全 文 ：NOV．2008
· 58·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第6期
2008年11月
重组人内皮抑素工程菌菌种稳定性考察
陈罗胜，殷润婷，徐寒梅，奚 涛
(中国药科大学 生物技术中心，南京210009)
摘要：研究重组人内皮抑素突变体质粒HM．E的宿主茵EcoliBL21(DE3)在LB培养基中传代50代过程中茵
种的稳定性。研究表明，重组人内皮抑素工程菌在传代50代的过程中质粒稳定性(ST)高，为98％，茵体与茵落呈
典型的大肠杆茵形态，反复冻融后表达量未下降，目标蛋白在茵体超声的沉淀中质量分数为(58．75±3．78)％，同
时，四甲基偶氮唑盐微量反应比色法(MYr)结果表明目的蛋白质量浓度为20pe,／mL时对内皮细胞ECV-304具有
很高的抑制率，达(94．72±2．10)％。
关键词：工程菌；质粒稳定性；重组人内皮抑素；茵种传代
中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)06—0058—05
StabilityofrecombinanthumanendostatinengineeringbacteriaE．Co／／
CHENLuo-sheng，YINRun-ting，XUHan—mei，XITao
(CenterofBiotechnology，ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210009，China)
Abstract：ThestrainstabilityofrecombinantE．coliB121(DE3)culturedinLBwagstudiedbybacterial
morphology，plasmidstabil ty(ST)，restrictionenzymedigestionanalysisofplasmid，expressionof
rhEndostatin，andexpressionactivityafterf eezethawing．TheplasmidofthebacteriaWaskeptwellafter
50generationsandSTof50thgenerationremained98％．Inthe50thgeneration，thecellandtheoloni．
almorphologywereidenticalwiththatofthetypicalE．colistrain．Themassfractionwagf58．75±
3．78)％afterreezethawing．M1Trdemonstratedth hetargetproteinof20斗s／mLhadhighinhibition
onECV-304andreached(94．72±2．10)％，thusrecombinantEcoliBL21(DE3)Wasstable．
Keywords：engineeringbacteria；plasmidst bility；recombinanthu aendos atin；strainpass ge
内皮抑素(Endostatin)是1997年0’Reilly等⋯
从体外培养的鼠血管内皮瘤细胞培养液中提取出
的一种相对分子质量为2．0×104的蛋白质，是胶原
XⅧ的C端片段，能够特异性抑制内皮细胞的增殖
和迁移，减少胶质细胞瘤血管和血流，进而抑制新
生血管的生长，有效抑制小鼠各种原发肿瘤。由于
正常的内皮细胞突变率很低，内皮抑素作为内源性
的抗肿瘤药物，不会产生抗药性，并且具有抑瘤效
果强、药物生理毒性小的特点，从而使之成为当前
研究的热点和最为看好的抗肿瘤新药之一。
内皮抑素在我国已经上市，商品名为恩度，临
床用于治疗非小细胞肺癌。但目前内皮抑素体内
作用靶点还不明确，无肿瘤靶向性，影响其体内抑
瘤效果。鉴于此，本实验室针对肿瘤高表达的分子
标记——整合素，对内皮抑素进行突变改造，在蛋
白序列中加入能和整合素结合的RGD(Arg—Gly-
Asp)序列。经过体内外药效学及作用机理研究发
现，重组人内皮抑素突变体能够有效识别肿瘤血管
收稿日期：2008-04-29
作者简介：陈罗胜(1982一)．男，广东深圳人。硕士研究生，研究方向：抗肿瘤新药的研发。
联系人：徐寒梅。副教授，E-mail：xuhanmei@yahoo．tom．cn
万方数据
2008年11月 陈罗胜等：重组人内皮抑素工程菌菌种稳定性考察 ·59·
内皮细胞及肿瘤细胞，聚集于肿瘤组织周围发挥作
用，与野生内皮抑素相比，其体内抑瘤率大大提高，
并且靶点明确，具有开发价值。本实验室对构建的
rhEndostatin突变体工程菌进行了系列研究，包括工
程菌稳定性研究。菌种的稳定性是影响工程菌大
规模发酵生产的关键因素之一，为此，对该菌种在
传代50代过程中的菌体和菌落形态、质粒稳定性
(ST)、质粒酶切图谱、目的蛋白表达水平、目的蛋白
的生物活性以及反复冻融等方面进行考察。
1材料和方法
1．1质粒和菌株
重组质粒HM．E由含人内皮抑素(rhEndostatin)
