全 文 ：第27卷 第1期
2015年1月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 27, No. 1
Jan., 2015
文章编号：1004-0374(2015)01-0056-08
DOI: 10.13376/j.cbls/2015010
收稿日期：2015-01-20
*通信作者：E-mail: lai_liangxue@gibh.ac.cn
基于体细胞克隆的猪基因打靶技术研究进展
颜泉梅，赖良学*
(中国科学院广州生物医药与健康研究院中国科学院再生生物学重点实验室，广州 510530)
摘　要：基因打靶猪在农业和生物医药领域均有广泛用途。由于猪的能参与生殖系嵌合体的多能性干细胞
尚未建立成功，基因打靶猪的培育主要是通过体细胞克隆技术来实现。最初，人们在体细胞上通过传统的
同源重组技术成功地建立了基因敲除克隆猪，但体细胞在体外的增殖能力有限，传统同源重组在体细胞的
打靶效率极低。虽经十多年的发展，但在世界范围内获得的基因打靶猪屈指可数。最近，三种工程核酸酶
介导的基因编辑技术 (ZFN、TALEN和 CRISPR/Cas9)的出现，使体细胞的基因打靶效率大大提高。多个实
验室将其用于猪，实现了高效基因打靶，并在很短的一段时间里，获得了一系列基因打靶猪。就传统同源
重组技术以及近几年发展起来的新兴基因编辑技术在基因修饰猪的应用研究进展进行了综述。
关键词：体细胞克隆；同源重组；ZFN；TALEN；CRISPR/Cas9
中图分类号：Q789；Q819 文献标志码：A

Gene-targeted pigs based on somatic cell cloning approaches
YAN Quan-Mei, LAI Liang-Xue*
(Key Laboratory of Regenerative Biology, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health,
Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510530, China)
Abstract: Gene-targeted pigs have wide applications in agriculture and biomedicine. Due to unavailability of germ
line competent pluripotent cells, the production of gene-targeted pigs is mainly through somatic cell cloning.
Initially, homologous recombination technology was used to target the genome in pigs. However, the efficiency of
gene targeting in somatic cells is extremely low because of` their low proliferative capacity in vitro. As a result, only
a few gene-targeted pigs have been reported in last decade. With the three newly emerging gene editing technologies
(ZFN, TALEN and CRISPR/CAS9) coming into use, the efficiency of gene targeting in somatic cells has
赖良学，博士，中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员。长期
致力于人和动物胚胎干细胞的分离培养、基因修饰动物的建立及动物克隆
等研究。在动物克隆和基因打靶方面，赖良学博士多次在世界上率先取得
突破性成功，并由此树立起了其在国际上的学术优势地位，在此基础上成
功地建立了 20余种在生物医药和农业领域具有重要用途的基因修饰克隆
猪。赖良学博士是国家高技术研究发展计划 (“863”计划 )重点项目主持人，
国家重大基础研究发展计划 (“973”计划 )项目首席科学家，中国海外杰
出青年基金获得者。以第一作者或通讯作者在 SCI杂志包括 Science、
Nature Biotechnology、PNAS、Human Molecular Genetics 和 Cell Research
等发表论文 70余篇。论文被引用次数达到 2 600多次，单篇文章被用达
800余次。
颜泉梅，等：基于体细胞克隆的猪基因打靶技术研究进展第1期 57
significantly been improved. These three technologies have been successfully applied to pigs with a very high
efficiency and many gene-targeted pigs have been generated. In this review, we discussed the progress of gene-
