全 文 ：单克隆抗体技术在小麦贮藏蛋白研究
及其遗传改良中的应用进展
李建国 李巧云 郝春燕 蔡民华* 晏月明*
(首都师范大学生命科学学院,北京 100037)
摘 要: 近 20 年来,人们制备了许多小麦种子贮藏蛋白的单克隆抗体( Monoclonal Antibody, McAb) ,一方
面作为有效工具研究胚乳贮藏蛋白(主要是麦谷蛋白聚集体、特定的谷蛋白亚基及醇溶蛋白)的结构与功能关系;
另一方面用作诊断试剂( diagno st ic too ls) , 为筛选具有合适加工品质的小麦品种提供依据。本文综述了国内外单
克隆抗体技术在小麦贮藏蛋白研究及其遗传改良中的应用进展, 并展望其应用前景。
关键词: 小麦 单克隆抗体 贮藏蛋白 ELISA ( Enzyme linked immunoso rbent assay)
Application of Monoclonal Antibody Technology in the Studies of
Wheat Endosperm Storage Proteins and Genetic Improvement
Li Jianguo Li Q iaoyun Hao Chunyan Cai Minhua Yan Yuem ing
( Col le ge of L i f e S ci ence , Cap ital N ormal Univ ersi t y , B eij in g 100037)
Abstract: Dozens o f Monoclona l Antibodies have been prepared t o wheat stor age pro teins in r ecent tw enty
years. Monoclona l Ant ibodies raised to w heat sto rag e pr oteins appear t o be pow erful t ool in the studies o f the r ela-
tionship betw een st ruct ur e and function o f w heat endo sperm stor age proteins ( mainly wheat glut en po lymer, specific
gluten subunits and gliadins) . On the o ther hand, lots o f Monoclona l Antibodies can be used as diagno st ic too ls to
determ ine the content o f specific proteins in seed and flour using enzyme- linked immunosorbent assay ( EL ISA ) .
This ar ticle has rev iewed recent pr og ress in the application of monoclona l antibody techno lo gy in the studies o f w heat
endosperm stor age pro teins and genet ic br eeding . T he pro spect of its applicat ion in these studies is also discussed.
Key words: Wheat Monoclonal antibody Sto rag e pr oteins ELISA
小麦胚乳贮藏蛋白是小麦烘烤品质的主要决定
因素,成熟种子贮藏蛋白由麦谷蛋白( Glutenins)和
