全 文 ：海绵共附生细菌种群组成的 PCR-DGGE基因指纹分析
李志勇 何丽明 蒋群
(上海交通大学生命科学技术学院 海洋生物技术实验室,上海 200240)
摘 要: 采用不依赖于分离培养的 16S rDNA 的 PCR-DGGE 基因指纹技术对我国南海的细薄星芒海绵、皱
皮软海绵、贪婪倔海绵、澳大利亚厚皮海绵体内的优势细菌的种群组成进行了比较分析。结果显示: 每种海绵体内
都含有丰富多样的细菌;通过 DGGE 指纹图的聚类分析发现来自同一海域的不同海绵的共附生细菌的种群组成具
有明显不同,即共附生细菌具海绵宿主特异性; 同时也发现有相同的细菌存在于不同的海绵体内。
关键词: 海绵 细菌种群 16S rDNA DGGE 基因指纹图 聚类分析
Study on the Spong-associated Bacterial Community
Based on PCR-DGGE Fingerprinting
Li Zhiyong He Liming Jiang Qun
( Mar ine Biot echnolog y L abor atory , School of L if e S cie nce and T echnolog y ,
S hanghai J ia o Tong Univ ersi ty , S hanghai 200240)
Abstract: In this paper, the sponge-associated bact er ial structur e were investig ated and compa red among 4
sponges in South China Sea, Stelletta tenui ( L indg ren, 1897) , H alichondr ia ( R idley & Dendy ) , Dysi dea avara
( Schmidt) and Craniera aus traliensis ( Car ter) using a culture- independent method of 16S rDNA PCR-DGGE finger-
pr int ing . It w as proved that there are abundant and various bacter ia in each sponge. As for the t ested 4 sponges, the
bacter ial community structures w ere obv iously differ ent based on the cluster ing analysis o f DGGE fingerprints,
which meant t hat the bacterial community w as special t o each o f the 4 sponges in the same ocean ar ea. A t the same
time, the same bacter ium was found in different sponges.
Key words: Sponge Bacter ial community 16S rDNA DGGE f ingerpr int ing Clustering analysis
海洋微生物从分布上讲主要由与海洋动植物、海水、海底沉积物相关的三部分微生物组成,其中前者由
于可能与动植物的化学防御机制和一些活性物质的产生有关而成为一类非常重要的海洋微生物类群。由于
目前对于海洋微生物与相关动植物的关系的了解非常有限。因此,习惯上人们将与海洋动植物有关的微生
物统称为海洋共附生微生物。
海绵是最原始、最低等的水生多细胞动物,在具有共附生微生物特性的海洋生物中是最有代表性的。海
绵的长久不腐烂现象提示人们海绵体内存在着极强的生理活性物质。1995年以后,从海绵中发现的活性物
质数量相当于从其他海洋生物中发现的活性物质的总合, 是目前发现活性物质最多的海洋生物。越来越多
的研究证实,一些原本认为是海绵产生的活性物质其实是由其共生的微生物产生的[ 1] 。因此,海绵共附生微
生物的研究已经成为国际上海绵研究的热点与前沿。其核心的科学问题包括: 海绵与共附生微生物的关系、
海绵活性物质产生之迷(最终目的是为了解决海绵活性物质来源限制的瓶颈问题)以及海绵的化学防御机
制。这三者面临的一个共同的基础科学问题是海绵共附生微生物的组成信息的揭示。众所周知, 目前依靠
分离培养而被人类了解的微生物仅是世界上微生物资源中极少的一部分, 90% ~ 99. 9%以上的环境微生物
收稿日期: 2005-06-21
基金项目:国家高新技术发展计划( 863)资助( 2002AA628080, 2004AA628060)
作者简介:李志勇( 1969- ) ,男,博士、副教授,研究方向:海洋生物技术, Email: zyli@ s jtu. edu. cn
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
尚没有被认知。与陆地微生物相比,海洋微生物的人工分离培养更加困难,海水微生物可被分离培养的比例
仅在 0. 001% ~ 0. 1%之间。由于微生物与其宿主之间存在独特的相互依赖关系,海洋共附生菌的分离培养
