全 文 ：猕猴桃 RNA提取与 RTPCR*
汤三妹 杨娟 周秋莲 梁红**
(仲恺农业技术学院农业与生物学院,广州 510225)
摘 要: 为了从富含多糖和多酚等物质的猕猴桃幼叶中提取和分离出高质量的 RNA, 用多个不同品种的猕
猴桃叶为材料,比较了 3 种不同的 RNA 提取方法所提取的总 RNA。结果表明, 用胍酚酸DEPC 法提取的 RNA
质量最好,提取率达到 682. 9~ 780. 8 g ∕ g( FW ) , 其R 值( A260 ∕ A280)接近 1. 90。用所提取的 RNA 样品进行
RTPCR, 其扩增产物在琼脂糖凝胶上出现明显清晰的扩增 cDNA 带, 说明 RNA 样品在纯度和浓度上都可以满足
PCR等分子生物学实验的基本要求。
关键词: 猕猴桃 RNA 提取 RTPCR
Comparison of RNA Extraction from Actinidia
T ang Sanmei Yang Juan Zhou Qiulian Liang Hong
( A g ronomy Depar tment , Zhong kai Univ ersi ty of A g ri cul tu ral and Technology , Guangz hou 510225)
Abstract: In order to obtain high quality RNA fr om Actinidia leaves in w hich polypheno ls and po ly saccharides
is rich, leaves of sever al kiw ifr uit var ieties or species w ere used to ext ract RNA and the effects of RNA ex traction
were studied w ith three differ ent methods. The r esults show ed that the Guanidinophenol acidDEPC method is the
best w ith 682. 9~ 780. 8 g ∕ g ( FW) in ext raction and near 1. 90 in R value ( A260 ∕ A280) . The RNA samples
were used to amplify cDNA through RT PCR and the amplificates w ere observ ed in agarose gel by electr ophoresis.
The experimental r esult s showed that the purit y and concentrat ion o f the ext racted RNA can meet the demands o f
molecular biolog y analy sis.
Key words: Act inidia RNA ex tr act ion RTPCR
猕猴桃属于猕猴桃科( A ct inid iaceae) ,猕猴桃属( A ct inidia)。为原产我国的木质藤本植物,有些种如中
华猕猴桃( A . chinensis)和美味猕猴桃( A . d el iciosa)等已作为果树栽培。猕猴桃果实以其营养丰富,维生
素 C含量高, 富含人体所需的矿物营养与多种氨基酸,并能预防消化系统癌症, 具有特殊保健作用而备受人
们青睐,从而作为一种新兴水果在世界各国得到迅速发展。本属全世界约有 63个种,我国至少有其中的 59
个种、43个变种(不包括原变种)和 7个以上的变型[ 1~ 2] 。
随着猕猴桃产业的发展和扩大,有关猕猴桃的理论和应用研究受到重视。猕猴桃分子生物学和遗传多
态性研究既有理论价值又有实际意义,并在 DNA 和蛋白质分子生物学研究方面做了大量的工作[ 3~ 15]。本
文主要研究猕猴桃总 RNA 的分离提取及相关的 RTPCR方法,在前人试验研究[ 2~ 9] 的基础上进行筛选、改
进和优化,总结出较为实用有效的猕猴桃 RNA 分离提取方法,并以此进行猕猴桃 RTPCR初步研究,为研
究猕猴桃基因表达和猕猴桃资源植物学做准备和积累经验。
1 材料与方法
1. 1 材料
本试验所用猕猴桃品种为:秦美、秦美 、磨山四号、哑特、桂果 、徐香 、两广、中华 、粉毛
收稿日期: 20050608
* 基金项目:广东省人大 农业科技推广服务议案 猕猴桃品种引进、改良项目资助
** 通讯作者:梁红( 1958 ) ,男,理学博士,仲恺农业技术学院农业与生物学院教授,主要研究方向:资源植物学和生物技术
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 5期
