全 文 ：内皮抑素研究进展
张耀洲1* 吴祥甫1, 2
( 1浙江理工大学生物化学研究所,杭州 310018; 2中国科学院上海生化与细胞生物研究所,上海 200031)
摘 要: 内皮抑素是一种能够强烈抑制血管形成的抑制因子,能够有效地抑制肿瘤细胞的生长和转移,因此
成为肿瘤研究领域的研究热点。就内皮抑素的发现, 性质和结构, 生物学功能, 抑制作用机理,内皮抑素基因治疗
以及目前在临床上的应用进行了简要总结和概括。
关键词: 内皮抑素 胶原蛋白 ! 肿瘤
Process in The Researches of Endostatin
Zhang Yaozhou1* Wu Xiangfu1, 2
( 1 Insti tute of Biochemistry , ZheJiang University of Sciences, Hangzhou 310018;
2ShangHai Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS, Shanghai 200031)
Abstract: Endostatin which was discovered casually by Oreilly from medicine school of Harvard university in 1997 could
potent inhibit angiogenesis. Further it could inhibit the growth and transfer of tumor cell, so endostatin became the focused object
of ant-i tumor therapy. In the article some information about endostatin were described at detail, these items including the discovery
of endostatin, its characteristics and structure, biological function, inhibiting mechanism, gene therapy and clinic application of
endostatin.
Key words: Endostatin Collagen ! Tumor
血管的形成通常是由正负调控因子的平衡决
定的,正调控因子促进血管形成和生长,而负调控因
子则起抑制作用。目前, 已发现许多促血管的形成
和抑制因子。促血管形成的因子包括:成纤维细胞生
长因子( FGF)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因
子(VEGF)、肝细胞生长因子( HGF)等;抑制血管生长
的因子包括:-干扰素诱导蛋白-10( IP-10)、血小板因
子-4(PE-4)、泌乳素N末端 16kD的降解产物、血管抑
素(Angiostatin)和新发现的内皮抑素( Endostatin)等。
肿瘤的生长和转移与血管的形成密切相关,若抑制肿
瘤细胞的营养通道(血管形成) ,可达到间接治疗肿瘤
的目的。近年来已有许多血管生成的抑制因子被发
现并进入临床试验,内皮抑素就是一种新的能强烈抑
制血管形成的抑制因子。
1 内皮抑素的发现
1997年, Oreilly等[ 1]在鼠内皮瘤细胞培养液
中发现一种新的、分子量为 20kD蛋白质。体外实验
表明它能特异性地抑制内皮细胞增生, 并呈剂量依
赖性, 如在 100ng/ ml 时出现明显的活性, 而在
600ng/ ml时则达到最大活性, 这一新的血管抑制因
子被命名为内皮抑素。
Standker等[ 2]从人体循环系统中提取了人源内
皮抑素, 与鼠源内皮抑素有 85%以上的同源性, 其
中包含了 4个保守的半胱氨酸, 但比鼠源内皮抑素
少 12个氨基酸和一个潜在的糖基化位点,且实验证
明,天然提取的人源内皮抑素无抑制内皮细胞增生
的活性,推测可能与缺失的 12个氨基酸有关。何志
勇等[ 3]从中国人肝细胞中克隆了人内皮抑素基因,