麦醇溶蛋白( Gliadins)组成,其中麦谷蛋白决定小麦
面团的粘弹性, 醇溶蛋白决定面团的延展性。面团
的粘弹性和延展性决定了其终产品的加工品质 [ 1]。
这两种蛋白及其与品质的关系一直是各国谷物化学
和小麦育种领域的热门课题。目前应用于小麦胚乳
贮藏蛋白研究的主要方法有电泳法、高效液相色谱
法、流变学特性测定及沉淀值测定等方法。这些方
法各具优势,但不足之处都在于操作费时,难以在短
时间内测定大量样品以及快速鉴定小麦品质, 无法
满足育种过程中早代或单株大量测定的需要。
在小麦胚乳贮藏蛋白研究及新品种选育、品质
鉴定和面粉加工工业中,迫切需要如下技术:贮藏蛋
白基因克隆的特异性探针,以避开常规基因克隆鉴
定所需的繁琐步骤; 快速鉴定小麦贮藏蛋白的简便
方法,为贮藏蛋白的进一步研究提供方便。杂交瘤
细胞制备单克隆抗体技术的创立 [ 2]为贮藏蛋白研究
开辟了新思路,为人们提供了制备贮藏蛋白特异探
针的有效方法。单克隆抗体是单个淋巴细胞克隆受
抗原刺激后产生的结构和功能均一的抗体,具有很
高的特异性、敏感性和亲和性,能识别、定位和纯化
收稿日期: 2005-06-21
基金项目:国家转基因植物研究与产业化开发专项( JY03-A-13-02)
作者简介:李建国( 1980- ) ,男,在读硕士研究生,方向:数量遗传学。Email: jglee@ 126. com
* 通讯作者:蔡民华( 1953- ) ,男,副教授,硕士生导师,主要从事分子数量遗传学研究
* 通讯作者:晏月明( 1960- ) ,男,教授,博士生导师,主要从事小麦分子遗传学与蛋白质组学研究。E-mail: yanym2004@ 163. com
生物技术通报
# 技术与方法# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
其相应的抗原, 在适当的条件下, 还能使抗原失去作
用。单克隆抗体技术自问世以来受到越来越多的重
视,并被广泛应用于医学及生命科学研究。20世纪
80年代中期开始应用于小麦胚乳贮藏蛋白研究及小
麦品质改良。
1 单克隆抗体技术在贮藏蛋白研究中的应
用
在过去的 20年中,国内外学者从染色体组间关
系和目的基因筛选、蛋白质免疫同源性研究、蛋白质
发生及其定位、蛋白质结构及其相互作用等方面应
用单克隆抗体相关免疫学方法对小麦胚乳贮藏蛋白
进行了研究,取得一系列成果。
1. 1 目的基因筛选和基因组特异性关系研究
从 DNA 文库中筛选和克隆目的基因是重组
DNA 技术的关键步骤,目前筛选分离目的基因的常
用方法有核酸探针、表型筛选和免疫筛选等。核酸
探针法是用标记的特定 DNA 或 RNA 顺序, 依据分
子杂交原理检测相应的互补顺序, 此法成功与否受
诸多因素的影响, 如探针的长度、作用液离子浓度、
碱基对配位以及 RNA 和 DNA 形成稳定杂种的程
度等,而且该方法需用放射性同位素标记, 如果用光
敏生物素标记核酸探针, 其灵敏度虽较高, 但结果有
较高的假阳性并易受多种因素的影响。表型筛选法
借助于放射性标记或插入标记载体鉴定转染的
cDNA所表达的 DNA 编码表型。当多个不同供体
DNA 顺序以逆转录病毒载体或转位 P 因子转染并
整合入宿主细胞基因组时,常发生多重插入物,这样
便可从标记序列辨认出表型的基因产物, 从而为筛
选提供方便,但有时也会分离出一些不正确的基因。
该方法往往要进行一系列重复转染和反复选择, 淘
汰不正确的 DNA 顺序以得到决定表达表型的 DNA
顺序。免疫筛选法用抗体作探针识别和分离编码决
定簇的 DNA 顺序, 能最大限度地检测任何种类
DNA 表达的多肽抗原决定簇。单克隆抗体能识别
单个特异抗原决定簇, 可以用多个不同特异性单克