、桂海四号、中越 等。其中属中华猕猴桃的有中华 株、磨山 4号 株、桂海 4号 株和桂果
株;属美味猕猴桃的有秦美 株和 株、徐香 株、哑特 株; 两广猕猴桃、粉毛猕猴桃和中越猕猴
桃单独成为另外的种。上述材料分别引自武汉植物园、广西植物研究所、陕西果树所和广东和平水果研究
所,取回枝条嫁接于仲恺农业技术学院校园内品种圃中,取幼叶进行 RNA提取。
1. 2 方法
1. 2. 1 猕猴桃总 RNA 提取 猕猴桃总 RNA 的分离、提取和纯化全过程的操作均须戴一次性手套,所用的
器皿用去离子水清洗三次后都必须用 0. 5 %焦碳酸二乙酯( DEPC)的水溶液浸泡 30min以上, 取出晾干后
置于 60 恒温箱中备用。
猕猴桃总 RNA的提取采用下列 3种方法, 其操作如下:
方法 1( SDS裂解法)
称取 1 g 新鲜猕猴桃幼叶,放入经过冰冻过的研钵内,加入适量液氮,迅速研磨成粉末,加入 4 ml [裂解
液 2% SDS、2%PVP( 40 000)、50mM EDT A、0. 02M DT T、200mM T risHCl( pH8. 0) ] ,匀浆后移入离心管
中,置于 65 的恒温水浴锅内水浴20 m in; 6 000 rpm 离心 20 min,取上清液,加入 3M NaAc 1/ 9体积, 摇匀
后置于20 冰箱中 3 m in;取出加入 95%乙醇 1/ 9体积,轻轻摇匀后冰浴 5 min; 12 000 rpm 离心 5 min,取
上清液加等体积苯酚∕氯仿∕异戊醇( 25: 24: 1) , 摇匀后冰浴 5 m in; 12 000 rpm 离心 30 s,取水层(上层)加
等体积预冷的异丙醇,20 冰箱中放置 2 h; 10 000 rpm 离心 5 min, 取沉淀( RNA ) ,加入 70%乙醇洗涤 2
次,用 95%乙醇保存20 冰箱中备用。
方法 2 (酚酸胍法)
称取 1g 新鲜猕猴桃幼叶,放入经过冰冻过的研钵内,加入适量液氮, 迅速研磨成粉末, 加入 2 M NaAc
0. 3 m l, 水饱和酚 3 ml和氯仿/异戊醇( 49: 1) 0. 6 m l, 混匀后冰浴15 min; 15 000 rpm 离心30 min,吸上层水
相至 1. 5 m l的离心管内加入等体积异丙醇, 混匀后置于20 冰箱冷冻 1 h; 13 000 r pm 离心25 m in,除去上
清液的沉淀溶于 1 m l异硫氰酸胍异裂解液 ( 4 M 异硫氰酸胍、25 mM 柠檬酸钠、0. 5%十二烷基肌氨酸钠、
0. 1 ml巯基乙醇,调至 pH7. 0) 中, 5 min后加入等体积异丙醇混匀后放入20 冰箱中冷冻 1 h; 13 000rpm
离心 20 m in,去上清液后沉淀用 70%乙醇洗 1次,倾去乙醇,加入 95%乙醇保存于20 冰箱中备用。
方法 3 (胍酚酸DEPC 法)
称取 1 g 新鲜猕猴桃幼叶, 放入经过冰冻过的研钵内, 加入适量液氮, 迅速研磨成粉末, 加入 3 m l异硫
氰酸胍( SD)溶液 (异硫氰酸胍 50 g、经过 DEPC处理的水 59. 9 ml、1M 柠檬酸钠 2. 64 ml、10% N肉桂酰肌
酸钠 5. 3 m l、储于棕色瓶中,用前加 巯基乙醇使其终浓度为 0. 2 mM , 调至 pH7. 0) 混匀后加 0. 3 m l 2 M
NaA c摇匀, 加 3 ml水饱和酚摇匀后再加 0. 6 ml 苯酚/氯仿/异戊醇 ( 25 24 1) , 混合后冰浴 15 min;
10 000rpm 离心 30 min, 取出上清液加等体积异丙醇,20 冰箱静置 1 h; 13 000 rpm 离心 20 min,弃上清
液,用 75%乙醇淋洗沉淀 2次,最后加入 95%乙醇保存于20 冰箱中备用。
1. 2. 2 RNA 的纯化 上述所提取的 RNA 共进行三次纯化,其操作步骤分别如下:
第一次纯化
样品( 95%乙醇保存) 12 000 r pm 离心10 min,倾去乙醇,加入1 T BE 1 ml和苯酚/氯仿/异戊醇 1 m l,
经 12 000 rpm 离心 10 m in 后取上清液加等体积异丙醇, 再 12 000 r pm 离心 10~ 20 min, 弃上清液; 沉淀用
70%乙醇浸洗 2次, 95%乙醇保存于20 冰箱中备用。
第二次纯化
第一次纯化后的样品( 95%乙醇保存) , 加入 ddH 2O 1 ml, 加入 95% 乙醇 118 l, 12 000 rpm 离心 15
min, 取上清液加等体积 R 的苯酚/氯仿/异戊醇, 12 000 rpm 离心 10 min;取上清液加入等体积异丙醇后
12 000 rpm 离心 20 m in,丢弃上清液,留沉淀,用 70%乙醇浸洗, 95%乙醇保存,置于20 冰箱保存备用。