经序列分析发现有 5个碱基与文献报道不一样, 蛋
白序列中有 3个氨基酸残基不同。
2 内皮抑素的理化性质与结构
直接分离的鼠内皮抑素分子量为 20kD。序列
收稿日期: 2004-11-02
* 通讯作者:张耀洲, Tel: 0571-86843198, Fax: 0571-86843198, E-mail: yaozhou@ chinagene. com
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 1期
分析表明,其氨基酸序列与胶原 NC1结构域C
末端 184个氨基酸序列一致,疏水氨基酸占 42% ,并
含有 4个半胱氨酸。重组表达的人内皮抑素分子量
为18kD,与鼠内皮抑素的氨基酸序列有 85%的同源
性。二级结构含有 10%螺旋、70%片层。
Hohenester 等[ 4]首先得到 pH5时1. 5 10- 15m解
析度的鼠内皮抑素晶体, 发现与 C 型 Lect in、E-se-
lectin样蛋白家族有一定的相似性。其结构主要由
折叠片和环组成, 约有 40%氨基酸采用主链的这一
结构,并有两个 -螺旋。还有许多不规则构象如:打
结和膨胀等。其最主要的结构特征是: 由七股组成
的-折叠片高度缠绕在一起,由 14个氨基酸组成的
-螺旋面向这个折叠片, 而另一面被复杂的环结构
所覆盖, 这个环结构涉及到一个反向平行的 -折叠
片和一个短的 -螺旋。内皮抑素表面有 11个精氨
酸组成极碱性区域, 可能与结合肝素有关。
Ding 等[ 5]又在 pH8. 5的条件下得到人内皮抑素
的晶体, 发现 H132、H142、H134、ASP207参与同锌离
子结合, 并且围绕这个锌离子以多聚体形式存在。
结合锌离子可能只与立体结构有关, 与生物活性无
关。Noriko Yamaguchi等[ 6]的实验肯定了这种假设。
但早先 Boehm 等[ 7]的实验却显示锌离子与内皮抑素
的生物活性密切相关, 这也许是由于锌离子的结合
有助于内皮抑素维持有活性的构象。
3 内皮抑素的体内分布和激活
已证 实, 循环系统 中内皮抑素 的浓度为
120~ 130ng/ ml,与体外实验中显著抑制内皮细胞增
殖所需的浓度基本一致[ 1]。Sasaki等[ 8]对内皮抑素
高亲和力的多克隆抗体进行的免疫组化实验表明,
特别强的染色发生在发育胚胎中的皮肤、大脑、血管
基底膜,肾、肺基底膜和肺包膜, 而在成体组织基底
膜、肝细胞、肾基质显示了比较强的染色; 而在脑、骨
髓肌、心、肾、睾丸、肝等组织提取中内皮抑素含量为
0. 3~ 2g/ ml, 以肝脏最多。Miosge[ 9]发现内皮抑素
是管壁弹性纤维的一种组分, 从动脉的管壁中能抽
提得到大量内皮抑素。体式循环系统状态的内皮抑
素可能有组织特别是肝细胞产生, 并可能在血管生
成中起同态调节器的作用。
用内皮抑素的抗血清检测到人的血清中有 120
~ 300ng/ ml 的内皮抑素, 鼠血清检测到 120ng
12ng/ml,而从鼠的组织提取物(鼠脑、肌肉、心、肾、睾
丸和肝的提取物)中检测到了更高浓度的内皮抑素。
组织中的内皮抑素含量比血清中的高, 这提示血清
中的内皮抑素可能是组织中内皮抑素前体通过某种
方式释放出来的。
4 内皮抑素的表达
目前,重组鼠及人的内皮抑素分别在大肠杆菌、
酵母、昆虫杆状病毒表达系统( ACNPV)中得到高效
表达。Taddei等[ 10]克隆了人全长内皮抑素基因, 实
验证实其表达产物能有效地对抗 FGF-2和 VEGF-165
所引起的内皮细胞增生。在大肠杆菌中重组内皮抑
素的表达量为 30~ 40mg/ L,但易形成包涵体,且无糖
基化等修饰作用,体外实验无血管形成抑制活性。
重组内皮抑素在酵母中的表达量为 15~ 20mg/
L,内皮抑素 10mg/ kg的浓度可以抑制裸鼠模型中肾
癌细胞的生长。而且研究发现, 酵母中表达的可溶
性重组鼠内皮抑素和细菌表达的未折叠的不可溶抑
素蛋白的生物活性相当,而且内皮抑素 C末端的细
微切除突变会导致其活性的显著变化[ 11]。
O reilly等[ 12]利用昆虫杆状病毒系统 ( ACNPV)
表达内皮抑素, 产量为 1~ 2mg/ L。在牛毛细血管皮
