全 文 ： 技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
MSAP技术及其在植物上的应用
王子成 李忠爱 李锁平
(河南大学农业生物技术研究所,开封 475001)
摘 要: DNA甲基化在植物的很多生命过程中具有重要作用, 检测 DNA甲基化的技术应运而生。依据对
DNA甲基化敏感程度不同的同裂酶, 在 AFLP技术的基础上发展而来的 MSAP技术可以方便的检测全基因组范围
内胞嘧啶甲基化模式及程度。该文对 MSAP技术的原理、特点、基本程序及应用进行了阐述。
关键词: DNA甲基化 M SAP
The Technology ofMSAP and Its Applications in Plant
W ang Zicheng Li Zhonga i L i Suoping
( Ins titute of Ag ricultural B io techno logy, H enan Un iver sity, K aifeng 475001)
Abstrac:t DNA m ethylation has essentia l ro les in many p lant life processes. The techno logy tom easureDNA m ethyl
a tion has em erged as the tim es required. Reckoning on the d ifferen t sensitiv ity o f the iso sch izom ers to DNA m ethy lation and
basing on the AFLP technology, M SAP ( m ethy lationsensitive amp lified polym orph ism ) can be used to test pattern and de
g ree o f the genom ic DNA cytosine m ethy lation. The paper had reviewed the pr incip le, cha racter, procedure and the applica
tion ofM SAP techno logy.
Key words: DNA M ethy la tion M SAP
作者简介:王子成 ( 1974) ,男,博士,副教授,研究方向;植物生物技术与遗传
DNA甲基化是最早发现的 DNA修饰途径之
一,可能存在于所有高等生物中。而 5胞嘧啶甲基
化是真核生物 DNA甲基化的主要形式。DNA甲基
化在植物和哺乳类动物的生命过程中具有两个重要
的功能 [ 1] ,一是防卫功能, 保护基因组免受外来插
入序列的危害,维护基因组的稳定;二是调节基因的
表达, 在发育过程中发挥重要的调控作用。由于
DNA甲基化的重要性, 近年来其研究受到重视, 成
为遗传学研究中的热门领域。研究人员发展了很多
检测 DNA甲基化的方法,在此我们介绍一种比较常
用的检测 DNA甲基化的技术 MSAP ( methy la
t ionsensitive amp lified polymorph ism, DNA甲基化敏
感扩增多态性 )。
1 M SAP技术的原理。
该技术由 Reynalpez等于 1997年首次报道,
并被用于检测二形真菌的 DNA甲基化 [ 2 ] ,之后被用
于检测水稻基因组胞嘧啶甲基化 [ 3] , 目前该技术已
在油棕,苹果, 草莓,棉花,拟南芥, 香蕉,土豆等植物
上得到成功应用。
MSAP技术是在 AFLP技术的基础上建立起来
的。其独特之处是利用两个对 DNA甲基化敏感程
度不同的同裂酶,分别与一个对 DNA甲基化不敏感
的稀切酶如 E coR一起对基因组 DNA进行双酶
切,然后再接上相应的限制性内切酶的接头,利用接
头序列设计引物进行常规 AFLP分析。由于所采用
的限制性内切酶对 DNA甲基化敏感性不同, 因而相
同序列就可扩增出不同的带型,以此判断 DNA甲基
化的程度。最常用的一对同裂酶为 H pa和 M sp
,这两个酶识别相同的酶切位点 CCGG (真核生物
中主要的甲基化位点 ) ,但对甲基化敏感程度不同,
Hpa对于 DNA两条链上的该位点内外侧胞嘧啶
均甲基化及任一个胞嘧啶甲基化都不能酶切, 即不
能酶切含 mCCGG, Cm CGG和m CmCGG的位点, 但它