更是难上加难。以分离培养为基石的传统微生物研究手段的局限性使人们对于海绵共附生微生物的生物学
特性缺乏必要的了解。要想全面揭示海绵共附生微生物种群组成、分布与多样性的科学问题,必须借助于不
依赖分离培养的相关分子技术和生物信息学手段。基于 PCR扩增的变性梯度凝胶电泳( Denatur ing Dr ad-i
ent Gel Elect ropho resis, DGGE) /温度梯度凝胶电泳( T emperature Gr adient Gel Elect rophor esis, T GGE)的
DNA 指纹技术[ 2]。自从成功应用于土壤微生物复杂区系的揭示以来,目前已成为分析复杂环境微生物组成
结构的有力手段。
国际上已经有了一些采用分子技术揭示海绵体内微生物组成的研究报道[ 3, 4] ,但是我们国家对于海绵
共附生微生物的研究才刚刚开始, 目前还没有采用不依赖分离培养的方法进行海绵共附生微生物研究的任
何报道。上海交通大学是国内最早开展海绵共附生微生物研究的单位之一[ 5, 6] , 目前已在海绵共附生微生
物分子生态学研究方面形成了自己的特色。
首次尝试采用不依赖于分离培养的 PCR-DGGE 基因指纹技术对我国南海的细薄星芒海绵、皱皮软海
绵、贪婪掘海绵、澳大利亚厚皮海绵体内的优势细菌组成进行比较分析, 目的在于初步揭示海绵体内微生物
组成的多样性与是否存在海绵宿主的特异性,了解海绵丰富的微生物的相关信息,为今后开发利用海绵微生
物资源奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 海绵
4种海绵均采自我国南海三亚周遍海域, 由中国科学院海洋研究所李锦和研究员鉴定为细薄星芒海绵
Stel letta tenui ( L indgren, 1897)、皱皮软海绵H alichondr ia ( Ridley & Dendy)、贪婪倔海绵 Dysidea avara
( Schmidt)、澳大利亚厚皮海绵 Cranier a austr ali ensi s ( Carter )。这 4 种海绵分别用名称的第一个字母 S、
H、D、C 表示。
1. 2 海绵微生物 DNA 的提取
无菌条件下切取 0. 5克海绵样品, 用无菌小刀切成 2mm3小块,置于 100m l无菌研钵中(研钵放在冰块
上) , 加入 1. 5mlT E( pH8. 0)后研磨,然后采用文献[ 7]的方法优化后提取总 DNA。
1. 3 16S rDNA 扩增
以提取的总 DNA为模板,采用引物 8f ( 5-GGA GAG T TT GAT CA/ CT GGC T-3)与 798r( 5-CCA
GGG T AT CTA AT C CTG T T-3)扩增海绵细菌 DNA 的 16SrDNA片段。体系及反应条件如下: 9l 10
PCR缓冲液 ( 100mM Tr is-HCl( pH9. 0) , 15mM M gCl2 , 500mM KCl, 0. 1%甘油, 1% 的 Tr itonX-100) ,
20M 的引物 8f与 798r 各 0. 5l, 2l dNT P, 1l总 DNA 及 0. 5l Taq 酶, 用无菌去离子水补充体积至
50l。PCR反应程序如下: 94 预变性 5min, 80 保持 1 m in, 加入 T aq 酶。按照下列程序进行扩增: 94
变性 1 min, 57 退火 1 m in, 72 延伸 2 min, 循环 25次; 72 延伸 2 m in。
以获得的 PCR产物为模板, 采用引物 P2( 5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3)与 P3( 5-CGC CCG
CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC T AC GGG AGG CAG CAG- 3)进行
16SrDNA-V3扩增。扩增体系及反应条件如下: 5l 10 PCR 缓冲液( 100mM Tris-HCl( pH9. 0) , 15mM
MgCl2 , 500mM KCl, 0. 1%甘油, 1%的 T ritonX-100) 1. 25l 20M 的 P1或 P3, 1. 25l 20M 的 P2, 1. 75l
dNT P, 2l 16S rDNA 产物及 0. 5l T aq酶,用无菌去离子水补充体积至 50l。PCR反应程序如下: 94 预
变性 5min, 80 保持 1 min, 加入 Taq 酶。65 退火 1 m in, 按照下列程序进行扩增: 94 变性 30S, 65
( 65 ~ 0. 5 /循环)退火 30S, 72 延伸 1 min, 循环 21 次; 进入下列循环 5 次: 94 变性 30S, 55 退火
30S, 72 延伸 1 min; 72 延伸 3 min最后 4 保存备用。用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测, EB染色观察。
62 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
1. 4 变性梯度凝胶电泳( DGGE)分析
采用 Bio-Rad的 DGGE 分析系统按照下列条件进行: 8%的聚丙烯酰胺(丙烯酰胺: 双丙烯酰胺= 37. 5:
1) ,变性胶的线性梯度为 30% ~ 50%, 电压: 150V, 电泳时间: 4. 5h, 温度: 60 , 胶大小为: 16cm 16cm
1mm。银染,数码相机拍照后采用 UVIB 和 Map V. 99聚类分析软件分析指纹图的相似性。
2 结果与讨论
2. 1 总 DNA 提取与 16S rDNA-V3扩增
采用 1. 2的方法成功地提取出了 4种海绵的总 DNA样品。结果见图 1。大小约在 21kb 左右, 具有很
好的纯度。
由于 PCR-DGGE基因指纹图只能分离 500bp的 DNA 样品,目前通常采用 16S rDNA-V3片段作为分
析对象。通常从提取的总 DNA 扩增 16S rDNA-V3 片段有两条途径, 一种是直接以总 DNA 为模板进行
PCR扩增,一种是首先扩增出一定长度的16S rDNA 片段,然后再经第2次 PCR扩增得到 16S rDNA-V3片
段。我们以扩增的特异性和纯度两个指标比较了这两种方法的效果,发现第 2种方法的效果要比第一种方
法好。
图2是首先采用引物 8f和 798r扩增的 16S rDNA 片段的琼脂糖电泳图。由图可见 PCR扩增的特异性
很好,目的片段长度约 800bp,条带很纯,没有任何杂带的污染,这对于后续的 16S rDNA-V3扩增是非常必
要的。
图 1 四种海绵的总 DNA 图 2 16S rDNA PCR结果
图 3是第 2次采用引物 P2与 P3以前面得到的 16S rDNA 片段为模板扩增的 16S rDN A-V3片段的琼
脂糖电泳图。从扩增检测结果来看,成功扩增出约 190 bp的 V3区片段,扩增异性很好, 没有杂带,适合作为
下列 DGGE指纹分析的样品。
2. 2 海绵共附生优势细菌组成的 DGGE基因指纹分析
以4种海绵体内细菌的 16S rDNA-V3区片段进行变性梯度凝胶电泳,得到的 DGGE 基因指纹图如图4
所示, 相似性分析结果如图 5。图上的每条泳道代表一种海绵共附生细菌的 16S rDN A PCR-DGGE 基因指
纹图。每一泳道上不同位置的条带代表不同的细菌种类,亮度代表该细菌在海绵体内量的相对多少。
从图 4中可以看到, 每一个泳道上都具有很多清晰的条带, 这充分说明了这四种海绵体内微生物的多样
性是非常丰富的,这与采用透射电子显微镜观察得到的结果一致。同时,由图 4可以直观地反映出 4种海绵
体内优势细菌的组成具有显著不同, 指纹图相似性最大的是贪婪倔海绵与澳大利亚厚皮海绵, 但也仅在
30%左右; 细薄星芒海绵与皱皮软海绵的共附生优势细菌组成的相似性才达到 8%左右。可见这 4 种海绵
体内微生物的种群组成具有明显差异, 由于这 4种海绵来自于同一个海域, 该结果提示我们,海绵体内的微
632006年第 1期 李志勇等: 海绵共附生细菌种群组成的 PCR-DGGE基因指纹分析
生物具有明显的宿主特异性, 每一种海绵都有其特殊的微生物区系结构。
尽管 4种海绵的共附生优势细菌组成具有显著的差异性,但也有个别条带是两种海绵或 4 种海绵
共有的,例如图 4中的 1条带为 4种海绵共有;条带 2、3为贪婪倔海绵与澳大利亚厚皮海绵共有; 条带 4为
细薄星芒海绵与皱皮软海绵共有; 条带 5为皱皮软海绵与贪婪倔海绵共有。可见,相同的细菌可在不同海绵
体内存在,可能是这些海绵存在同一海域,某些细菌有着共同的来源。
16S rDNA PCR-DGGE基因指纹图分析可以非常直观、快捷地反映出同一海绵体内优势细菌的组成情
况,以及不同海绵体内细菌种群组成的差异与相似性, 这种优点是传统的依靠分离培养的技术手段所不具备
的。本文仅是对来自同一海域的 4种海绵的共附生细菌种群组成进行一个初步的比较与分析,至于每一条
带所代表的细菌的种属鉴定可以通过特征条带的割胶回收、PCR 扩增、克隆测序、序列分析来实现, 相关结
果将在后续文章中予以报道。
3 结论
由以上基于 16S rDNA PCR-DGGE 基因指纹图分析的结果可以看出:
( 1)海绵体内存在着丰富的不同的细菌。
( 2)不同的海绵体内的优势细菌组成具有显著的差异性,即具有宿主特异性。
( 3)不同的海绵体内也存在着相同的细菌。
参 考 文 献
1 方金瑞,等译.中国海洋药物, 1995, ( 2) : 52~ 54.
2 M uyzer, G, et al . Applied and E nvironmental M icrobiology, 1993. 5: 695~ 700.
3 H entsch el U. et al. Applied and En vironmen tal M icr ob iology, 2002, 68: 4431~ 4440.
4 Thack er R. W . et al. Marine Biology, 2003, 142: 643~ 648.
5 何丽明,李志勇,等.微生物学通报, 2005, 32( 3) : 51~ 56.
6 李志勇,等.水产学报, 2005, 29( 1) : 38~ 42.
7 Thomas C. et al. Marine Biology, 2003, 142: 685~ 692.
64 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期