targeted pigs with traditional homologous recombination and newly emerging gene editing technologies.
Key words: somatic cell cloning; homologous recombination; ZFN; TALEN; CRISPR/Cas9
基因修饰猪可用于培育在农业和生物医药领域
有重要应用价值的新品系。体细胞克隆技术出现之
前，受精卵 DNA原核注射、精子载体法以及病毒
载体法是对大动物基因组进行修饰的主要方法，这
些方法可用于制备表达外源基因的转基因动物。但
是，这些方法导入的外源 DNA在宿主基因组上的
整合位点是随机的，由于受上下游基因的影响，其
表达量不确定或不表达。另外，这种随机插入的基
因还有可能扰乱宿主基因组的表达。体细胞克隆技
术的出现，使得大动物基因组的定点修饰成为可能，
人们可以对体细胞进行基因定点修饰，获得的打靶
体细胞用体细胞克隆，即可制作基因打靶大动物。
猪的第一例体细胞克隆在 2000年获得成功后 [1]，
猪核移植技术不断完善，虽然用于繁殖生产的效率
尚需进一步提高，但用于基因修饰猪的培育已不是
主要问题。体细胞克隆途径的基因打靶猪的培育的
真正障碍在于基因修饰细胞系的建立。由于体细胞
在体外的增殖能力有限，在体外培养一定时间后会
很快衰老，对其进行的打靶效率极低。因而，如何
高效获得基因打靶体细胞系就成为基于体细胞克隆
技术的基因打靶大动物培育的关键。
1　传统的同源重组技术
传统的同源重组技术 (homologous recombination,
HR)，是利用指外源 DNA片段与宿主基因组 DNA
存在的同源关系，在外源基因导入宿主基因组后，
与宿主基因片段发生交换、重组，从而使外源
DNA整合到基因组上的特定位置上，实现对 DNA
进行靶向修饰，最终改造生物遗传特性的技术 [2]。
20世纪 70年代，同源重组技术最早是在酵母细胞
中发展起来的 [3]，随后在哺乳动物细胞也得以实
现 [4-5]。利用传统的同源重组技术进行细胞的基因
打靶流程包括如下 3个关键步骤。第一步是同源重
组载体的构建。同源重组载体主要包括 5′和 3′侧
的同源序列和两者间的外源序列，根据外源序列的
类型，可以锚定其靶基因组上插入的位置，从而达
到基因敲除 (破坏內源基因的表达 )、基因敲入 (外
源基因在宿主细胞特定位置表达功能蛋白 )和基因
定点突变 (纠正宿主突变的致病基因 )的目的。第
二步是同源重组载体的细胞转染。电穿孔转染法、
脂质体转染、病毒感染等 3种方法均可有效地将外
源基因转入体细胞。第三步是阳性细胞克隆的筛选
和鉴定。常用的是正负双向筛选法和启动子捕获法。
正负筛选法是利用载体携带的正负选择基因，或位
于两侧同源区内的正选择基因 (neo或者 puro基因
等 )，前者在随机整合和同源重组中均可正常表达；
而位于两侧同源区之外的负选择基因 (多为 HSV-tk
基因 )可以排除随机整合的细胞克隆 [6]。启动子捕
获法是在同源序列中插入一个正向的选择标记基
因，该标记基因缺少自身启动的启动子序列，只有
定点整合，才能表达。对于筛选的细胞克隆的鉴定，
一般是先采用 PCR法，其中一条引物位于打靶载
体上的外源序列区，另一条引物位于基因组上同源
序列的外侧，然后再通过 Southern blot方法进一步
确定是否发生了同源重组。
同源重组是否能够高效发生受多因素影响，包
括：1)打靶载体的同源序列与宿主细胞基因组序列
的同源性，同源性越高则打靶效率越高。因此，一
般在构建打靶载体时，都采用高保真的 DNA聚合
酶来扩增同源序列，以提高其同源性。2)打靶载体
同源序列的长度。Thomas等 [5]发现当同源序列的
长度由 4 kb增加到 9 kb时，其同源重组效率可以
增加 10倍。但同源序列过长会增加 PCR方法鉴定
的难度，权衡打靶效率和 PCR鉴定难度，目前打
靶载体的同源序列一般在 4~8 kb。3)外源 DNA导
入的效率。理论上效率越高，同源重组的效率也会
越高。4)靶基因的位置。同源重组效率在不同基因
和同一个基因不同位置的靶位点的选择存在差异。
一般来说，转录活性高的基因有利于基因同源重组
的发生 [7]。
在自然情况下，同源重组的发生概率极其低下，
大约在百万分之一，对哺乳动物而言，通过受精卵
或生殖细胞途径直接建立基因打靶动物是不可能
的。1981年，能参与生殖系嵌合体形成的小鼠胚胎
干细 (embryonic stem cell, ESC)的建立才使动物水
平上的基因打靶成为可能 [8]。利用同源重组技术对
小鼠 ES细胞进行基因打靶，然后将基因打靶细胞
制作嵌合体小鼠，再将后者进行回交即可获得基因
生命科学 第27卷58
打靶小鼠。1989年，第一例利用同源重组技术结合
小鼠胚胎干细胞的基因敲除小鼠诞生。随后的几十
年里，小鼠同源重组技术在研究基因功能方面发挥
了极大的作用。但是，包括猪在内的大动物都没有
建立真正的具有生殖系嵌合能力的 ESC或诱导多
能干细胞 (induced pluripotent stem cell, iPSC)，所以
同源重组技术在大动物上一直未能实现。直到 1997
年，体细胞核移植技术 (somatic cell nuclear transfer,