隆抗体识别蛋白质全长的抗原决定簇以减少假阳
性。Donovan [ 3]用 9个单克隆抗体筛选不同小麦胚
乳贮藏蛋白 cDNA 表达文库,每一个单克隆抗体都
能筛选至少一个阳性 cDNA 克隆。用单克隆抗体筛
选小麦 cDNA 表达文库以鉴定、筛选表达不同小麦
多肽的 cDNA 克隆, 省去了许多常规克隆鉴定方法
所需的繁琐步骤。王汉潜等[ 4] 用高分子量谷蛋白亚
基( high mo lecular w eight g luten subunits, HMW-
GS) 1Bx14+ 1By15混合抗原免疫小鼠, 获得一株稳
定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。用此细胞系分
泌的单克隆抗体作探针, 对小麦胚乳发育时期 cD-
NA 表达文库进行筛选, 可排除其他基因的干扰, 准
确、高效地分离和克隆 HMW-GS编码基因。
小麦胚乳贮藏蛋白表现高度多态性, 可作为遗
传标记,以胚乳贮藏蛋白为抗原制备的单克隆抗体
在分类学和基因组特异性关系研究中具有重要意
义。Knox 等[ 5]以小麦 1BS 染色体编码的醇溶蛋白
为抗原制备的单克隆抗体可在杂交后代中识别 1BS
染色体,因此该单克隆抗体可作为 1BS染色体的标
记。Skerrit t[ 6] 对各染色体组醇溶蛋白基因间的连
锁关系进行研究时发现, 某一染色体对被同源的染
色体对替换后并不影响某些特异性抗体的结合, 表
明不同染色体编码的醇溶蛋白中可能存在相同或相
近的抗原决定簇。另外, 由于贮藏蛋白单克隆抗体
的抗原决定簇具有特异的染色体组起源, 通过对某
个基因产物的免疫学测定可以确定其表达的拷贝
数。还可以通过对关系较远的染色体组基因进行免
疫学测定, 获得有关贮藏蛋白基因表达调控方面的
信息,从而有目的地控制有关品质基因的表达。
1. 2 贮藏蛋白同源性研究
小麦的不同品种间以及小麦与不同禾谷类作物
间,各种籽粒贮藏蛋白具有较高程度的同源性,同源
程度可通过遗传方法或相关性比较进行研究, 也可
进行各蛋白质氨基酸序列比较 [ 7]。利用单克隆抗体
可以研究同一小麦品种的谷蛋白间、醇溶蛋白间、醇
溶蛋白与谷蛋白间的结构同源性; 也可以研究不同
禾谷类作物间籽粒贮藏蛋白(包括同一组分或不同
组分间)的同源性。Skerrit t等 [ 7]利用单克隆抗体分
别通过免疫印迹法、直接和间接酶联免疫吸附法以
及放射免疫测定法研究了不同小麦贮藏蛋白的同源
性。Daw ood等[ 8] 利用不同的小麦醇溶蛋白组分制
备了单克隆抗体,其中抗醇溶蛋白 C-45单克隆抗体
只与抗原蛋白具有极高的特异性反应, 而与其它蛋
白无特异反应, 由于 1BL/ 1RS易位系的小麦品种无
醇溶蛋白 C-45,所以利用该抗体可成功地检测含有
52 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
1BL/ 1RS易位系的小麦品种。还有学者利用不同
的抗体研究了不同禾谷类作物不同贮藏蛋白质间的
同源性,发现小麦、玉米、水稻、黑麦、硬粒小麦、大麦
及燕麦之间的醇溶蛋白具有一定的同源性。其中小
麦与黑麦、大麦和硬粒小麦的同源性较高, 而与其它
禾谷类作物的同源性较低。Bret t 等[ 9] 建立了一系
列小麦贮藏蛋白的单克隆抗体探针文库, 用于研究
胚乳蛋白的结构和功能及其与品质的关系。其中有
两个抗体能高度识别贮藏蛋白的 PQQPFPQQ 序
列,可用于判别不同物种、不同基因型的不同贮藏蛋
白间的同源性。
单克隆抗体技术在测定蛋白质同源性方面的优
势在于能多层次准确比较蛋白质结构: 抗原抗体反
应的极高特异性使诱导抗体的抗原与被测抗原不仅