68 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
第三次纯化
第二次纯化的样品( 95%乙醇保存) , 10 000 rpm 离心 10 min倾去乙醇,沉淀加 2% PVP 500l溶解沉淀
和苯酚/氯仿/异戊醇 1 m l; 12 000 rpm离心 10 min后取上清液加等体积异丙醇, 12 000 rpm 离心 15 min后
弃上清液,用 70%乙醇浸洗沉淀 2次, 95%乙醇保存于20 冰箱中备用。
1. 2. 3 RNA 的含量测定及纯度鉴定 采用紫外分光光度法测定 RNA 的含量,由含量计算提取率。根据
A 260 / A 280的比值鉴定 RNA的纯度。测定的具体方法如下:样品( 95%乙醇保存) , 12 000 rpm离心 5 min,倾
去乙醇,加 1 m l ddH 2O,取 100l样品加 4. 9 m l的 ddH 2O(稀释 50倍) ,在紫外可见分光广度计中测定A 260
和 A 280 ,并计算 R值( A 260 / A 280 )。具体公式如下:
提取率= A BS 40g/ m l 稀释倍数/样品重量/取样比例
1. 2. 4 RTPCR 本试验所用的 RTPCR试剂盒、4种 poly( dT)引物和 4种随机引物均购于北京鼎国生物
技术公司,引物的序列如下:
4种 poly ( dT )引物的序列分别为: 4种随机引物为:
5TT T TT TT TT T TT TT TT T TT G3 W26273 U ser No: RM439
5TT T TT TT TT T TT TT TT T TT A3 W26591 U ser No: RM588
5TT T TT TT TT T TT TT TT T TT C3 W26614 U ser No: RM600
5TT T TT TT TT T TT TT TT T TT T3 W26445 U ser No: RM516
反转录和 PCR扩增在设置热循环仪上进行,按照以下程序进行反应:
反转录 60 30 min水浴
扩增 94 2 m in(变性, 去二级结构)
循环
( 40个)
94
50
60
1 m in(解链)
0. 5 min(复性)
1 m in(延伸)
最后延伸 60 8 m in
2 结果与分析
2. 1 猕猴桃总 RNA的提取和纯化
用上述 3种方法对 11个猕猴桃品种或种的总 RNA 样品进行提取分离, 均得到 RNA 沉淀。对其中的
桂海4号和秦美雌株的 RNA样品(未纯化)进行分光光度测定的结果以及由此计算得出的提取率和纯
度( R值)列于表 1。从提取率来看,第三种方法比其他方法要高得多,分别达到 1009. 7g/ mg (桂海 4号)和
921. 7g/ mg(秦美) ,说明胍酚酸DEPC法更适合于猕猴桃 RNA 的提取。根据各个样品 R 值分析, 第三种
方法所提取的 RNA 的纯度也高于其他两种方法,也是更为可取的。不过仅从 R值来分析,所提取的 RNA
样品的纯度还是比较低的,需要进一步纯化。
表 1 三种方法提取的 RNA光吸收值、R值( OD260 / OD280 )及得率
提取方法 第一种方法 第二种方法 第三种方法
RNA 样品 桂海四号 秦美 桂海四号 秦美 桂海四号 秦美
OD260 0. 46 0. 18 0. 24 0. 25 2. 52 2. 31
OD280 0. 39 0. 15 0. 18 0. 18 1. 79 1. 71
OD260 / OD 280 1. 18 1. 20 1. 33 1. 39 1. 41 1. 35
提取率g/ g 鲜重 183. 56 72. 56 95. 84 97. 64 1009. 68 921. 66
692005年第 5期 汤三妹等: 猕猴桃 RNA 提取与 RTPCR
用上述的第三种方法(胍酚酸DEPC 法)所提取的 RNA
样品进行纯化, 经过 3次纯化之后的结果如表 2所示。
从表 2 可以看出, RNA 样品的 R 值已明显增加, 在
1. 8~ 1. 9之间。虽然样品提纯过程中损失了近 1∕ 3的
RNA,但纯度得到了较大提高。用纯化后的 RNA 样品
进行 RTPCR 扩增, 也得到了明显的 cDNA扩增带 (图
1) ,说明胍酚酸DEPC 法提取的猕猴桃 RNA 经过纯
化之后,基本上能满足分子生物学分析的要求。
表 2 经 3次纯化后的 RNA样品分光光度检测的结果
RNA 样品 秦美 秦美 桂海四号
OD 260 1. 71 1. 94 1. 95
OD 280 0. 94 1. 03 1. 08
OD 260/ OD280 1. 82 1. 88 1. 81
提取率 g/ g鲜重 682. 88 776. 12 780. 76
2. 2 基于猕猴桃总 RNA的 RTPCR