SCNT)的出现，使得大动物的基因打靶有了可能
性 [9]。SCNT是指将一个体细胞的核移植到一个去
核的卵母细胞中，得到与供体细胞基因组相同的新
个体的技术。在核移植之前，对体细胞进行基因定
向打靶，经筛选、鉴定和扩增，然后将其作为供体核，
获得的克隆动物即为基因打靶动物。
2000年，首例利用体细胞克隆技术获得的基
因打靶动物在绵羊上获得成功 [10]。2002年，首例
基因打靶猪诞生——α-1,3-半乳糖苷酶基因敲除克
隆猪，为异种器官移植的研究提供了理想的实验动
物模型 [11]。随后的十年，很多实验室进行了大量的
尝试，但到目前为止利用该技术培育出的基因打靶
猪数量极其有限，公开报道只有敲除 CFTR基因 [12]、
免疫球蛋白 κ链基因 [13]、免疫球蛋白重链 J 区基
因 [14]、SMN基因 [15]和 FAH基因 [16]几例。而在猪
定点基因敲入方面，仅见猪 ROSA26位点定点敲入
可用 Cre/Loxp调控的双荧光报告系统 [17]以及对猪
CFTR基因的定点突变 [18]两篇报道。其原因在于自
然状态下发生同源重组的概率为 10−6，而由于体细
胞的增殖能力有限，其同源重组的效率比在 ESC
中低大约 2个数量级，即使使用筛选基因，往往在
数百甚至上千个克隆中才能挑到所需的阳性克隆，
因此，工作量十分庞大，成功与否，带有偶然性。
此外，利用该技术在体细胞上进行的基因打靶，一
般只能得到单等位基因的打靶，需要通过育种或二
次基因打靶得到双等位基因的打靶猪，由于猪的性
成熟时间 (5~7个月 )和妊娠期 (115天 )均很长，因
此要获得纯合子基因打靶猪所需时间较长，一般需
2~3年。
科学家们一直在寻求更高效的基因打靶技术来
取代传统的同源重组技术，使大动物能够像小鼠一
样可随心所欲地对其基因组进行定向改造。最近几
年新兴的工程核酸酶介导基因编辑技术的出现使这
一梦想得以实现。
人们在寻找新的基因打靶技术时，也基本是沿
着同源重组的思路进行的。在自然条件下，细胞的
基因组会经常发生双链断裂 (double strand break,
DSB)，但细胞有能够自身修复的能力。修复的方式
主要有两种：一种途径是同源重组方式 (homology-
directed repair, HDR)，以同源序列 (如同源姐妹染
色单体 DNA)为模板进行精确的修复；另一种途
径为非同源末端重组 (non-homologous end-joining,
NHEJ)，通过简单的末端连接将断裂的 DNA末端
连接起来，通常会导致小的局部缺失或者插入，或
者一个断裂末端也可能会连接到一个完全无关联的
位置而导致染色体异位 [19]。但在自然情况下，细胞
内自然发生 DSB的机率非常低，约为 10−6，这也是
同源重组为什么效率极其低下的原因。科学家们发
现，人为增加一个 DSB，同源重组的效率可以提高
1 000倍以上 [20-21]，并进一步设想，如果能够在打
靶位点处提高 DSB出现的机率，DSB刺激细胞启
动修复机制，NHEJ高频率发生，错误修复的几率
会大大提高，基因的错误修复则会导致基因的功能
失活，从而实现高效率的基因敲除；更进一步，如
果同时引入一个带有同源臂的 DNA模板，通过
HDR就可以实现高效率的外源基因的定点整合。
最近出现的 3种基因修饰技术，ZFN、TALEN和
CRISPR/Cas9正是基于提高细胞内特定基因的 DSB
发生的概率而先后开发出来的。应用这类技术，理
论上可以对任意细胞类型的任意基因进行定点改
造，因而被称为基因组编辑技术 (genome editing)。
这 3种技术有其共同点，均主要由识别特异序列
位点的识别域和切割基因组的核酸酶组成 [22]。这些
新兴的基因组编辑技术可以绕过同源重组这一低概
率的过程而达到高效基因敲除的目的，完全克服了
利用传统的同源重组技术介导基因敲除的低效率的
困境。
2　锌指核酸酶技术
锌指核酸酶技术 (zinc-finger nucleases, ZFNs)
技术是最早开发出来的一种核酸酶介导的基因打靶
技术，由一对锌指核酸酶组成。每个锌指核酸酶是
由 DNA结合域和 Fok I核酸内切酶的剪切结构域组
成的融合蛋白，这一对锌指核酸酶上的两个 DNA
结合域分别与 DNA的两条链结合后，两个 Fok I核
酸内切酶形成二聚体从而对 DNA双链进行切割产
生 DSB [23-24]。DNA结合域具有良好的可塑性，可
根据需求进行设计拼接，决定切割位置的特异性，
它是由一系列 Cys2-His2 锌指蛋白 (zinc finger protein,
ZFP)串联组成，每个锌指蛋白特异性识别并结合
颜泉梅，等：基于体细胞克隆的猪基因打靶技术研究进展第1期 59
DNA双螺旋中某一条单链上 3个连续的核苷酸——
三联子。一个锌指蛋白大概含有 30个氨基酸，形
成一个α螺旋和反向平行的两个β片层 (α-β-β)结构，
其中 α螺旋中 -1、+3和 +6位的氨基酸残基直接与
三联子的碱基相互作用，这就决定了该锌指蛋白的
特异性 [25]。多个锌指蛋白串联起来形成一个锌指蛋
白组就可以识别一段特异的碱基序列。Fok I核酸
内切酶来源于一种 IIS型限制性内切酶，同 ZFP的
C端融合。当形成二聚体时，Fok I核酸内切酶通常
在两个结合位点的间隔区约 5~7 bp处切割 , 产生的