一二级结构相同,而且三级结构也完全一致, 而序列
比较法则无法区别蛋白质的三级结构。
1. 3 贮藏蛋白发生及其定位研究
特异性单克隆抗体可用于研究面筋蛋白在胚乳
发育过程中的运输、折叠、分选和组装。Stenr am
等[ 10]借助单克隆和多克隆抗体对籽粒形成期小麦籽
粒的胚乳组织进行了免疫细胞化学研究, 在超显微
结构水平上检测醇溶蛋白和谷蛋白并对其进行定
位。单克隆抗体还成功应用于跟踪小麦贮藏蛋白的
积累过程, Skerrit t [ 11]用几种不同特异性的单克隆抗
体研究了各种蛋白在积累时间上的区别, 发现其积
累模式因受环境所胁迫(如硫缺乏)而改变。Chris-
t iana 等 [ 12] 用小麦醇溶谷蛋白( prolamin)制备单克
隆抗体,从免疫印迹发现此单克隆抗体能与 C-黑麦
碱发生特异性反应, 从高尔基体( Golg i apparatus)输
出的液泡也能被此抗体特异性标记,而其它细胞器,
如线粒体、脂质体和淀粉粒却未被标记,这一发现支
持如下假说: C-黑麦碱从其合成位置 (糙面内质网)
到其储存位置(蛋白体)的转运过程要经过高尔基
体。
1. 4 贮藏蛋白结构及其相互作用研究
Megan等 [ 13]用单克隆抗体探针对麦醇溶蛋白、
低分子量麦谷蛋白、高分子量麦谷蛋白进行免疫细
胞化学定位( Immunocy tochemical Localizat ion) , 然
后用透射电镜 ( t ransmission electr on m icroscopy,
TEM )研究麦谷蛋白多聚体大分子的结构组织形
式, 发现 HMW-GS 聚合体构成多聚体的主链,
LMW-GS 聚合体组成多聚体的侧链,而麦醇溶蛋白
则填充多聚体的空隙。由于面团强度及烘烤特性主
要由谷蛋白亚基组成及其含量决定, 谷蛋白亚基的
构成变化对面粉特性的影响可以利用一些遗传变异
体进行研究。Skerrit t等 [ 14]对特定谷蛋白亚基进行
了定量研究, 一系列小麦品种实验证明: 抗原-抗体
反应的吸附值与谷蛋白聚合体或谷蛋白亚基的数量
及面团强度都呈显著正相关, 但相关程度因抗体而
异。对一系列缺少某些高低分子量谷蛋白亚基品系
的研究发现:如果某单克隆抗体与 D-染色体组高分
子量谷蛋白特异结合, 则其与两者的相关性较好。
作为抗原的蛋白质之间的相互作用能改变抗体的抗
原识别位点, 因此蛋白质构型的变化和蛋白质之间
的相互作用都能影响抗体与抗原的结合, 用多肽制
备单克隆抗体, 可以确定蛋白质的相互作用区域。
2 单克隆抗体技术在小麦品质评价及遗传
改良中的应用
2. 1 品质评价
小麦的加工品质与麦谷蛋白聚合体在小麦中的
含量以及特定 HMW-GS的有无密切相关。Skerrit t
等[ 15]运用 ELISA 进行面团强度预测和品质研究,他
们选择了与特定 HMW-GS 结合的单克隆抗体进行
夹心 ELISA 试验,测得的光吸收值与用流变学方法
测定的面团强度成正比。Skerr it t 和 Robson 研
究[ 16]发现这个单克隆抗体的 HMW-GS识别表位在
HMW-GS中央重复结构域中跨过临近的九肽和六
肽序列,位于可形成 B-反向转角的二级结构中, 而且
Glu-D1位点上的 5+ 10 亚基等与较强的面筋强度
密切相关的亚基具有更多这样的表位序列,这也验
证了上述假设的正确性。这种夹心 ELISA 的不足
在于实验时要对样品进行约 4 万倍的稀释, An-
drew s
[ 17] 改进了这种 ELISA 方法, 使之对样品要求
稀释的浓度降为 200~ 600倍。
单克隆抗体技术可以快速鉴别小麦-黑麦易位
品系。最常见的小麦-黑麦易位系是 1BL/ 1RS 易位
系。1RS 携带小麦条锈病的抗性基因 Yr9和白粉病
