全 文 ：高通量筛选技术及其应用
韩闯 杨盛昌
(厦门大学生命科学学院,厦门 361005)
摘 要: 主要介绍了高通量筛选技术( H TS, High T hroughput Screening )的原理,包括非细胞相筛选、细胞
相筛选和生物表型筛选及其在生命科学和药学领域中的应用以及高通量筛选技术的发展趋势。
关键词: 高通量筛选 非细胞相筛选 细胞相筛选 生物表型筛选
High Throughput Screening Assay and Application
Han Chuang Yang Shengchang
( S chool of L i f e sci ence , X iamen Univ er si t y , X iamen 361005)
Abstract: This r ev iew mainly descr ibes H igh Throughput Screening Assay , including non-cel-l based scr een-
ing , cel-l based screening and animal phenotype scr eening , and the applicat ion o f these technolog ies in the fields o f
life science and pharmaceutics as well as the trend o f development of H TS.
Key words: HT S Non-cel-l based screening Cel-l based scr eening Anima l phenotype screening
最近 10 年间伴随着组合化学( Combinator ial
Chemist ry ) 的长足发展 [ 1] , 使得人们能够在短时间
合成大量化合物,同时分子生物学、分子遗传学和生
物化学的研究如人类基因组计划、蛋白质组学等以
几何级数增加了新的靶分子的数量。然而常规的筛
选方法处理不了如此众多的化合物和靶分子, 因此
高通量筛选技术应运而生[ 2 ]并随着组合化学、微芯
片技术和基因组学的发展而不断发展。目前一个普
通的药学高通量筛选实验室每天筛选的靶分子超过
10万个[ 3] , 而在 1997 年这个数字还不到 3 000。
HTS 可以根据待测样品的种类分为非细胞相筛选、
细胞相筛选、生物表型筛选。
1 非细胞相筛选
1. 1 Microbead-FCM 联合筛选
利用组合化学的方法, 人们可以在极小的固体
支持相上合成分子物质并且化合物种类可以高达数
百万种,然而如何高效地筛选固体支持相上的几个
pmol量的活性分子却是一个极大的难题。过去人
们使用彩色受体或是染色的抗体,用手工的方法逐
个选出目标固相载体。但是, 依据染料强度来决定
活性程度的方法是不准确的, 而且大量的固相载体
不能逐个处理。幸运的是流式细胞仪( FCM , Flow
Cytometry )的发明使得这项工作变的简单而迅捷。
FCM 根据穿过毛细管的细胞荧光强度或类型分离
细胞。由于不同的分子与标记有不同荧光素的受体
或抗体结合,利用和细胞大小相似的 M icrobead作
为固相载体取代细胞通过 FCM, 不同荧光标记的
M icrobead就被分离出来, 于是靶分子或目标分子
就很容易的被分离、纯化。关于这项技术公开的研
究报道最早发表于 1996年, Lanza 等利用这项技术
测定了患有脊髓发育不良综合症( Myelodysplastic
Syndr ome)和急性骨髓源白血病病人体内的各种细
胞因子受体 CR ( GM-CSF/ R: Cw116; ckit / R:
CD117; IL3/ R, G-CSF/ R and FLT3) 表达量的变
化[ 4 ]。同样的, M icrobead-FCM 方法最近还被用于
分析 RNA 蛋白质之间的相互作用 [ 5]。
1. 2 放射免疫性检测
最近几十年来, 放射性同位素法已应用到研究
体内生理生化反应, 各种化合物的结合与分布, 信
号传导通路等实验中。1H, 12C, 31P, 32S, 127 I的放
射性同位素3H, 14 C, 32P, 35S, 125I因为后者几乎有
与前者相同的化学性质所以很容易替换前者并用于
收稿日期: 2004-12-17
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 2期
体内的治疗和检测。
放射免疫性检测( RIA, Radioimmunoassay)的
基本原理是利用标记抗原( Ag * )和非标记抗原( Ag )
对特异性抗体 ( Ab)发生竞争性结合。在反应系统
中,当只有 Ag* 和 Ab 时, 只产生 Ag*-Ab 复合物,
并保持可逆的动态平衡。如反应系统中同时加入
Ag,因 A g 与 Ag* 免疫活性完全相同, 故与 Ab 具有
相同的亲合力。当 Ag* 为一定量、Ab为有限量、Ag
与 Ag* 的量之和超过 Ab 上的有效结合位点时,
Ag*-Ab复合物的生成量与 Ag 的量之间呈一定的
函数关系。即当 Ag 量少时, Ag-A b 生成量少, 而
Ag*-Ab生成量( B)增多, 游离的 A g* ( F )减少, 反
之亦然。可见 Ag*-Ab 复合物生成量是受 Ag 含量
制约的。因此, 在放射免疫分析中, 用已知不同浓度
的标准物和一定量的 Ag * 及限量的 Ab 反应, 采取
一定方法将 B与 F 分开, 即可算出该标准物在各浓