细胞实验中, 发现重组内皮抑素能特异地抑制内皮
细胞的增生, 且呈剂量依赖性。在鸡胚尿囊膜实验
中, 重组内皮抑素同样对血管形成有明显的抑制作
用,且无任何毒副作用。
5 内皮抑素的生物学功能
5. 1 抑制内皮细胞和血管的增生
在细胞内, 内皮抑素可以抑制血管内皮细胞在
bEGF 诱导下的增殖、内皮细胞的迁移、诱导 bEGF 刺
激的血管内皮细胞凋亡, 内皮抑素还可以使内皮细
胞表现为形成血管结构时的形态, 结合在固体表面
的内皮抑素还可以维持内皮细胞的贴壁伸展形态。
5. 2 抑制肿瘤的生长和转移
内皮抑素无论对原发性肿瘤还是转移性肿瘤都
有强烈的抑制作用。O Reilly 等[ 13]构建了 Lewis肺
原发瘤、T241 纤维肉瘤、EOMA 血管内瘤和 B16F10
黑色素瘤小鼠模型, 将重组内皮抑素通过皮下注射
到小鼠体内。结果表明, 经过治疗后几种肿瘤被有
效地抑制, 且抑制效果与剂量有关。继续注射可使
肿瘤细胞处于休眠状态。说明内皮抑素适用于多种
2 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
恶性肿瘤。Bergers等[ 14]用四种不同的血管形成抑
制剂( AGM-1 470、血管抑素、BB-94、内皮抑素)进行
抗肿瘤实验, 发现内皮抑素抑制肿瘤生长作用最明
显,且与血管抑素共同使用效果更佳。Chen 等[ 15]采
用脂质体介导的基因治疗方法, 将分别含血管抑素
和内皮抑素基因的质粒导入小鼠体内, 用于治疗小
鼠乳癌,结果发现肿瘤生长体积分别减少了 36%和
49%。
5. 3 内皮抑素与细胞信号通路调节
Abdollahi等[ 16]利用 DNA芯片、抗体芯片以及选
择性杂交印迹和免疫组化技术研究表明, 内皮抑素
在人体表皮微血管内皮细胞中调节多条信号通路。
共有 8个信号传递途径受内皮抑素的负调控: Id和
激活蛋白 I信号途径(控制细胞扩增)、HIF-1信号
途径 (降低氧的消耗和代谢速率)、TNF-信号途径
(控制细胞转移)、NF-B 信号途径(控制细胞扩增和
抑制血管形成)、STAT 途径(控制细胞扩增和转移)、
Ets信号途径(控制细胞转移和抑制血管形成)、凝集
信号途径以及粘着分子途径。
5. 4 内皮抑素与视网膜病变
视网膜色素上皮细胞( RPE)形成非正常斑点继
而发生恶化是引起失明的主要原因之一。在斑点恶
化早期可以发现有基底膜沉积物。Marneros等人[ 17]
构建了缺失胶原 XVIII/内皮抑素等膜成分的小鼠模
型, 发现有大量的视网膜色素上皮细胞沉积物与基
底膜沉积物很相似, 而且小鼠出现了年龄依赖性失
明; 老龄变异鼠表现出不正常的光敏感性以及神经
胶质原纤维酸性蛋白的表达量增加等现象,由此可
见胶原 XVIII/内皮抑素对于视网膜色素上皮细胞发
挥作用是必需的。同样地,这种胶原在 Bruch膜上也
发挥重要作用;在基底膜上胶原 XVIII/内皮抑素的
超结构组织则是基底膜分子网络的一部分。
5. 5 内皮抑素与冠脉粥样硬化、冠脉成形术后再狭
窄
在冠脉粥样硬化斑块中, 新生血管的增加是斑
块破裂的原因之一。研究表明, 斑块内血管的再生
与新内膜的过度形成有关,斑块内过多的血液灌注
势必会加速动脉粥样硬化的进展, 因此抑制粥样硬
化斑块内的血管再生对缓解动脉粥样硬化的严重程
度,防治并发症有积极意义。
Wickstrm等[ 18]的研究表明, 促进再内皮化能抑
制损伤内膜增厚, 是防止冠脉成形术后再狭窄的有
效方法之一。血管抑制因子中血管抑素和内皮抑素
对冠脉成形术后再狭窄的影响值得进一步研究, 阐
明血管抑制因子在冠心病防治中的作用, 调节血管
因子可能是一种新的治疗策略。
5. 6 克服肿瘤的抗药性
Boehm 等[ 7]用内皮抑素治疗小鼠的 Lewis肺癌、
T241纤维肉瘤和 B16F10黑色素瘤,当肿瘤消退后立
即停止用药, 待肿瘤重新生长到一定大小时继续治
疗,如此经过 6、4或 2个循环后, 发现肿瘤生长停止
且处于休眠状态。解剖后发现, 所有的肿瘤都退化
到无需血管也能存活的状态, 试验中肿瘤未表现任
何抗药性。相比之下,化疗药物经过 3~ 4个治疗周