图 1是分别以桂海 4号 、秦美 和秦美 的 RNA 样品为模板、用相同的 4 个随机引物和 4个 poly
( dT )引物进行 RTPCR扩增,并进行扩增产物琼脂糖凝胶电泳后得到的电泳图谱。扩增产物电泳的结果表
明:用异硫氰酸胍酚酸DEPC法提取巧的 RNA 均能进行 PCR扩增并获得扩增谱带, 因而能够满足用于分
子生物学分析的要求。但 3个样品的 cDNA 扩增带较为相似,大小在 300~ 500 bp之间,并且其扩增谱带没
有表现出一定的差异性, 可能其相应的表达基因是管家基因。
图 1 不同品种猕猴桃的 RTPCR扩增
1.桂海四号 2.秦美 3.秦美
4. Marker(DNA/ EcoRⅠ+ Hin dⅢ)
3 讨论
3. 1 猕猴桃幼叶的组分对 RNA 提取的影响
A 260 / A 280是衡量蛋白质污染程度的指标, 2. 0是高质量 RNA
的标志,但受二级结构等的影响, 读数可能会有一些变化, 高质量
的 RNA, A260/ A280 读数 ( 10 mM Tr isHCl, pH7. 5 ) 在
1. 8~ 2. 1之间, 有时甚至大于 2. 1; 同一个RNA样品, 在水溶液中
所测读数则可能在 1. 5~ 1. 9之间,原因是因为 A260/ A280 读数
受测定所用溶液的 pH 值影响;此外, RNA 中残留的酚及乙醇等
也会影响 A260/ A280的比值 [ 16]。
RNA 的质量是决定其后续的分子生物学实验成败的主要因
素之一,近年来,有关 RNA 的提取方法已有很多文献报道[ 17~ 21] ,
但是,猕猴桃是含多糖和酚类物质较多的植物, 由于多糖及酚类
物质的干扰,使得猕猴桃 RNA 提取较其他植物RNA 的提取难度
大,由于不同植物及同一植物不同组织器官的物质组成各不相同,这些差异对 RNA 的不同提取方法往往会
造成不同程度的影响,导致了不同提取方法所得的 RNA 在提取率和纯度上的差异。因此, 在实际工作中,
应根据不同的材料筛选或建立适当的提取方法。从本实验结果来看, 不同提取方法提取的猕猴桃总 RNA
的提取率及纯度有较大的差异。第三种方法与第二种方法相比, 除了所用的异硫氰酸胍的浓度较高而使变
性和裂解更为充分外,还用 DEPC 处理过的水作为溶剂, 有效地抑制了 RNA 酶的降解作用,这可能是其具
有较高提取率的原因。第一种方法的操作步骤多,在提取的过程中可能丢失了较多的 RNA。第二种方法所
用时间也较长,且提取较为复杂, 也可能使得 RNA 在操作过程中丢失较多。相比较而言, 第三种方法所需
时间不太长,且操作步骤不多,提取率高,因而是较好的提取方法。
3. 2 猕猴桃 RTPCR扩增产物分析
一般来说, 用多个引物对 RNA样品进行 RTPCR扩增,电泳后应该可以见到多条不同的谱带, 但在实
验只有一条扩增带, 或者是扩增带没能够分开来。这可能是由于电泳的时间不够长或分辩率不够。用单一
的随机引物分别加入到上述的 11 个 DNA 样品中, 在琼脂糖凝胶上可见到个别样品有一条较窄的条扩增
带。本试验的结果表明, 所扩增的 mRNA 大小相似,分子量接近,因而其相对应的表达基因应为管家基因。
70 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 5期
如果用 RTPCR进行差异性表达的分析,应该进行不同发育时期的扩增产物比较。
较好的引物在结构和序列上应满足以下条件:特异性高、GC 含量是 40%~ 60%之间、引物序列中没有
互补的序列且成对的引物之间的 3末`端上没有互补序列、确认引物的 3`末端上没有发生引物与模板的错配。
由于本试验中所用的随机引物可能缺乏足够的特异性,针对性不明显,因而没有显示出相应的多态性扩增。
如果用全 mRNA 扩增的 ddPCR方法,可能会得到更好的结果。
参 考 文 献
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《植物遗传资源学报》征订启事
《植物遗传资源学报》是中国农业科学院和中国农学会联合主办的专业性学术期刊, 全国优秀农业期刊,
由中国工程院院士董玉琛研究员担任主编。国内刊号 CN11- 4996/ S,国际统一刊号 ISSN1672- 1810。
报道内容: 大田、园艺作物,观赏、药用植物,林用植物、草类植物及其一切经济植物的有关植物遗传资源
基础理论研究、应用研究方面的研究成果、创新性学术论文和高水平综述或评论。诸如, 种质资源的考察、收
集、保存、评价、利用、创新、信息学、管理学等;以及起源、演化、分类等系统学; 基因发掘、鉴定、克隆、基因文
库建立、遗传多样性研究。
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712005年第 5期 汤三妹等: 猕猴桃 RNA 提取与 RTPCR