的抗性基因 Pm8, 而且丰产性较好,因此一度被广泛
用作抗源或丰产亲本, 使得许多地区小麦推广品种
携带此易位染色体。然而 1RS 还携带黑麦碱( Seca-
532005年第 6期 李建国等: 单克隆抗体技术在小麦贮藏蛋白研究及其遗传改良中的应用进展
l in)基因,黑麦碱是一种亲水性很高的蛋白, 它大量
吸水后又会很快溶解,使得面团的结构遭到破坏,导
致面团稳定性和延展性降低, 烘烤和蒸煮加工品质
下降。我国目前有 50%~ 70%的小麦推广品种带有
1BL/ 1RS易位系,这些小麦品种迫切需要改良以提
高加工品质。由于 1BL/ 1RS易位系小麦的 1B 染色
体的断臂被黑麦的 1R染色体的短臂取代,所以 1BS
上 Gl-i 1B位点编码的 C-醇溶蛋白 45或 C-醇溶蛋白
42在 1BL/ 1RS 易位系中不会存在。Howes等[ 18]以
C-醇溶蛋白 45为抗原制备单克隆抗体, 筛选出了可
以识别C-醇溶蛋白 45或 C-醇溶蛋白 42而不识别C-
黑麦碱的单克隆抗体 P24B, 采用间接 ELISA 法检
测少量 样 品 即 可鉴 定 1BL/ 1RS 易位 品 系。
Gr aybosch 等[ 19] 采用相反的策略,制备了与 X-黑麦
碱亲和力很高而与小麦醇溶蛋白交叉反应性较低的
单克隆抗体, 运用间接 ELISA 鉴别 1BL/ 1RS 易位
和 1AL/ 1RS 易位品系同样可以获得满意结果。
Andrews等 [ 17] 制备了仅识别相对分子质量( Mr )为
40 000的 C-黑麦碱的单克隆抗体 808/ 10和识别 1B
染色体短臂编码醇溶蛋白的单克隆抗体 218/ 17。利
用这两种高度特异性的单克隆抗体, 采用直接
ELISA 法可以同时鉴定 1BL/ 1RS、1AL/ RS、1DL/
1RS 以及没有发生易位的小麦品种。这种方法步骤
简便,可同时检测很多样品, 因此具有很高的的实用
价值。
单克隆抗体技术还可用于区分具有优良烘烤品
质麦谷蛋白亚基和具有劣质烘烤品质谷蛋白亚基的
小麦品系。含 1Dx5+ 1Dy10 亚基组合的小麦品种
具有优质烘烤品质, 而具有 1Dx2+ 1Dy12亚基组合
的小麦品种烘烤品质较差 [ 17]。Thomas等 [ 20]制备的
单克隆抗体 mAb110622在 ELISA 中与 HMW-GS2
比与 HMW-GS5反应有更高的吸收值, 在免疫印迹
中 mAb110622 与 HMW-GS2 具有较强的反应性,
以此单克隆抗体设计了一种 ELISA 方法用于区分
含 1Dx5+ 1Dy10 和含 1Dx2+ 1Dy12 的小麦品系,
这种 ELISA 不受品系中其它 HMW-GS 变化的影
响。C-醇溶蛋白 45可作为硬粒小麦优良烘烤品质
的一个可靠标记,而 C-醇溶蛋白 42则可作为劣质烘
烤品质的标记 [ 21]。Howes等 [ 18]制备了特异性识别
C-醇溶蛋白 45的单克隆抗体, ELISA 法可鉴定硬粒
小麦品质的优劣, 用类似的方法还可检测出硬粒小
麦中掺杂的普通小麦。
免疫化学方法有望成为品质测定的标准方法,
因为在众多反映蛋白质含量及其高低分子量亚基的
比例、醇溶蛋白含量等测定法中, 免疫化学方法最为
经济、快速而且易于操作。同时, 与其它方法相比,
该方法反映品质性状的可信程度并不低。单克隆抗
体技术操作简单,能快速而有效地测定大量样品,所
以,可用于植物育种的后代选择。另外,由于抗体测
定法只需对单粒种子测定,从而可以大大减轻育种
工作者的劳动强度。
2. 2 品质遗传改良
小麦面粉的烘烤品质不仅与贮藏蛋白的含量相
关,还与贮藏蛋白的种类有关。测定蛋白质品质需
要价格昂贵的仪器如粉质仪、拉伸仪、和面仪及高效
液相色谱仪等, 这些仪器难以推广普及。而且用上