期就几乎丧失了抑瘤作用。
5. 7 促进肿瘤细胞的凋亡
研究表明内皮抑素可以诱导肿瘤细胞凋亡。O
Reilly[ 13]在通过用内皮抑素治疗Lewis肺原发性瘤时
发现,经过治疗的肿瘤细胞繁殖不受影响, 但细胞凋
亡的 tunel指数提高了 7倍, 推测内皮抑素可能会提
高肿瘤细胞凋亡的速率。Dhanabal等[ 19]通过实验发
现,内皮抑素能使 BCL-2和 BCL-X1 显著减少, 同时
不影响 BAX水平,这样大量 BAX二聚体形成并诱导
内皮细胞凋亡。这些都有待于分子机制上作进一步
研究。
6 内皮抑素的作用机理
到目前为止, 关于内皮抑素的作用机理尚不完
全清楚。Hohenester 等[ 20]认为:一个可能的机制就是
内皮抑素与其他血管形成刺激因子(例如 FGF 等)竞
争肝素或硫酸乙酰肝素亲合位点。而且发现, 用废
除了肝素亲和性的内皮抑素对 FGF-2介导的血管生
成无抑制作用。这说明内皮抑素的肝素亲和性有重
要的生物学功能。
Wickstrm等[ 18]利用含有膜表面裸露序列的内
皮抑素衍生肽确定了其与细胞的作用区域。在内皮
抑素的 N端引入富含精氨酸的十一肽段可以促进内
皮细胞间通过1整合蛋白的粘连(肝素亲和机制)。
另外, 该肽还能诱导膜边缘的形成; 在可溶的状态
下,其能抑制纤维原细胞生长因子。因此, 这种多肽
在这些细胞中能够引起中心粘连以及肌动蛋白应力
32005年第 1期 张耀洲等:内皮抑素研究进展
纤维无法形成。如果用丙氨酸代替精氨酸, 那么多
肽会失去上述特性。
Sylvie Ricard-Blum 等人[ 21]研究了内皮抑素与肝
素或硫酸乙酰肝素之间相互作用的动力学和亲合
力, 以及二价阳离子对这种相互作用和内皮抑素活
性的影响。动力学数据表明肝素与内皮抑素的结合
和解离速度高于硫酸乙酰肝素; 对内皮抑素与肝素
寡糖间复杂性进行分子模型预测, 发现与突变研究
相比,两个位于 47位和66位的精氨酸残基参与了结
合。因此内皮抑素与肝素或硫酸乙酰肝素的结合需
要二价阳离子的存在。添加 ZnCl2能够提高内皮抑
素与肝素或硫酸乙酰肝素的结合能力。
一般认为内皮抑素特异性的抑制内皮细胞的增
殖, 其机制可能与内皮细胞凋亡的增加或细胞周期
的改变有关, 而不是直接作用于肿瘤细胞的生
长[ 19] ,因为在内皮抑素作用下肿瘤细胞的增殖并不
受影响。内皮抑素通过抑制肿瘤血管的生长, 导致
肿瘤缺氧, 再加上其他可能的间接细胞毒作用从而
使肿瘤细胞坏死、凋亡, 肿瘤收缩[ 22]。内皮抑素的
生物学功能也可能是通过直接或间接改变其他与生
长相关分子的表达而实现的。如下调促进血管生长
的分子。但是肿瘤细胞、内皮细胞自身产生促进或
抑制血管生长的因子, 而且许多生长因子也可以被
细胞外基质激活, 因此由内皮抑素引起的这些因子
表达的改变很难进行检测。如对 VGEF 的影响,
Kirsch等[ 23]得出的结果与 Ivan 等[ 24]的结果截然相
反。
E选择蛋白是内皮细胞诱导生成的一种白细胞
粘着分子, 其已被证明在抑制血管形成中起暗示作
用。通过体内、体外的微血管形成实验, Ying Yu等
人[ 24]发现内皮抑素和 E 选择蛋白间存在功能关联
作用。在缺失 E 选择蛋白的WT 小鼠体内, 内皮抑
素抑制血管内皮生长因子,该生长因子刺激内皮芽
形成进而形成血管。为了进一步揭示内皮抑素发挥
作用时对 E选择蛋白的要求,人为控制在人脐静脉
内皮细胞和表皮微血管内皮细胞中诱导表达 E 选择
蛋白, 当用 IL-1诱导 E选择蛋白表达时, 上述两种
细胞对内皮抑素抑制血管内皮生长因子的作用变得
更敏感,因此E 选择蛋白可能是一种在内皮抑素发
挥高效抑制血管形成作用中有用的预示分子和调节
因子。
E37在体内可以抑制内皮抑素的肿瘤抑制活性
达87%。原因是 E37与原肌球蛋白竞争结合内皮抑
素。因此他们认为内皮抑素与原肌球蛋白的结合破
坏了微丝结构的完整性, 从而导致细胞运动功能的
丧失,诱导凋亡, 最终抑制肿瘤。Marko 等[ 25]发现内
皮抑素可以在人脐静脉内皮细胞表面与 整合蛋
白结合,从而发挥生物学功能。固定的内皮抑素促
进内皮细胞的迁移、存活。相反, 可溶性的内皮抑素
