其种群特征
片段;之后采用 DGGE、RFLP 等分析方法对其海绵
体内的菌群进行多样性分析;然后再进行克隆测序,
通过序列比对来确定其种属及在遗传发育学中的位
置,如若该微生物有非常好的生理生化活性, 则就要
用克隆转化等技术对其活性物质进行进一步的深入
研究。以上只是一种比较普遍通用的操作步骤, 在
实际研究过程中,根据研究目的的不同,这些方法应
用的顺序往往灵活的, 有些甚至会被反复用上好几
次,比如 PCR, 在研究前期一般是采用种属特征引物
(如 16S引物)进行 PCR,以测序确定微生物的种类,
但是到了研究后期又会根据功能基因序列设计引
物,又一次进行 PCR,找出其中带有特殊功能的目标
菌株。可见,分子技术的应用是为了达到研究目的,
并没有固定的应用方式、步骤,完全因情况而异。
4 展望
海绵体内生存着大量的共生微生物, 它们能产
生丰富的对人类有潜在意义的新型化合物。分子技
术是海绵共生微生物的研究中的重要方法,根据研
究目的的不同, 它们得到了灵活的应用。随着海绵
共生微生物研究的深入, 一定还会有越来越多的分
子技术被应用其中, 给海绵共生微生物研究的发展
创造一个更广阔的前景。
参 考 文 献
1 M uller WE, et al. J Bacteriol , 1981, 145: 548~ 58 .
2 邓松之. 中国海洋药物, 1988, 1~ 2: 44.
3 李青选. 中国海洋药物, 1994, 2: 55~ 59 .
4 Carballeira NM, Pagan, M . J Nat Prod, 2001, 64: 620~ 3.
5 M atsun aga S, Kobayashi H, van S oest RW, Fusetan i N. J Org
C hem, 2005, 70: 1893~ 1896 .
6 Web ster NS, Hi ll RT . M arin e Biology, 2001, 138: 843~ 851.
7 Flow ers AE, Garson MJ, Webb RI, Dumdei EJ , C haran, RD.
Cel l Tis sue Res, 1998, 292: 597~ 607.
8 Webb VL, M aas EW. FEMS Microb iol L et t , 2002, 207, 43~ 7.
9 Imamu ra N, Nishijima M, Adachi K, Sano H . J Ant ibiot ( Toky-
o) , 1993, 46: 241~ 6.
10 Webster NS, W ilson KJ, Blackall LL, Hil l RT. Appl En vi ron
Microbiol, 2001, 67: 434~ 44.
11 Pres ton CM , Wu KY, Molinsk i TF, DeLong EF. Proc Natl
Acad S ci USA, 1996, 93: 6241~ 6.
12 Web ster NS, Wat t s JE, Hil l RT. Mar Biotech nol ( NY) , 2001,
3: 600~ 8.
13 M uller WEG. M arin e Biology, 1999, 134: 213~ 215.
14 Muller WE, et al. Appl En vi ron Microb iol , 2004, 70: 2332~ 41.
15 Pile AJ, Grant A, Hind e R, Bor ow it zk a MA. J Exp Biol, 2003,
60 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
206: 4533~ 8.
16 S tierle AC , Cardellina JH , 2nd & Sin gleton FLA. E xperient ia,
1998, 44: 1021 ( 1988) .
17 Faulk ner DJ, HH , Molin ski T F.中国海洋药物, 1995, 2. 52~
54.
18 Harrigan GG, Goetz GH, Lu esch H. Yang, S. & Likos, J. J
Nat Prod, 2001, 64: 1133~ 8 .
19 Friedrich AB, et al. Marine Bioligy, 1999, 134: 461~ 470.
20 Kob ayashi M , et al. Ch em Pharm Bul l ( T okyo) , 1994, 42, 2449
~ 51.
21 Perovic Sanja WA. Environm ental T ox icology an d Pharm acolo-
gy, 1998, 6: 125~ 133.