DSB切口细胞可通过 NHEJ或 HR方式进行修复
DSB，从而引起基因敲除或是基因敲入 [26]。
利用 ZFNs介导基因发生同源重组的基本流程
如下：1)根据实验需要，在目标序列上选择合适的
靶位点并合成相应的 ZFN，以及体外检测 ZFN的
切割活性。2)在 ZFNs切割位置附近设计同源打靶
载体。传统的同源重组载体的同源序列一般都在
6~7 kb，而利用 ZFNs介导的同源重组载体的同源
序列在 500~1 500 bp，甚至 50 bp即可发生同源重
组 [27]。3)一对 ZFN和其同源重组打靶载体共同转
染细胞，然后进行细胞的筛选及鉴定。此过程基本
类似于传统的同源重组技术。
利用 ZFN技术已在多个物种中实现高效的基
因敲除，ZFN技术介导同源重组的研究最早追溯
到 2001年，研究人员在非洲爪蟾受精卵中直接注
射 ZFN mRNA，发现同源重组的效率高达 46%。
2005年，Urnov等 [28]对人细胞中 IL2RG基因缺陷
进行定点修复，发现在不筛选的情况下，基因修复
的效率高达 18%，并且其中有 7%的细胞发生了双
等位位点的基因修复。ZFNs在果蝇、小鼠细胞和
个体内、人的细胞系中都实现了基因打靶。猪是最
早利用 ZFN技术实现基因打靶的大动物。2010年，
Watanabe等 [29]利用 ZFN技术对绿色荧光猪细胞的
外源 GFP基因实现了高效敲除。2011年，Whyte
等 [30]用同样的方法和技术路线，在获得 GFP基因
敲除猪成纤维细胞后进行核移植，培育了 ZFN介
导的 GFP基因敲除猪；同年，我们实验室利用
ZFN技术敲除了猪的 PPARγ基因 [31]，第一次实现
了猪内源基因的敲除；同样在 2011年，Hauschild
等 [32]应用 ZFN技术又进一步实现了猪双等位基因
的敲除。这证明 ZFN技术不仅可以用于猪内、外
源基因的敲除，还可以只经一代核移植就可获得双
等位基因敲除的纯合子猪。但随后的两三年里，
ZFN介导的基因敲除猪并没有大量的报道；并且，
到目前为止，利用该技术获得基因敲入猪的报道也
没有出现。其原因在于 ZFN的合成比较复杂繁琐，
其制备技术专利掌握在少数实验室中，一对 ZFN
的售价昂贵，在 20万人民币左右，这在很大程度
上阻碍了 ZFN的推广应用。随后，新的更高效的
基因编辑技术的出现，使 ZFN的局限性更加突出。
3　类转录激活因子效应物核酸酶技术
类转录激活因子效应物核酸酶 (transcri-ption
activator-like effector nucleases, TALENs)技术是继
ZFN技术之后新发展的又一种基因定点修饰工具。
类似 ZFN技术，TALENs是由特异识别并结合
DNA序列的 TALE蛋白与 Fok I核酸内切酶融合组
成的。
早在 1989年，科学家们发现了来自于植物病
原微生物 Xanthomonas的菌体蛋白转录激活子样效
应因子 (transcription activator like effectors, TALEs)
的一段氨基酸序列能特异性识别并结合 DNA 序
列 [33]。TALE蛋白的核心是多个串联的重复片段，
每个片段由 33~35个氨基酸残基组成。这些重复片
段高度保守，只在第 12位和第 13位氨基酸存在差
异，这两位的氨基酸被称为重复可变双残基 (repeat
variable di-residue, RVD)，RVD与碱基有恒定的对
应关系，即 HD识别 C碱基、NI识别 A碱基、NG
识别 T碱基、NN识别 A或 G碱基以及 NS识别 4
种碱基 [34-35]。这些重复单元可以任意组合，相应地
就可以识别任意的 DNA序列。2011 年，Cermak
等 [36]将 TALE蛋白与 Fok I核酸内切酶融合在一起
组成 TALEN，并证明了 TALEN技术可以对靶序列
进行定点修饰。利用 TALEN技术介导基因同源重
组的流程虽然类似于 ZFN技术，但相比于 ZFN技
术，TALEN的构建要简单的多。
目前，构建 TALEN的方法有以下四种：1)
Gateway组装法 [37]。这是构建 TALENs的最早方法，
即把 TALE序列通过常规的酶切连接反应将 TALE
模块连接，最后再克隆到表达载体中。该方法费时
费力，而且成功率较低。2) Golden Gate组装法。
Zhang等 [38]利用 PCR方法扩增处含有酶切位点的
TALE单元，然后把所有的 TALE单元置于一个体
系中实现所有的酶切酶促反应。该方法把构建周期
缩短在一周之内。3) Toolbox组装方法。类似于
Golden Gate方法，通过 PCR方法引入同尾酶的酶
切位点，然后与 6个单元先组合，再把 3个这样的
组合连接到一起，最后克隆到 TALEN的骨架载体
生命科学 第27卷60
中 [39]。4)FLASH组装法。该方法是将生物素化的
TALE单元与磁珠相连，通过磁珠的引力固定
TALE单元，然后在自动化仪器中快速完成 TALEN
的构建 [40]。
TALEN技术不止在受精卵中通过注射 mRNA
实现了多个物种的基因打靶，而且在细胞系以及体
细胞中通过转染 DNA质粒也实现了多个物种的高
效基因打靶。在大动物上结合体细胞克隆技术，
Carlson 等 [41]于 2012年利用 TALENs在牛和猪上
实现了多个基因的敲除。我们实验室利用 TALEN