度下 Ag *-A b 复合物的结合百分率 ( B/ T ) [ 6]。然
后, 加入要筛选的目标物在标准曲线上即可查出样
品中是否含有要筛选的目标物及其浓度。RIA 与
EIA 和 IFA 相比有更高的灵敏度, 然而放射性元素
的使用使得 RIA的应用受到较大的限制。
1. 3 荧光检测( FA )
荧光材料在一定条件下每个分子能释放数千个
光子, 使理论上的单一分子水平检测成为可能。这
种特性以及可采用多种荧光模式, 使得荧光检测技
术( FA, Fluorescence A ssay )成为高通量筛选必不
可少的方法 [ 7]。然而, 这个方法也有局限。荧光化
合物不能像放射性同位素那样取代活性抗原的元
素, 它们必须连在抗原的某些连接位点上, 而且这
种修饰不能影响抗原的活性。荧光技术在非细胞相
筛选分析中广为应用。
1. 3. 1 荧光共振能量转移 荧光共振能量转移
( FRET, F luor escence Resonance Energ y Transfer)
是一种用来确定与不同荧光团结合的二个分子间距
离的技术。当供体激发态能量满足光学和空间上的
要求时,其能量就能有效地通过偶极子相互作用转
移给受体。能量转移效率 ( K t )随供体( D)和受体
( A)之间第六能级距离而成相反变化,故分子间小的
空间变化 (几个埃) 能显著影响能量的有效转移
率[ 8]。R0 ( 50% 能量转移效率时 D-A 的距离)与供
体的发射域和受体的吸收域的重叠同时受体的量子
产量还与溶剂有关。通常 R0约为 40~ 50。40约是
分子量为 26 000道尔顿的球蛋白的直径。如果两个
荧光分子相互距离小于 R0 ,当供体的吸收光被发射
的时候, 理论上受体的荧光将会增强。如果其距离
大于 R0 , 当同样的光被发射时, 将会检测到供体的
荧光增强。所以, 如果将荧光分子连接到如蛋白酶
那样可作激酶的小分子酶上,很容易检测酶的活性。
Rodems等用 FRET 实验平台高通量的筛选了酪氨
酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷酸酶的作用底
物[ 9]。
事实上不仅是小分子, 经过变异的 GFP( CFP
和 YFP)也可用于将具有多吸收带和发射带的蛋白
质与 FRET 的耦合。这样, 每个蛋白质可在一个细
胞内用改变过的基因表达, 成为一个整体的蛋白
质。Centonze 等使用 CFP、YFP 融合蛋白研究了
HEK29细胞株Helix- loop-Helix ( bHLH )转录因子
HAND1以及 HAND1点突变的蛋白-蛋白间的相互
作用[ 10] 。
1. 3. 2 与时间相关的荧光 荧光分析的灵敏度常
受来源于试剂和容器等背景信号的限制。为了降低
荧光背景, 人们发明了与时间相关的荧光技术
( TRF, T ime-r esolved Fluorescence)。普通荧光分
子的激发态存在周期通常仅有几微秒, 但是镧系元
素的可达几毫秒。利用脉冲激发光源和门控检测器
(或相调节技术) 可在样品荧光信号采集之前让背
景荧光信号消失。TRF 可与 FRET 联用, Kennedy
等利用 TRF-FRET 技术测定了与早老性痴呆症
( AD)密切相关的 beta-secr etase ( BACE1)蛋白活
性[ 11]。
1. 3. 3 荧光偏振检测 荧光偏振检测( FPA, Fluo-
r escence Po larized Assay)可测定一个由平面偏振光
线激发的分子所发射出水平和垂直平面的光线, 这
两部分光线强度之差除以强度总和即为偏振值( P)。
当溶液的温度和粘度都固定时, P 值主要取决于荧
光子的分子体积。由于荧光偏振光强度与荧光物质
受激发时分子转动速度成反比, 所以小分子物质在
激发状态旋转速度快, P 值较小; 大分子物质在激发
状态中旋转速度较慢, P 值较大。因此, 这种技术可
以用于分析多种分子之间的相互作用如 DNA-蛋
232005年第 2期 韩闯等:高通量筛选技术及其应用
白、蛋白-蛋白、抗原-抗体[ 12] 。Gagne 等在 384孔板
上利用 FP 技术和 BODIPY T MR荧光染料改进了
对与 G蛋白偶联受体相互作用的物质的高通量筛选
方法[ 13] 。
1. 3. 4 荧光相关性光谱 荧光相关性光谱( FCS,
Fluorescence Correlat ion Spect roscopy)是一种通过
监测微区域内分子荧光波动来获取分子动态参数或
微观信息的灵敏的单分子检测技术 [ 14]。Andre Ko-l
termann等将双色荧光相关性光谱( dua-l color FCS)
用于高通量筛选中, 发展了一种新的生物工艺学-
RAPID FCS, 在模拟 HT S 过程中, RAPID FCS 可
以在 1秒中内完成对一个样品的精确分析,在一天
内可以完成 104 ~ 105个样品的分析。RAPID FCS
具有检测速度快, 灵敏性高, 上样量少等特点, 是超
高通量筛选的一种理想工具[ 15] 。
1. 4 闪烁接近检测
闪烁接近检测于 1995 年在美国和日本被提请
专利。由于当固定在固相载体或 96孔圆片上的受
体被放射性标记的材料筛选时, 需要过滤等额外步
骤以定量分析放射性。为简化此步骤, 研究人员发
明了闪烁接近检测 ( SPA, Scint illat ion Prox im ity
Assay )法。在这个方法中, 高产量的荧光分子被附
到带有受体的固体上, 通过放射性配体引起成键反
