全 文 ：RNA干扰与植物抗病毒
燕飞 成卓敏
(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100094)
摘 要: RNA 干扰是多种生物体内由双链 RNA 介导的同源 mRNA 降解现象, 是植物体内天然的抗病毒机
制。然而病毒在长期进化过程中也获得了通过编码沉默抑制蛋白来对抗植物体 RNAi系统的能力。本文对 RNA
干扰过程、病毒编码的沉默抑制蛋白及利用干扰技术进行抗病毒基因工程研究进行简要综述。
关键词: RNA 干扰 小干扰 RNA 沉默抑制蛋白 抗病毒
RNA Interference and Plant Ant-i virus
Yan Fei Cheng Zhuomin
( Inst itut e of p lant p r ot ect ion , CA A S, SK LBP I, Bei j ing 100094)
Abstract: RNA inter ference is a phenomenon of homologous RNA digestion mediated by double- st randed
RNA, w hich is a natura l defense system against v irus in plants. H owever , against this defense sy stem of plants, v-i
ruses obtained t he ability ev olutionally to code suppressor s o f silencing . This paper r eview s the advance of RNAi
mechanism research, suppressor s of silencing coded by virus, and applicat ion of RNA i in plant g ene engineer ing for
ant-i vir us.
Key words: RNAi siRNA Suppressor o f silencing Ant-i v irus
RNA 干扰( RNA interference, 简称 RNAi)是
多种生物体内由双链 RNA( double- st randed RNA,
简称 dsRNA )介导的同源 mRNA 降解现象。在细
胞中,长的 dsRNA 被 Dicer 酶切割成有 21~ 26 核
苷酸( nucleot ide, nt )的小干扰 RNA ( smal l inter-
fering RNA 或 short interfering RNA, 简称 siR-
NA ) ; siRNA与蛋白复合物结合后形成 RNA 诱导
沉默复合物( RNA-induced silencing complex , 简称
RISC) ,同时解链; 有活性的 RISC 与同单链 siRNA
互补的转录物结合后导致 mRNA 降解。这是一种
转录后水平的基因沉默 ( post- t ranscr ipt ional gene
silence, PTGS) 现象, 所以又称 RNA 沉默 ( RNA
silence)。最近对线虫和果蝇中 RNAi机制的研究
取得较大进展, 让我们对该机制有了更详细的认识。
在植物体内, RNAi 机制是天然的病毒防御系统。
为了对抗这种沉默作用, 病毒在进化过程中也获得
了能够躲避或者抑制 RNA i的能力,其中最主要的
方式是利用编码沉默抑制蛋白来抑制 RNAi作用。
在相对中性的自然界中,由于病毒的这种对抗能力,
使得植物体天然的 RNAi抗病毒系统有时不能完全
或较高水平地抵御某种病毒的侵染。可是如果人为
地将某种病毒的某一序列设计成双链结构,导入植
物体, 使之表达可诱发 RNAi的 dsRNA, 通过诱导
RNAi来强化植物体内已经存在的 RNAi机制, 就
有可能获得高病毒抗性的植物表型。
1 RNAi过程
虽然 RNAi现象首先发现于植物,但在对RN-
Ai了解还很少的情况下以线虫、果蝇等模式生物体
为试验材料研究 RNAi中的分子生物学无疑具有巨
大的优势。最近以这些模式生物为载体, 对 RNAi
中的生物大分子进行了较深入研究, 取得较大进展,
从而对 RNAi过程有了更详细的了解。
1. 1 RNAi的起始
RNA i的首要步骤是在Dicer酶的催化下将
收稿日期: 2005-03-30
作者简介:燕飞( 1976- ) ,男,博士生,从事植物抗病毒基因工程研究
通讯作者:成卓敏, T el: 010- 62815615; Email: zmcheng@ ippcaas. cn
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
dsRNA 切割成 siRNA。在线虫研究中发现, Dicer
酶( DCR-1)是在对结合有 RDE-1和 RDE-4的 dsR-
NA 进行识别后,才完成特异性切割作用的[ 1]。对果
蝇 S2细胞中 Dicer酶的研究也发现了类似现象, 切
割 dsRNA 的 DCR-2 是和 R2D2 一起完成切割作