技术介导的同源重组技术结合体细胞克隆技术，获
得了 RAG基因敲除的免疫缺陷性猪。在 27头克隆
猪中，有 10头为 RAG2单等位碱基缺失，9头为
RAG1双等位碱基缺失，3头为 RAG2双等位碱基
缺失，这些碱基缺失都导致了外显子读码框移码。
RAG1/2双等位敲除猪表现出了典型的重症联合免
疫缺陷疾病，该猪模型将在生物医药和转化医学中
发挥重要作用 [42]。另外，我们利用 TALEN技术，
在猪中实现了基因的定点敲入。我们成功地在猪
ROSA26位点处敲入 Cre重组酶报告系统 [43]，该模
型将在猪体内世系追踪各类干细胞的分化和再生，
为揭示和人类干细胞相关的疾病机理和实施干细胞
治疗提供宝贵的大动物实验依据。 在此基础上，我
们实验室在 ROSA26位点引入一对异源 loxp位点，
经重组酶介导的基因交换，成功将 EGFP基因替换
为红色荧光蛋白 tdTomato基因，由此又获得了世
界上第一个重组酶介导的基因交换大动物模型。利
用该模型，研究人员可以将任意基因通过重组酶介
导的基因交换插入到 ROSA26位点，实现目的基因
在大动物所有组织中的无差异表达。同时，由于重
组酶介导的基因交换无需药物筛选即可获得，从而
使获得的转基因猪不携带外源的药物抗性基因，可
消除转基因猪农产品的生物安全和食品安全隐患。
在猪基因改造领域，这算得上是一个里程碑式的成
果，在新的基因编辑技术出现之前，其实现是不可
想象的。例如，我们实验室在用传统的同源重组技
术方法对 CRE酶基因的敲入尝试中，共筛选了 425
个克隆，但没有得到基因敲除的阳性克隆。随后利
用 TALEN技术，在获得 96个转染环状同源打靶载
体的细胞克隆中，其中有 14个细胞克隆发生了基
因敲入，同源重组率提高到 14.6%；在获得的 96
个转染线性化的同源打靶载体的细胞克隆中，有 46
个细胞克隆发生了基因的敲入，同源重组率高达
47.9%。
目前，我们实验室利用 TALEN技术已在猪体
细胞上实现了多个基因的定点敲入，甚至是点突变，
其中同源打靶载体的选择既可以是双链 DNA还可
以是单链寡核苷酸，基因敲入平均效率在 10%左右。
4　CRISPR/Cas9技术
CRISPR/Cas9技术是继 ZFN和 TALEN技术之
后最新的一种更高效实现基因定点修饰的基因编辑
技术。在被外来的病毒或是噬菌体入侵时，细菌能
通过一种叫做成簇的有规律间隔的短回文重复序列
(CRISPR)或与之相关 (Cas)的序列，在 RNA的介
导下来剪切外来基因，从而抵御这些病毒及噬菌体
对自身的破坏 [44-46]。一个 CRISPR/Cas基因座由重
复回文序列和间隔在这些 CRISPR之间的特异间隔
序列 (重复 -间隔 )串联组成的。这些 CRISPR序
列一般是和编码具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚
合酶等活性蛋白质的 CRISPR-associated (Cas)基因
相关联，而这些间隔序列可以特异性地识别外源核
酸 [47-48]。
CRISPR/Cas系统根据 Cas蛋白和序列的不同
分为 I、II、III 3种类型，研究比较深入并且应用广
泛的是第 II类型。在第 II类型中，参与的蛋白质
是 Cas9蛋白，该蛋白既能加工 crRNA，同时又能
切割外源DNA[49]。当外源DNA入侵细菌时，CRISPR
被转录为长的 RNA 前体 (pre-CRISPR RNA, pre-
crRNA)，之后由 Cas9蛋白加工成一系列短的含有
保守重复序列和间隔区的成熟 crRNA；在 pre-
crRNA 转录的同时，与其重复序列互补的反式激活
crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)也被转录
出来。在加工完成后，成熟 crRNA和 tracrRNA以
及 Cas9蛋白组成复合体，识别并结合与 crRNA互
补的 DNA序列，并对其进行切割 [50]。因为这一过
程是由成熟的 crRNA 参与识别结合 DNA后引导
Cas9蛋白发生切割作用，所以又称为 CRISPR/Cas9
系统。CRISPR/Cas9系统切割的位置位于 crRNA
互补序列下游邻近的 PAM区 (protospacer-sdjacent
motif)，PAM区的序列为 NGG。自然界的野生型
gRNA/Cas9系统中的 crRNA和 tracrRNA是在 Cas9
的加工过程中才产生的彼此独立的个体。科研人员
在体外把 crRNA和 tracrRNA 2个序列通过一个 4
碱基的连接环连接起来，构成一个新的单链引导
RNA (single guide RNA, sgRNA)，模拟体内 crRNA
和 tracrRNA形成的二聚体结构来结合 Cas9蛋白，
从而具有剪切 DNA的功能，所以该系统也称为
颜泉梅，等：基于体细胞克隆的猪基因打靶技术研究进展第1期 61
gRNA/Cas9系统 [51-52]。在此基础上，把这个 sgRNA
构建成表达载体，由U6或T7来启动 sgRNA的表达，
与表达 Cas9蛋白的质粒共同导入到细胞或受精卵
中，即可发挥基因打靶的功能 [51,53-54]。
相比于 ZFN和 TALEN技术，其设计合成更为
简单，整个载体的构建在一周内即可完成，并且打
靶效率更高。2013年，科学家首次报道了利用该技