22 Rosa S De, MA, Kujumgiev A, S tefan ov K. Nech evI, Pop ov S .
Com parat ive Biochemist ry an d Phys iology, 2000, 126( 3) : 391~
395.
23 Oclarit JM , et al . M icrobios, 1994, 78: 7~ 16 .
24 Jayat ilake GS , T hornton MP, Leon ard AC. Pseu dom onas
aeruginosa. J Nat Pr od, 1996, 59: 293~ 6.
25 Bu lte-l Ponce VV, Debitus C, Berge JP, Cerceau C, Guy ot M .
Journal of Marine Biotech nology, 1998, 6: 233~ 236.
26 De Rosa S, De Giu lio A, T ommonaro G, Popov S, Ku jumgiev
A. J Nat Prod, 2000, 63: 1454~ 5 .
27 M anz W , Arp G, S chum ann-Kindel G, Szewzyk U ,Reitn er J. J
M icrobiol Meth od s, 2000, 40: 125~ 34.
28 Web ster NS, Webb RI, Ridd MJ, H ill RT , Negri AP. En vi ron
M icrobiol, 2001, 3: 19~ 31 .
29 Donalds on KA, Grif fin , DW , Paul JH . Water Res, 2002, 36:
2505~ 14 .
30 H entsch el U, et al. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 35: 305
~ 312 .
31 Rupert LL. In sect Biochemist ry an d Molecular Biology, 2002,
32: 389~ 395.
32 U sher KM , From ont J Sut ton DC, Toze S. M icrob Ecol, 2004,
48: 167~ 77.
33 方再光,黄惠琴,蔡海宝,等.微生物学报, 2004, 44: 426~ 430.
34 S chm idt EW , Obrazt sova AY, Davidson SK. M arin e Biology,
2000, 136: 969~ 977.
35 T aylor M W, Schupp PJ , Dahl lof I, Kjelleberg S , Steinb erg PD.
E nviron M icrobiol, 2004, 6: 121~ 30.
36 Webster NS, Negri AP, Munro M M, Bat tershill CN. En vi ron
Micr obiol , 2004, 6: 288~ 300.
37 Taylor MW, Schupp PJ, d e Nys R, Kjelleberg S , Steinb erg PD.
Environ Microbiol , 2005, 7: 419~ 33 .
38 L ee EY, Lee HK, Lee YK, Sim CJ , Lee JH . Biomol E ng, 2003,
20: 299~ 304 .
39 A hn YB, et al . Appl E nviron Microbiol, 2003, 69, 4159~ 66 .
40 Erpen beck D, Breeuw er JAJ, Velde, Soest . Marine Biol igy,
2002, 141: 377~ 386.
41 Piel J, et al. Proc Nat l Acad S ci U SA, 2004, 101: 16222~ 7.
42 Karpushova A, Brummer F, Barth S , Lange S, Schmid RD. Ap-
pl Microbiol Biotechnol . 2004.
43 Ivanova E P, et al . Int J Sy st Evol M icrob iol, 2002, 52: 263~ 71.
# 国外动态#
乌干达筹建生物技术实验室
AgBio tech 2003年 20卷 8期 7页报道: 5全非新闻6宣称,乌干达农业、畜产业和渔业部正在卡旺达研究
站内筹建一个生物技术实验室。预期对这个实验室的投资金额,将超过 1百万美元。这个实验室于 2003年
8月底建成并投入使用。筹建这个实验室的目的在于提高乌干达的农业产量,从而促进国民经济的发展。
乌干达农业部部长 Kisamba Mugerw a说: /鉴于乌干达农村可耕地的短缺,我们必须采用集约式农业技
术。0又说: /绿色革命已匆匆离开非洲而不复返。但非洲决不能在科学技术上落后于其他国家。我们亟需利
用生物技术来谋求生存和发展。0 汪开治
612005年第 6期 胡叶等:海绵共生微生物研究中的分子技术