应。同时,仍存留于溶液中的未成键的放射性配体
被水分子抑制, 而与荧光受体成键的配体的放射线
被其周围的荧光分子吸收。因此, 活性分子仅以荧
光量分析而没有任何额外步骤就被简单的筛选出来
(图 1)。Delle Fratte 等利用高通量闪烁接近检测法
成功地筛选出了转录启示因子 2( TIF2) C区的抑制
物[ 16]。
图 1 SPA原理示意图。
当供体和受体空间距离足够近时,能量转移才会发生。
1. 5 酶连接的免疫吸附检测( ELISA)
ELISA 广泛用作非放射性同位素的实验中。
其基本原理是首先使抗原或抗体结合到某种固相载
体表面(一般为 96孔板) , 并保持其免疫活性; 然后
使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体, 这
种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性, 又保留酶的
活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗
原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表
面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体
上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开, 最后结
合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一
定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变
为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接
相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分
析。目前许多种疾病的诊断,人群流行病学的普查,
活性物质筛选均采取这种方法。
2 细胞相筛选
细胞相筛选在多步信号传递中有筛选大量靶蛋
白的优点,由于含有诸如信号传导、物质代谢等关于
细胞生命活动的信息, 因此可以省去体外筛选中的
许多步骤。高通量细胞相筛选主要涉及到选择性杀
死策略,离子通道检测,报告基因分析。
2. 1 选择性杀死策略
首先确定活体生物(通常是芽殖酵母)的类型并
选出带有癌细胞缺陷的类型,然后寻找仅杀死缺陷
类型的而不伤害正常类型的药物。这种方法目前在
化学生物学领域广泛使用,以寻找能过滤有毒分子
并选择性杀死目标物的分子。
24 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 2期
2. 2 离子通道检测
离子通道是细胞信号传递的基本途径之一, 也
是细胞许多生理活动过程的重要组成部分。于是电
压敏感性 FRET 染料被用来研究多种药物在细胞
内同离子通道的相互作用这对筛选和发现作用于离
子通道药物大有帮助[ 17]。同时这种方法还被用来
检测钙离子浓度、膜电位、pH 值等的变化。
2. 3 报告基因检测
报告基因 ( Reporter Gene)是一种编码可被检
测的蛋白质或酶的基因, 是一个其表达产物非常容
易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节
序列相融合形成嵌合基因, 或与其它目的基因相融
合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达
产物来标定目的基因的表达调控, 筛选得到转化体。
Terstappen 等 [ 18] 利用报 告基因分析技术, 对
mGluR7 的调节子进行了筛选鉴定。Durocher
等[ 19]也利用荧光素酶报告基因技术, 实现了对悬浮
培养的 HEK293 EBN A 细胞中的稳定或暂时表达
的与 G蛋白偶联受体( GPCRs)的高通量筛选。
3 生物表型筛选
伴随着基因组学的发展, 人们建立了线虫、果
蝇、斑马鱼和小鼠等整体动物模型来研究特定的生
理病理学表型和基因突变及表达的关系。因为小鼠
较果蝇与人类更近一些, 因而具有与人类疾病相似
的显型的小鼠变异类型将对医疗应用以及新基因功
能的发现有重要帮助。研究人员通过用化学诱变剂
如 ENU( N-乙基-N-亚硝基脲)等处理雄鼠, 使其精
子细胞产生变异,然后产出变异的后代来研究人类
遗传疾病基因突变的情况[ 20]。然而从显型表现来
在整个基因组中寻找变异基因的过程太麻烦。不过
随着功能基因组学的发展以及最近 RNAi技术的发
明,研究人员可以有目的敲除或屏蔽掉某些未知功
能的基因[ 21] 并通过表型来研究这些基因的功能和
进行药物筛选。
4 前景与展望
高通量筛选技术极大地提高了对目标分子、活
性物质以及前导药物的筛选速度, 当前 HTS 技术
进一步向着高内涵筛选( HCS)技术发展。HCS 技
术是生物学、分析软件、自动化控制以及显微观测技
术最新发展的综合运用, HCS的出现彻底改变了以
细胞为基础的靶目标的确认、二次筛选、前导化合物
优化和结构活性分析的传统方法 [ 22]。随着科技的
发展, HT S/ HCS技术将不断向着微型化、自动化、
高效化、低廉化和微量化方向发展。
参 考 文 献
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