术成功在人细胞中进行基因敲除。短短一年多时间，
CRISPR/Cas9系统已在多个物种上验证了其基因敲
除的高效率，并同时证实，CRISPR/Cas9系统还有
另一个独特的优势，即可以在一个细胞内同时高效
实现多个基因的靶向修饰，该技术已在多个物种的
胚胎、细胞以及个体上实现了多个基因的同时敲
除 [53,55]。目前，CRISPR/Cas9系统已经成为很多实
验室进行基因打靶的主流技术，该技术不仅具有比
TALENs更高的基因打靶效率，而且倾向于介导双
等位基因定点修饰 [56]。2014年，Hai等 [57]首次利
用 CRISPR/Cas9技术结合受精卵显微注射获得
vWF基因敲除猪，但这种基因打靶动物一般都是嵌
合体，需要进一步繁殖来获得基因打靶动物纯合体，
这比通过体细胞核移植技术获得基因打靶动物纯合
体耗时要长，尤其对猪等大动物来说，其繁殖周期
长，要获得纯合子打靶猪，需要的时间过长 (2~3年 )。
同年，美国 Prather实验室利用该技术结合体细胞
移植技术或受精卵显微注射都成功获得了 CD163
和 CD1D基因敲除猪 [58]。我们实验室在 2014年利
用 CRISPR/Cas9基因敲除技术成功地培育出两种基
因敲除克隆小型猪，即酪氨酸酶基因敲除猪和
PARK2与 PINK1双基因敲除猪，建立了人类白化
病和帕金森综合征两种猪模型 [59]。针对猪的酪氨酸
酶、PARK2与 PINK1基因的外显子分别设计 gRNAs，
将 gRNA和 Cas9质粒分别转染版纳小型猪的胎儿
成纤维细胞和巴马小型猪的胎儿成纤维细胞后，获
得了纯合的酪氨酸酶基因敲除以及 PARK2与
PINK1双基因敲除的细胞系。将细胞系用于体细胞
核移植后，获得 15头酪氨酸酶基因敲除克隆猪，
20头 PARK2与 PINK1双基因敲除克隆猪。酪氨酸
酶基因敲除后，本为黑色的版纳小型猪，变成了白
猪，表现出了典型的白化病特征；而缺失 PARK2
与 PINK1双基因的敲除克隆猪可以作为帕金森症
大动物模型，用于研究其发生机制和评估相关治疗
药物的有效性和安全性。CRISPR/Cas9技术与体细
胞克隆相结合，不仅使猪基因打靶效率更高、更为
精确，而且在一个世代内首次实现了大动物双基因
的等位敲除。该技术路线的建立将大大加速多基因
修饰猪的制备。
CRISPR/Cas9技术除了广泛用于基因敲除的研
究，其还在多个细胞系和个体上成功进行了基因的
定点敲入 [55,60-61]，如 Auer等 [62]在斑马鱼的胚胎和
细胞内通过同源重组介导长达 5.7 kb的基因的定点
敲入，其最高效率可达 66%。此外，CRISPR/Cas9
技术结合单链寡核苷酸链在靶位点处引入两个 lox
位点即可达到条件性基因敲除的目的 [61,63]。我们实
验室利用该技术结合同源重组载体，获得了多个基
因的定点敲入猪和利用寡核苷酸链介导的基因定点
突变猪，平均效率在 15%以上，且能够得到双等
位基因的打靶 (数据未发表 )。CRISPR/Cas9系统
的出现是基因打靶技术史上又一次革命性的飞跃。
5　问题和展望
在大规模应用之前，ZFN、TALEN和 CRISPR/
Cas9技术还有一些问题需要解决，最令人关切的是
潜在的脱靶问题。这 3种技术都存在潜在的脱靶问
题，其中 ZFN系统的打靶效率最低、脱靶率最低，
而 CRISPR/Cas9系统与其相反，打靶效率最高，但
脱靶问题也最高。在实际应用中，如何克服该技术
的脱靶效应将是一个关键问题。在实践中，我们实
验室采用了如下两种方法来克服潜在脱靶问题，一
是在设计和构建载体时，靶位点选择应尽量规避那
些具有潜在脱靶效应的位点，具体做法是利用
E-CRISPR网站 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/design-
crispr.html)来筛选某个基因的所有合适靶位点，再
结合 NCBI的 BLAST功能一一比对这些靶位点与
该物种基因组的匹配程度，舍弃那些有超过 14个
碱基与基因组序列匹配的靶位点，并且尽量选择与
基因组匹配程度最低的靶位点，但即使在理论上选
择了最适的靶位点，也不能完全克服脱靶问题。二
是在筛选出基因打靶细胞系后，通过把不同的阳性
细胞克隆混合在一起，然后将混合的细胞进行核移
植，这样将有不同类型突变的克隆胚移植到同一代
孕母猪中。这种方法是行之有效的，因为脱靶是随
机发生的，不良脱靶在不同的细胞系出现也是随机
的。由于在制备克隆猪时，移植的胚胎一般在 100
枚以上，只有那些没有发生有害脱靶的胚胎才能活
下来并发育到期，这样就可以增加获得正常基因打
靶猪的概率。
总之，ZFN、TALEN和 CRISPR/Cas9技术是
生物学和生物医药等研究领域中的革命性工具，几
生命科学 第27卷62
乎可以对任意物种的基因组进行靶向修饰，使得对
于基因的功能研究、疾病模型的建立等可以应用到
猪等与人类亲缘关系更接近的大动物上，也有望成
为基因治疗的重要手段。这些技术的不断完善，将
极大地推动基因修饰猪在农业和生物医药领域的广
泛应用。
[参　考　文　献]
[1] Polejaeva IA, Chen SH, Vaught TD, et al. Cloned pigs
produced by nuclear transfer from adult somatic cells.