述仪器进行分析时需要较大的样品量, 这在育种的
早代难以实现, 不利于及早确定组合, 虽然沉淀值
法、凯氏定氮法等方法较为经济, 但其效率却很低,
一般每天只能处理 30个左右的样品,难以满足育种
的需要。如果能筛选一种或几种能较好地检测面粉
品质的特异性抗体代替仪器分析或作为其补充, 则
既可以节约大量的人力物力, 又可以在育种的早代
进行测定,以便及早地集中精力于少数组合, 从而提
高育种效率。Skerrit t等 [ 22]利用四种不同特异性单
克隆抗体研究了吸附值与面粉品质参数之间的相关
关系。这些品质参数包括蛋白质含量、和面图中的
面团形成时间( DT)、粉质图中的形成时间、面团塌
陷度( DB)、吸水量( WA )、拉伸图中的面团延展性
( E)、5分钟拉伸阻力( R5)、最大拉伸阻力( Rmax )以
及面包体积等。宋希云等 [ 23] 利用普通小麦 Gabo 和
京 411 制备了 1DY10 的三种类型单克隆抗体, 其
中,特异型抗体不仅可用于区分同型亚基 1Dx2+
1Dy12和 1Dx5+ 1Dy10, 而且还可用于检测转育小
麦中是否含有 1Dx5+ 1Dy10 亚基。由于这种方法
只需对单粒种子测定,因而最为经济、快速而且易于
操作,从而能够满足早代选择的需要。
此外,单克隆抗体方法还可用于食品中谷蛋白
含量的测定。乳糜泄( coeliac disease, CD)是由跟
HLA-DQ2/-DQ8分子结合的谷蛋白肽段诱发 T 细
54 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
胞炎症反应导致的。Sker ritt [ 24] 设计了一种检测各
种麦类作物食品中谷蛋白含量的简便方法,可为乳
糜泄病人日常饮食提供指导。Spaeni-j Dekking [ 25]最
近发现,醇溶蛋白中的某些肽段也能导致乳糜泄,并
设计了相应方法检测食品中的这些醇溶蛋白。
3 单克隆抗体技术在小麦蛋白质组学研究
中的应用展望
双向电泳和质谱分析是目前蛋白质组学研究中
最常用的技术, 双向电泳能同时分离和展示数千种
蛋白,质谱则可以对蛋白进行高效鉴定,二者联用可
以高通量鉴定蛋白质。然而目前双向电泳存在时间
长、费用昂贵、重复性不高、低丰度蛋白点难以检测、
极酸和极碱区蛋白以及高分子量蛋白和膜蛋白分离
难度大等不足, 在一定程度上限制了它的应用。单
克隆抗体能够特异性识别抗原并鉴定蛋白质的性
质、跟踪蛋白质的动态变化, 在蛋白质组学研究中显
示了较强的生命力。随着小麦蛋白质组研究的不断
深入,对单克隆抗体的需求必将大量增加, 但是目前
针对小麦蛋白的单克隆抗体种类有限, 将制约其在
小麦蛋白质组研究中的应用。近年来噬菌体抗体库
构建和高通量筛选能力的发展为实现大规模制备抗
体提供了条件。如果将双向电泳技术高通量获得抗
原和噬菌体抗体库技术高通量获得抗体相结合, 就
可获得大量抗原抗体对, 利用质谱技术对抗原的性
质进行鉴定,即可获得大量抗原抗体信息, 具有良好
的应用前景。Liu等 [ 26]将一株乳腺癌细胞与正常乳
腺细胞提取物双向电泳后,将过度表达的蛋白以每
个点约 1~ 10ng 的抗原量转移到 PVDF 膜,然后与
抗体库孵育筛选特异性抗体, 并用质谱对抗原进行
鉴定,获得了 12个过度表达的抗原并筛选到了相应
的单克隆抗体。然而, 双向电泳技术和噬菌体抗体
库技术在小麦蛋白质组学研究中的结合应用迄今尚
未见报道。
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声 明
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