编码基因的片断、含氨苄青霉素(Amp)抗性基因和
r17启动子的原核表达载体pET23a构建，其中目的基
因片断长600bp，两端含限制性内切酶眦I和‰I
酶切位点，本实验室构建；宿主菌为EcoliB121
(DE3)，由本实验室保存。
1．2试剂
蛋白胨和酵母抽提物购自英国OXOID公司；
质粒抽提试剂盒购自天为时代公司；限制性内切酶
NdeI和XhoI购自英国NEB公司；其余试剂为国
产或进口分析纯试剂。
1．3方法
1．3．1工程菌形态观察"习J
取原始菌种接种于含100I山g／mL5’．磷酸腺甘
(Amp)的LB固体培养基中，37cc培养16h，观察
菌落的大小、形态等；取少量菌体做透射电镜观察；
按常规制片并进行革兰氏染色，光学显微镜下观察。
1．3．2菌种传代方法
将原始菌种(一80℃冻存甘油管中保存)于室
温下自然解冻后，接种于新鲜的含100I．Lg／mLAmp
的LB液体培养基中，37℃、200r／rain过夜培养，再
按2％接种量转接于新鲜的LB液体培养基中，
37℃培养8h，以后转接一次算作一代，直至传代
50代，其中分别于10、20、30、40和50代取样，于甘
油管(20％甘油)中冻存备用。
1．3．3质粒稳定性(ST)测定
质粒稳定性测定见文献[4—6]。
1．3．4质粒鉴定¨。1驯
用质粒抽提试剂盒分别提取O、10、20、30、40和
50代菌体的质粒，进行测序及酶切鉴定。电泳条件
为1．0％琼脂糖，120V恒压电泳检验。酶切方法按
产品说明书进行，其中质粒溶液32斗L，10×缓冲液
4斗L，NdeI和XhoI各2斗L，37℃，酶切4h。
1．3．5重组人内皮抑素的表达
取原代菌种(0代)、10、20、30、40和50代菌种
分别接种含100斗g／mLAmp的LB液体培养基，
37℃，200r／min培养4h，加入适量异丙基硫代半
乳糖苷(IPTG)(终浓度0．6mmol／L)，诱导5h，离
心收集菌体，加入适量缓冲液混悬，超声破碎细胞，
离心收集上清液及沉淀。处理后，进行聚丙烯酰胺
凝胶电泳(SDS-PAGE)。
1．3．6重组人内皮抑素复性及活性测定
1)复性测定
将工程菌发酵诱导培养后，离心收集菌体，洗
涤后离心，加入适量缓冲液重悬，冰浴条件下，超声
破碎细胞，离心收集沉淀，用包涵体洗涤液4℃洗
涤沉淀1h，离心收集沉淀，重复洗涤1次，沉淀用
包涵体溶解液4℃搅拌溶解，离心收集上清液，透
析复性后经处理冻干，得到rhEndostatin。
2)活性测定
采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(M，ITI)
测定活性¨¨。将ECV-304细胞以每孔(100此)
5000个细胞的密度加人96孔的培养板中，阳性对照
为恩度(Endostatin)，阴性对照为磷酸盐缓冲液
(PBS)。培养细胞并给予rhEndostatin100止刺激，
使终质量浓度分别为2．5、5、10、20峙／IIlL，各设5个
复孔。温育48h，每孔加入M1TI’溶液20汕，继续孵
育4h。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150汕，在
37℃细胞培养箱内继续孵育，直至在光学显微镜下
观察到不溶物全部溶解，于570mn处测定吸光值。
1．3．7菌种反复冻融考察
将原始菌种(一80℃冻存甘油管中保存)于室
温下自然解冻后，反复冻融11次，每次融化后，取
少量菌液接种于新鲜的含100pe,／mLAmp的LB
液体培养基，37℃、200r／min、4h，加入适量IPTG
(终浓度0．6mmoL／L)，诱导5h，离心收集菌体，加
入适量缓冲液混悬，超声破碎细胞，离心收集沉淀。
处理后，进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS．PAGE)。
2结果与讨论
2．1 菌落形态与菌体观察
电镜观察该工程菌，看到菌体呈短杆状。各代
万方数据
·60· 生物加工过程 第6卷第6期
次菌种在含100p．g／mLAmp的LB平板培养基上
划线培养，观察到菌落均呈白色，圆形隆起，边缘全
缘，光滑，有光泽，湿润，无其他杂菌生长。各代菌
均为革兰氏阴性短杆菌，形态均匀一致(图1)，以上
结果说明菌种为典型的大肠杆菌。
图l 不同代次工程菌的菌落与菌体形态
Fig．1Colonyandcellmorphologyofthengineering
bacteriumofdifferentg erations
2．2质粒稳定性(ST)
本研究考察了50代质粒稳定性，在传代30代
后。质粒保有率是100％，即使在40代甚至是50代
的时候，质粒保有率仍高达98％，表明重组质粒可
以被稳定保留。琼脂糖凝胶电泳分析各代次质粒
也未发现丢失(图2)。
1-6分别为不同代次(O、10、20、30、40和50)质粒
图2不同代次工程菌的质粒琼脂糖电泳
Fig．2Agarosegeleleetrophoresisofplasmid
ofdifferentg nerations
2．3质粒鉴定
工程菌在传代50代时仍带有重组质粒，说明