Nature, 2000, 407(6800): 86-90
[2] Capecchi MR. Altering the genome b y h o m o l o g o u s
recombination. Science, 1989, 244(4910): 1288-92
[3] Hinnen A, Hicks JB, Fink GR. Transformation of yeast.
Proc Natl Acad Sci USA, 1978, 75(4): 1929-33
[4] Smithies O, Gregg RG, Boggs SS, et al. Insertion of DNA
sequences into the human chromosomal β-globin locus by
homologous recombination. Nature, 1985, 317(6034):
230-4
[5] Thomas KR, Capecchi MR. Site-directed mutagenesis by
gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell,
1987, 51(3): 503-12
[6] Sedivy JM, Sharp PA. Positive genetic selection for gene
disruption in mammalian cells by homologous recombina-
tion. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(1): 227-31
[7] Frohman MA, Martin GR. Cut, paste, and save: new
approaches to altering specific genes in mice. Cell, 1989,
56(2): 145-7
[8] Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of
pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 1981,
292(5819): 154-6
[9] Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, et al. Viable offspring
derived from fetal and adult mammalian cells. Nature,
1997, 385(6619): 810-3
[10] McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KH, et al. Production
of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured
somatic cells. Nature, 2000, 405(6790): 1066-9
[11] Lai L, Kolber-Simonds D, Park KW, et al. Production of
α-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear
transfer cloning. Science, 2002, 295(5557): 1089-92
[12] Rogers CS, Stoltz DA, Meyerholz DK, et al. Disruption of
the CFTR gene produces a model of cystic fibrosis in
newborn pigs. Science, 2008, 321(5897): 1837-41
[13] Ramsoondar J, Mendicino M, Phelps C, et al. Targeted
disruption of the porcine immunoglobulin κ light chain
locus. Transgenic Res, 2011, 20(3): 643-53
[14] Mendicino M, Ramsoondar J, Phelps C, et al. Generation
of antibody- and B cell-deficient pigs by targeted disrup-
tion of the J-region gene segment of the heavy chain
locus. Transgenic Res, 2011, 20(3): 625-41
[15] Lorson MA, Spate LD, Samuel MS, et al. Disruption of
the Survival Motor Neuron (SMN) gene in pigs using
ssDNA. Transgenic Res, 2011, 20(6): 1293-304
[16] Hickey RD, Lillegard JB, Fisher JE, et al. Efficient pro-
duction of Fah-null heterozygote pigs by chimeric ade-
no-associated virus-mediated gene knockout and somatic
cell nuclear transfer. Hepatology, 2011, 54(4): 1351-9
[17] Li S, Flisikowska T, Kurome M, et al. Dual fluorescent
reporter pig for Cre recombination: transgene placement
at the ROSA26 locus. PLoS One, 2014, 9(7): e102455
[18] Rogers CS, Hao Y, Rokhlina T, et al. Production of
CFTR-null and CFTR-ΔF508 heterozygous pigs by ade-
no-associated virus-mediated gene targeting and somatic
cell nuclear transfer. J Clin Invest, 2008, 118(4): 1571-7
[19] Wyman C, Kanaar R. DNA double-strand break repair:
all’s well that ends well. Annu Rev Genet, 2006, 40: 363-
83
[20] Rouet P, Smih F, Jasin M. Expression of a site-specific en-
donuclease stimulates homologous recombination in
mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(13):
6064-8
[21] Choulika A, Perrin A, Dujon B, et al. Induction of homol-
ogous recombination in mammalian chromosomes by
using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae. Mol
Cell Biol, 1995, 15(4): 1968-73
[22] Gaj T, Gersbach CA, Barbas CF 3rd. ZFN, TALEN, and
CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.
Trends Biotechnol, 2013, 31(7): 397-405
[23] Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction en-
zymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc
Natl Acad Sci USA, 1996, 93(3): 1156-60
[24] Klug A. The discovery of zinc fingers and their develop-
ment for practical applications in gene regulation and
genome manipulation. Q Rev Biophys, 2010, 43(1): 1-21
[25] Pabo CO, Peisach E, Grant RA. Design and selection of
novel Cys2His2 zinc finger proteins. Annu Rev Biochem,
2001, 70: 313-40
[26] Porteus MH, Carroll D. Gene targeting using zinc finger
nucleases. Nat Biotechnol, 2005, 23(8): 967-73
[27] Orlando SJ, Santiago Y, DeKelver RC, et al. Zinc-finger
nuclease-driven targeted integration into mammalian
genomes using donors with limited chromosomal homolo-
gy. Nucleic Acids Res, 2010, 38(15): e152
[28] Urnov FD, Miller JC, Lee YL, et al. Highly efficient
endogenous human gene correction using designed
zinc-finger nucleases. Nature, 2005, 435(7042): 646-51
[29] Watanabe M, Umeyama K, Matsunari H, et al. Knockout
of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using
zinc-finger nucleases. Biochem Biophys Res Commun,
2010, 402(1): 14-8
[30] Whyte JJ, Prather RS. Cell Biology Symposium: zinc
finger nucleases to create custom-designed modifications
in the swine (Sus scrofa) genome. J Anim Sci, 2012,
90(4): 1111-7
[31] Yang D, Yang H, Li W, et al. Generation of PPARγ
mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and
nuclear transfer cloning. Cell Res, 2011, 21(6): 979-82
[32] Hauschild J, Petersen B, Santiago Y, et al. Efficient gener-
ation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger
nucleases. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(29):
12013-7
[33] Boch J, Bonas U. Xanthomonas AvrBs3 Family-Type III
颜泉梅，等：基于体细胞克隆的猪基因打靶技术研究进展第1期 63
Effectors: discovery and function. Annu Rev Phytopathol,
2010, 48: 419-36
[34] Boch J, Scholze H, Schornack S, et al. Breaking the code
of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.