用, R2D2与线虫中的 RDE-4具有同源性[ 2, 3] 。这些
结果说明, Dicer 酶是与其他蛋白结合, 以复合物的
形式发挥催化切割活性, 将 dsRNA 切割成 siRNA
的。
1. 2 RISC的装配
在果蝇中, DCR-2切割作用的完成意味着 RISC
装配的开始, RISC 装配的起始物即是切割完成后形
成的 DCR-2/ R2D2/ siRNA 复合物[ 4, 5] , 然后其他组
分有序地结合其上, 就开始了 RISC 的装配过程。这
些组分包括 Dicer、Ar gonaute蛋白、以及其他未知功
能的蛋白。目前对于该过程的细节了解得还不多,
可能涉及蛋白之间的相互识别结合, 并且根据在
RISC中所发挥的作用有顺序地参与装配。如 RISC
中还存在 DCR-1, 它的作用是保证 RISC 中间体能
够同 Argonaute蛋白等组分结合, 又因为它没有参
与到 dsRNA 的切割,那么它可能就是在起始复合物
生成后, Ar gonaute蛋白结合之前参与到 RISC装配
的。
1. 3 RISC在单链 siRNA 指导下切割互补转录物
RISC中的 siRNA 是 RNAi过程中指导完成特
异性切割作用的向导。这种向导作用是根据碱
基互补配对原则完成的, 因此每一个 RISC中只能包
含 siRNA 中的一条链, 以便同靶 RNA互补结合,完
成指导降解的作用[ 6] 。双链 siRNA 是在 RISC 装配
的后期由解旋酶催化解旋形成单链 siRNA 的。虽
然 siRNA 中的每一条链都有可能装配到 RISC
中[ 7] , 但实验表明, RISC 只对其中的一条链表现出
更强的亲和性[ 7, 8] 。siRNA 5端的碱基配对与否,配
对碱基之间的结合力大小决定了哪条链进入 RNAi
的 RISC的装配过程。
RISC与互补转录物结合后行使切割作用,导致
靶 RNA 的降解。最近研究表明, RISC 中的 Argo-
naute蛋白是起催化切割作用的活性成分。研究发
现, Ar gonaute蛋白中的 PIWI 结构域与 RN aseH 具
有相似的结构特征[ 9, 10] 都含有一个由螺旋包围
着的 5个片层结构,只是 PIWI在最后一个片层和最
后一个螺旋之间还有 Argonaute 蛋白的其他序
列[ 11] ; 实验也证实 RN aseH 与 Argonaute 蛋白在功
能上有相似性: RNaseH 的作用是催化切割 RNA/
DNA 杂交链中 RNA 单链, Arg onaute 蛋白作用是
切割 siRNA 与 RNA 形成的 dsRNA 中的 RNA 单
链;并且, RNaseH 的切割产物同 RISC 的切割产物
相同,都具有 3-OH 和 5磷酸结构[ 12] ;此外, 它们的
活性都依赖于 Mg2+ 的存在[ 13]。所有这些证据表
明, Ar gonaute 蛋白是 RISC 中的催化切割活性蛋
白,并且这种活性由其中的 PIWI结构域提供。
2 植物病毒编码的沉默抑制蛋白
植物体内的 RNAi是天然的抗病毒机制。植物
RNA 病毒在植物体内都有一个在 RdRP 参与下形
成 dsRNA 结构的过程,这就为植物体内的 RNAi提
供了一个诱导起始物, 导致植物体对病毒的天然抵
抗能力。然而植物体的这种病毒防卫系统, 并不能
完全阻止病毒的侵染, 病毒有时还是能够成功感染
植物,并在其体内增殖扩散, 这就涉及到病毒编码的
沉默抑制蛋白的作用。目前人们已经从多种病毒中
分离到这类蛋白,如 p19蛋白、HC-Pro、N S蛋白、C2
蛋白、2b 蛋白等[ 14] , 其中对 p19 蛋白的结构及功能
机制研究得最为深入。
p19是由番茄丛矮病毒( T ombusvi ridae)编码
的, p19蛋白是一类分子量为 19kDa 的多功能蛋白
质,与 TBSV 的细胞间运动、长距离扩散及系统感染
时病症产生有关。最近发现, p19还是一种 RNA 沉
默抑制蛋白。在体外, p19可以同 PTGS 产生的 21
~ 25nt dsRNA 和人工合成的具有 2nt 突出的 3末
端的 21nt dsRNA 结合,但同单链 RNA,长 dsRNA,
平末端 21nt dsRNA 不起作用 [ 15]。因此 p19是通过
特异性地结合 21nt siRNA,降低参与 RISC装配的
siRNA 数量,使 RNAi过程中断,从而导致沉默抑制
效应。需要指出的是, p19 可能是同寄主蛋白共同
作用以复合体形式完成的这个功能。同 p19 蛋白类
似, HC-Pro 可能也是在 PTGS 产生 siRNA 后的下
游过程中起作用,阻断 PT GS 某个环节,从而导致沉
默抑制[ 16]。而 NS蛋白很可能是在 PTGS的开始初
期,同起始 dsRNA 结合, 使之不能被 Dicer 酶切割
成 siRNA, 从而导致 PTGS的抑制[ 17]。此外还有定
2 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
位于核内的 C2蛋白、2b蛋白, 定位于细胞外基质的
p21蛋白等。最值得一提的是, 病毒的结构蛋白和
功能蛋白可能也会同时起到抑制沉默的作用。Kub-
o ta 等在烟草研究中发现, 用野生型番茄花叶病毒