重组质粒稳定存在于工程菌中，但此结果不能说明
目的基因是否发生丢失，需要进一步分析基因及相
应表达蛋白的稳定性。对各代次菌种的质粒进行
酶切图谱鉴定以及测序。质粒用限制性内切酶
NdeI和Xhol双酶切后，电泳分析，在600bp处和
3586bp处可见目的基因片断及载体片断，与原代
质粒相符(图3)，同时测序结果表明，各代次质粒的
目的基因片断碱基序列与原构建质粒完全相同，没
有碱基发生突变或丢失(由南京金思特科技有限公
司提供测序)，表明经传代后的工程菌仍然保留目
的基因片断，并可稳定携带外源基因至50代次人
工传代。
1—6分别为不同代次(O、lO、20、30、40和50)质粒酶切结果
图3不同代次工程茵质粒双酶切琼脂糖电泳
Fig．3Agarosegelelectrophoresisofrestrictionenzyme
digestionofplasmidofdifferentg nerations
2．4工程茵的表达
原代菌种发酵表达后菌种的超声沉淀与上清
液分别进行SDS-PAGE，考察目的蛋白的表达形式。
结果表明，目的蛋白相对分子质量为2．0×104，重
组蛋白绝大部分存在于沉淀中，上清液中几乎没有
重组蛋白，而在不含质粒的宿主菌中不表达重组蛋
白(图4)。说明重组蛋白在胞内以包涵体形式表
达，而且宿主菌并无内源性表达重组蛋白。
进一步分析各代次菌种的表达情况，结果表明
重组蛋白表达至10代都呈稳定状态，在20代时有
显著下降，30代以后无表达(图5)。
由于rhEndostatin对宿主菌来说是一种异源蛋
白，可能会干扰宿主菌正常的基因表达，或破坏细
胞的完整性n2“”，影响宿主菌的活性，从而传代10
代后，目的蛋白表达量下降。推测工程菌在连续传
万方数据
2008年11月 陈罗胜等：重组人内皮抑素工程菌菌种稳定性考察 。61·
1一沉淀；2一}清液；3一大肠杆菌B121(DE3)
图4菌体超声后不同组分的电泳结果
Fig．4SDS·PAGEanalysisoftargetproteinfrom
differentcomponent
1-6分别为不同代次(0、lO、20、30、40和50)目的蛋白表达量
图5不同代次工程菌的目的蛋白表达量分析
Fig．5SDS—PAGEanalysisoftargetprotein
fromdifferentg erations
代的过程中，菌体内环境发生了变化导致其自身代
谢发生改变，使得更多的营养和能量用于自身的生
长繁殖，而不是表达外源蛋白。同时，几乎没有一
种高效表达蛋白是特别稳定的，重组蛋白分泌增加
时会导致宿主菌的蛋白酶大量释放，造成目的蛋白
的降解量增加，影响目的蛋白的产量¨4l。
2．5重组人内皮抑素活性测定
加代菌种发酵的菌体，经处理复性后得到rhEn．
dostatin，利用mrr法检测其对内皮细胞ECV-304的抑
制作用。从质量浓度为5tw,／mL时起，rhEndostafin的
抑制率明显高于恩度(Endostatin)，而且随着浓度的提
高呈现出明显的量效关系(表1)。说明在加代表达
的目的蛋白仍具有明显的抑制内皮细胞增殖的生物活
性，本rhEndostatin具有研发意义。
表1 rhEndostatin对ECV-304的抑制作用
TableInhibitionratefrhEndostatinonECV一304
‘尸<0．05
2．6工程茵菌种反复冻融实验
实验表明，工程菌在反复冻融11次的过程中
rhEndostatin表达稳定，表达量无明显降低，定量分
析知，在菌体超声的沉淀中目标蛋白质量分数为
(58．754-3．78)％(图6)。说明菌种在反复冻融后
表达能力仍然稳定，适合建立种子库保存。
l—EcoliBL21(DE3)；2一12分别为工程菌冻融
l—11次后目的蛋白表达量
图6工程菌菌种反复冻融后目的蛋白
表达量电泳分析
Fig．6SDS．PAGEanalysisofthexpressionof
rhEndostafinbyEcdiafterh屯ezethawing
3结论
本重组工程菌在传代过程中质粒未明显发生
丢失，sT稳定性达98％，也未发现有质粒结构不稳
定，并保持原代菌种的Amp抗性，其产物具有高效
的抑制内皮细胞增殖的生物活性，在质量浓度20
I．Lg／mL时抑制率达到(94．72±2．10)％。菌种在反
复冻融后表达能力仍然稳定在(58．75±3．78)％。
万方数据
·62· 生物加工过程 第6卷第6期
菌种连续传代50代质粒稳定，但是20代后目
的蛋白表达并不稳定，可能质粒稳定性和外源蛋白
表达稳定性是相分离的，而且目前对此的研究数据
鲜有发现，以后将对质粒稳定性和外源蛋白表达稳
定性的关系进行重点研究。为避免菌种在传代的
过程中表达活性下降，目前通过建立种子库来保留
原始菌种，从而保留其高表达的活性。由于工业生
产时，大肠杆菌具有生长周期短的特点，一个生产
周期远小于10代的人工传代时间，目的蛋白的表
达量并不会发生明显的下降，而且其抑制内皮细胞
增殖的生物活性并无改变。
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