却起着相反的作用。因此作者认为整合蛋白是内皮
抑素的潜在作用位点。
7 内皮抑素的基因治疗
内皮抑素在体外不稳定, 需长期、大剂量用药,
且重组内皮抑素生产过程复杂、造价昂贵等均使内
皮抑素的治疗受到限制。而利用载体把内皮抑素基
因导入体内, 通过在体内表达内皮抑素来发挥抗癌
功效, 则可以克服以上困难。目前用于基因治疗的
内皮抑素基因载体有质粒、脂质体、腺病毒、腺病毒
相关基因、逆转录病毒等。
Blezinger等[ 26]于动物肌肉注射内皮抑素基因表
达质粒, Chen等[ 15]以阳离子脂质体介导的内皮抑素
表达质粒静脉注入动物体内, 均观察到肿瘤生长受
到抑制。但相比之下, 这类以非病毒载体介导的转
内皮抑素基因治疗法的抑癌效应比内皮抑素的蛋白
质治疗要弱。Sauter 等[ 27]用重组腺病毒介导内皮抑
素基因转至荷瘤裸鼠体内,发现血内皮抑素持续明
显升高的同时还明显抑制了肺癌、乳腺癌的生长(与
对照组相比,肿瘤体积减少了 78%) ,并能完全阻止
肺部微小转移灶的形成。在另一以腺病毒为载体的
实验中, Chen等[ 17]发现经静脉注射导入内皮抑素基
因后也出现了持续高水平的内皮抑素表达,在肝转
移小鼠模型中, 预防性单次注射这些介导内皮抑素
基因的腺病毒后不仅延长了荷瘤小鼠的存活期 (平
均存活 85天, 对照组 30~ 37天) , 还在 25%的小鼠
中起到完全防止肝转移形成的作用。
Eiji Kikuchi等[ 28]研究发现含有绿色荧光蛋白的
失活慢病毒能够单独或结合内皮抑素后有效的将基
因转移到膀胱癌细胞中,并可在其中表达、分泌, 抑
制血管形成和肿瘤生长。慢病毒载体介导的内皮抑
素基因的大量表达并不会影响内源纤维原细胞生长
4 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
因子和血管内皮生长因子的生成。
有体外实验表明, 内皮抑素的剂量与其抑制内
皮细胞生长的能力正相关,以上的体内实验似乎也
证明这点。但 Folkman等[ 29]却认为血内皮抑素水平
与其在体内的抗癌能力无相关性。他们将逆转录病
毒内皮抑素基因转入鼠肝癌细胞株, 并观察经皮下
和腹腔内注入转基因的肿瘤细胞株后肿瘤生长的情
况,结果发现,转基因细胞株能表达有功能的内皮抑
素,且肿瘤生长明显受到抑制,血清中内皮抑素并不
升高,仅在肿瘤细胞溶解液中有内皮抑素中升高。
8 内皮抑素在临床上的应用前景
抗血管形成治疗主要是通过阻断新生血管的形
成,从而抑制肿瘤的生长、减少和预防肿瘤转移, 是
一种截断粮草治疗肿瘤的新策略。
内皮抑素作为内皮细胞繁殖、迁移和血管生成
的专一性抑制, 其抗血管生成的作用具有广谱、低毒
的特点,更重要的是,用内皮抑素治疗克服肿瘤的抗
药性, 这对于人类最终克服肿瘤是非常重要的。如
今在对肿瘤病人进行化疗时, 一个最突出的问题是
肿瘤会对药物产生抗性, 这种情况在化疗病人当中
约占 30%。抗药性的主要原因是由于肿瘤细胞基因
组的不稳定性和高突变率造成的;相反,内皮细胞的
基因组相对稳定、突变率低, 因此以内皮细胞为靶点
的内皮抑素在原理上是不会引起任何抗药性,这一
点已经在实验中得到证实[ 10]。
内皮抑素发现仅两年之后, 美国 FDA 就批准
Folkman等将重组人内皮抑素蛋白用于人体实验。
据DANA-FARBER癌症研究所对临床 期结果的报
告显示:内皮抑素在实验的各种剂量下,均对病人无
任何毒副作用。现在准备进入 期临床, 进一步验
证其对肿瘤的确切疗效。
除了抗癌作用以外, 在其它有血管异常增生的
疾病如:牛皮癣、糖尿病、视网膜病变、类风湿性关节
炎等都可用内皮抑素作为治疗和诊断用药。
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致 读 者
经上级有关部门批准,原中国农业科学院科技文献信息中心更名为中国农业科学院农业信息研究所,同
时,银行户名改为中国农业科学院农业信息研究所,开户银行、账号、电话、通讯地址等不变。
特此敬告!
生物技术通报编辑部
2005年 1月
112005年第 1期 李海权等:基因组细菌人工染色体文库( BAC)的构建及应用