( Tomato mosaic v ir us , ToMV) L 株感染可以打破
gfp的沉默, 伴随有可见症状; 然而其他弱毒株 ( L
( 11)和 L( 11) A)却不能抑制 gfp的沉默。对 L 和 L
( 11) A序列的对比分析表明,后者的复制酶基因一
个碱基发生变化,导致氨基酸的替换,说明复制酶时
产生沉默抑制表型的基因[ 18]。T homas等对芜菁皱
缩病毒( Tur nip cr inkle vi rus , TCV)的所有蛋白进
行综合分析, 检测对烟草叶片中外源报告基因沉默
的抑制能力,结果发现,只有衣壳蛋白 p38表现出抑
制活性,在马铃薯 X病毒( Potato vi r us X , PVX)载
体上表达 p38时,可观察到随着 PVX RNA 的积累,
症状也变得更为严重 [ 19] , 说明 TCV 衣壳蛋白具有
抑制沉默作用。
根据病毒编码沉默抑制蛋白的多样性可以推
测,病毒对植物 RNAi系统的抑制作用是普遍存在
的, 并且不同的病毒可能会针对不同的寄主表现出
不同的抑制策略。这是植物、病毒两者之间针对对
方 攻、防体系长期进化的结果, 也为植物
病毒互作研究提供一个新的切入点。除此之外, 还
可以将沉默抑制蛋白抗沉默、促表达的作用应用到
工业化生产中来。如 Vo innet 等将番茄丛矮病毒编
码的 p19蛋白与烟草蛋白激酶基因共表达,由于 p19
抑制了 PT GS 作用,从而使蛋白瞬时高水平表达,表
达量可增高 50倍之多。这无疑为快速分离纯化有
用蛋白提供了一个有用的系统 [ 20]。
3 RNAi与植物抗病毒基因工程
正是基于病毒来源的 dsRNA 可诱发植物体
RNAi、降解病毒基因这一理论, 人们设想将病毒的
某一序列设计成双链结构,导入植物体,强化植物体
天然的 RNAi抗病毒机制, 期望获得高度病毒抗性
的转基因植株。
2000年Wang 等利用含有大麦黄矮病毒( Bar-
ley y el low dwarf vir us, BYDV ) PAV 株系的复制
酶基因片断, 将其设计成反向重复序列构建成可产
生发夹结构的载体, 并将该载体导入大麦, 在 25个
转化系中,有 9个转化系表现出强的抗性, 并且这种
抗性是特异性的,说明利用来源于病毒的 dsRNA 可
以达到抗病毒的目的[ 21]。2002年 Kalant ids 等在转
有黄瓜花叶病毒 ( Cucumber mosaic v ir us , CMV)
cDNA 反向重复序列的再生烟草植株中检测到一个
完全抗性的株系, 并且证实烟草病毒抗性与 siRNA
的产生直接相关 [ 22]。T enllado 等观察了以直接注
射和农杆菌介导转化两种方式将病毒基因序列来源
的 dsRNA 导入植物叶片细胞后的效果发现, 两种方
式都可成功阻止烟草蚀刻病毒( T obacco etch vir us,
TEV)、辣椒轻斑驳病毒( P ep p er mi ld mot tl e vir us,
PMMoV)和苜蓿花叶病毒( A l f al f a mosaic vir us,
AMV)这 3种病毒的侵染过程。同时, 他们还将用
于直接注射的 dsRNA 由最初的 0. 8l/ l稀释到 10
倍和 100倍后进行相同浓度的病毒接种。结果表
明,未稀释的一组中检测不到 PMM oV 在植物体内
的积累;稀释 10倍的一组有轻微的病毒感染症状;
而稀释 100 倍的一组并未表现出对病毒感染的抑
制,并且植物体内的病毒含量与对照持平[ 23] 。这样
的结果说明了 dsRNA 诱导的植物病毒抗性是依赖
于 dsRNA 剂量的, 这与在动物身上得出的结论一
致[ 24]。众多的实验研究表明,利用 RNAi技术以工
程化的手段赋予植物体病毒抗性具有高度可行性,
有可能成为植物抗病毒基因工程研究中的一种特异
抗性手段。
从目前 RNAi应用于植物抗病毒研究的情况
看,不管是为获得抗性植株还是检测 dsRNA 表现出
来的赋予植物体病毒抗性的能力,经常使用的 dsR-
NA 导入手段是农杆菌介导法。基于该种方法建立
的瞬时转化系统, 尤其适用于快速检测不同 siRNA
对同一目的基因沉默的有效性, 沉默信号的产生、扩
散导致系统性沉默等过程。对于 dsRNA 表达结构,
人们多采用基因片段反向连接成反向重复序列的方
法,转录后即可产生双链结构。通常在片段之间再
加一段间隔序列, 以使载体结构更加稳定。这个间
隔序列可以是同一个基因的某一片断, 也可以是一
个无关的序列, 还可以是一个内含子序列[ 25] ,如果间
隔序列是内含子, 那表达出来的就是一个两端都是
平末端的 dsRNA; 如果间隔序列不是内含子, 那么
表达出来的就是一个含有茎环结构的 dsRNA。虽
然有研究表明不含茎环的 dsRNA 更能稳定地获得
32005年第 4期 燕飞等: RNA 干扰与植物抗病毒
干扰效应,但可能针对不同的植物材料,需要使用来
源于所研究植物的内含子才能起到预期的高效沉默
效果。总之,在目前应用 RNAi技术进行植物抗病
毒研究中主要还是通过含有间隔序列的反向重复结
构来获得病毒抗性。当然在条件允许的情况下, 不
妨根据试验材料多设计几种结构以获得较高干扰效