Science, 2009, 326(5959): 1509-12
[35] Moscou MJ, Bogdanove AJ. A simple cipher governs
DNA recognition by TAL effectors. Science, 2009,
326(5959): 1501
[36] Cermak T, Doyle EL, Christian M, et al. Efficient design
and assembly of custom TALEN and other TAL effector-
based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res,
2011, 39(12): e82
[37] Mahfouz MM, Li L, Shamimuzzaman M, et al. De novo-
engineered transcription activator-like effector (TALE)
hybrid nuclease with novel DNA binding specificity cre-
ates double-strand breaks. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,
108(6): 2623-8
[38] Zhang F, Cong L, Lodato S, et al. Efficient construction of
sequence-specific TAL effectors for modulating mammali-
an transcription. Nat Biotechnol, 2011, 29(2): 149-53
[39] Sanjana NE, Cong L, Zhou Y, et al. A transcription activa-
tor-like effector toolbox for genome engineering. Nat Pro-
toc, 2012, 7(1): 171-92
[40] Reyon D, Tsai SQ, Khayter C, et al. FLASH assembly of
TALENs for high-throughput genome editing. Nat
Biotechnol, 2012, 30(5): 460-5
[41] Carlson DF, Tan W, Lillico SG, et al. Efficient TALEN-
mediated gene knockout in livestock. Proc Natl Acad Sci
USA, 2012, 109(43): 17382-7
[42] Huang J, Guo X, Fan N, et al. RAG1/2 knockout pigs with
severe combined immunodeficiency. J Immunol, 2014,
193(3): 1496-503
[43] Li X, Yang Y, Bu L, et al. Rosa26-targeted swine models
for stable gene over-expression and Cre-mediated lineage
tracing. Cell Res, 2014, 24(4): 501-4
[44] Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA. RNA-guided
genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature,
2012, 482(7385): 331-8
[45] Horvath P, Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune
system of bacteria and archaea. Science, 2010, 327(5962):
167-70
[46] Terns MP, Terns RM. CRISPR-based adaptive immune
systems. Curr Opin Microbiol, 2011, 14(3): 321-7
[47] Jansen R, van Embden JDA, Gaastra W, et al. Identifica-
tion of genes that are associated with DNA repeats in pro-
karyotes. Mol Microbiol, 2002, 43(6): 1565-75
[48] Makarova KS, Aravind L, Grishin NV, et al. A DNA repair
system specific for thermophilic Archaea and bacteria pre-
dicted by genomic context analysis. Nucleic Acids Res,
2002, 30(2): 482-96
[49] Garneau JE, Dupuis ME, Villion M, et al. The CRISPR/
Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and
plasmid DNA. Nature, 2010, 468(7320): 67-71
[50] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, et al. CRISPR
RNA maturation by trans-encoded small RNA and host
factor RNase III. Nature, 2011, 471(7340): 602-7
[51] Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al. Efficient genome edit-
ing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotech-
nol, 2013, 31(3): 227-9
[52] Jinek M, East A, Cheng A, et al. RNA-programmed
genome editing in human cells. Elife, 2013, 2: e00471
[53] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome
engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013
339(6121): 819-23
[54] Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human
genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339(6121):
823-6
[55] Wang H, Yang H, Shivalila CS, et al. One-step generation
of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/
Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013, 153(4):
910-8
[56] Ding Q, Regan SN, Xia Y, et al. Enhanced efficiency of
human pluripotent stem cell genome editing th rough
replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell, 2013,
12(4): 393-4
[57] Hai T, Teng F, Guo R, et al. One-step generation of knock-
out pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell
Res, 2014, 24(3): 372-5
[58] Whitworth KM, Kiho L, Benne JA, et al. Use of the
CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered
pigs from in vitro-derived oocytes and embryos. Biol
Reprod, 2014, 91(3): 78
[59] Zhou X, Xin J, Fan N, et al. Generation of CRISPR/Cas9-
mediated gene-targeted pigs via somatic cell nuclear
transfer. Cell Mol Life Sci, 2014 [Epub ahead of print]
[60] Yoshimi K, Kaneko T, Voigt B, et al. Allele-specific
genome editing and correction of disease-associated phe-
notypes in rats using the CRISPR-Cas platform. Nat Com-
mun, 2014, 5: 4240
[61] Yang H, Wang H, Shivalila CS, et al. One-step generation
of mice carrying reporter and conditional alleles by CRIS-
PR/Cas-mediated genome engineering. Cell, 2013,
154(6): 1370-9
[62] Auer TO, Duroure K, De Cian A, et al. Highly efficient
CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by
homology-independent DNA repair. Genome Res, 2014,
24(1): 142-53
[63] Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al. Heritable and precise
zebrafish genome editing using a CRISPR-Cas system.
PLoS One, 2013, 8(7): e68708