可以识别仅一条链上胞嘧啶甲基化的位点。而M sp
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
可以识别 DNA单链或双链上该位点内侧甲基化
的胞嘧啶, 但不识别外侧甲基化胞嘧啶, 即不能酶
切m CCGG的位点。所以同一来源的 DNA基因组经
MSAP技术分析后, 如果在 Hpa酶切扩增产物中
有带, 而在M sp酶切扩增产物中没有出现带, 则说
明该位点发生了单链外侧的胞嘧啶甲基化, 即 hm
CCGG,如果 Hpa酶切扩增产物中无带, 但在 M sp
酶切扩增产物中有带, 则说明该位点发生了双链
CCGG位点的内侧胞嘧啶甲基化, 即 CmCGG。两者
扩增产物中共有的带,说明该位点未发生甲基化。
由于 Hpa 和 M sp 两种酶的 特点, 对
于m Cm CGG或mCCGG,两种酶都是敏感的,即都不能
酶切, 都无带显示, 因而无法检测出来。而对于非
CCGG位点的胞嘧啶甲基化,这两种酶都不敏感,因
此, M SAP技术也无能为力, 这是 MSAP技术的局限
性。
2 M SAP基本程序
提取高质量基因组 DNA, 分别用 E coR /H pa
, EcoR /M sp两种酶组合对基因组 DNA进行
双酶切,并连上相应的限制性内切酶的接头,然后以
接头序列设计的预扩增引物,进行 PCR扩增。扩增
产物稀释后,再加入带有选择性碱基的引物,进行第
二次 PCR扩增, 扩增产物变性后在 6%的序列胶上
跑电泳,最后采用银染或同位素放射自显影方法处
理序列胶,统计和分析 DNA条带。
3 M SAP的应用
MSAP技术相对其它测定 DNA甲基化程度的
技术有如下优点:
( 1)不需知道被测 DNA的序列信息, 在不同生
物上具有通用性,可用于 DNA序列背景知识未知的
生物。 ( 2)操作相对简便,在 AFLP技术体系的基础
无需改进, 即可操作。 ( 3)可在全基因组范围检测
CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化。
正是因为 MSAP技术的这些优点, 使其在很多
研究领域都得到应用。目前该技术已用于如下研究
领域: ( 1)检测遗传多样性。在一些植物上,不同品
种之间的差异是由于 DNA甲基化程度不同而造成
的。运用其它分子标记无法将其区别开来, 而采用
MSAP可对这些基因组 DNA甲基化程度不同的品
种进行鉴定,如洪柳等 [ 4]就运用该技术对一些难以
区别的脐橙品种进行了鉴定。 ( 2)研究发现在一些
逆境条件下可以导致 DNA甲基化发生变化, MSAP
技术可用于研究这种 DNA甲基化水平的变化, 如
H ao et al
[ 5]用此方法检测到超低温保存后再生的苹
果和草莓发生了 DNA脱甲基化。最近华扬等应用
该技术还分离到了水稻冷胁迫诱导的 DNA甲基化
差异片段,并找到该片段的 cDNA [ 6] , 用于逆境有关
基因的分离。 ( 3)近年发现 DNA甲基化的变化是
产生体细胞无性系变异的原因之一, 因此, M SAP技
术还被运用于检测那些运用其它技术无法检测的由
于 DNA甲基化变化而导致的体细胞无性系变异, 如
油棕中mantle突变体的分子鉴定 [ 7] , 在香蕉组培
再生苗中用该技术也检测到 DNA甲基化变化 [ 8]
( 4)其它导致 DNA发生甲基化现象的研究。
由于 DNA甲基化参与了很多重要的生命过程,
随着人们对该现象研究的深入,相信 MSAP技术也
会得到更广泛的应用。
参 考 文 献
1 Chan SW, et a.l N at Rev Genet. 2005, 6 ( 5) : 351~ 60.
2 ReynalpezGE, et a.l Mo lGen Gen et, 1997, 253: 703~ 710.
3 Xiong LZ, et a.l M ol Gen Genet, 261: 439~ 446.
4 洪柳,邓秀新.中国农业科学, 2005, 38( 11 ) : 2301~ 2307.
5 H ao Y J, et a.l C ryoletters, 2002, 23: 37~ 46.
6 华扬,等.遗传, 2005, 27( 2) : 595~ 600.
7 TaligotE, et a.l G enom e, 2004, 47: 224~ 228.
8 PerazaE cheverriaS, et a.l Plant Sc,i 2001, 161: 359~ 367.
196