率的结果。
4 结语
近两年对于 RNAi机制的研究取得了较大进
展,以 RNAi为基础的植物抗病毒基因工程也已经
显示出在植物病毒病防治上的应用潜力, 这除了因
为其表现出的高效、特异性抗性, 更重要的是同以往
应用衣壳蛋白基因、复制酶基因介导的抗性研究相
比, dsRNA 介导的抗性具有 RNA i这一机制的理论
基础。因此,虽然利用该技术进行的抗病毒商品化
应用还很少, 但相信在今后的几年将有更多的基于
RNAi技术的抗病毒转基因商业作物的研究及推广
应用。
参 考 文 献
1 Tabara H, Yigit E, Siomi H , et al. Cel l, 2002, 109: 861~ 871.
2 Ling el A, S imon B, Izaurralde E , et al. Nature, 2003, 426
( 6965) : 465~ 469.
3 Pellino JL, Sontheimer EJ . Cell, 2003, 115( 2) : 132~ 133.
4 L ee YS, Nak ah ara K, Pham JW, et al. Cell , 2004, 117( 1) : 69
~ 81.
5 Pham JW , Pel lino JL, Lee YS, et al . Cell, 2004, 117( 1) : 83~
89.
6 M art inez J, Patkaniow ska A, U rlaub H , et al. Cel l, 2002, 110
( 5) : 563~ 574.
7 S chw arz DS, H utvgn er G, Du TT , et al. Cell, 2003, 115( 2 ) :
199~ 208.
8 Khvor ova A, Reynolds A, Jayas ena DS. Cell , 2003, 115( 2 ) :
209~ 216.
9 Liu J, Carm ell MA, Rivas FV, et al. S cien ce, 2004, 305( 5689) :
1437~ 1441.
10 Parker JS, Roe SM, Barford D. EMBO J , 2004, 23( 24) : 4727
~ 4737.
11 Song JJ , Smith SK, H ann on GJ, et al. Science, 2004, 305
( 5689) : 1434~ 1437.
12 M art inez J, Tuschl T . Gen es Dev, 2004, 18( 9) : 975~ 980.
13 S chw arz DS, T om ari Y, Zamore PD. Curr Biol, 2004, 14( 9 ) :
787~ 791.
14 燕飞, 成卓敏. 生命的化学, 2004, 24( 4) : 281~ 284.
15 S ilhavy D, Molnar A, Lu cioli A , et al. EM BO J, 2002, 21
( 12) : 3070~ 3080.
16 L lave C, Kas schau DK, Carrington CJ. PNAS , 2000, 97 ( 24) :
13401~ 13406.
17 Bucher E , Sijen T, De Haan P, et al. J Virol, 2003, 77 ( 2 ) :
1329~ 1336.
18 Kubota K, Tsu da S, Tamai A, et al. J Vir ol , 2003, 77( 20 ) :
11016~ 11026.
19 T homas CL, Leh V, Lederer C, et al. Vi rology, 2003, 306( 1) :
33~ 41.
20 Voinnet O, Rivas S, M est re P, et al. Plant J, 2003, 33 ( 5 ) :
949~ 956.
21 Wang MB, Abb ot t DC, Water house PM. Molecular Plant Pa-
th ology, 2000, 1( 6) : 347~ 356.
22 Kalant idis K, Psaradakis S, T abler M , et al. M PM I, 2002, 15
( 8) : 826~ 833.
23 T enllado F, D az-Ru z J R. J Virol, 2001, 75 ( 24 ) : 12288~
12297.
24 K obayashi N, M atsu i Y, Kaw ase A, et al . J Pharm acol Exp T-
h er, 2004, 308( 2) : 688~ 93.
25 Pandolf ini T , Molesini B, Avesani L, et al. BMC Biotechn ol ,
2003, 3 ( 1) : 7.
4 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期