全 文 ：中国新药杂志 2) (X 6年第 1 5卷第 1 7期
.》 , , , , , , , , . 、
l 实验研究 忿、 . . . . ……沪
用甲基唾哇蓝筛选抗铜绿假单胞菌药物方法的建立 `
肖 晶 ’ ,朱永红 , ,李 洋 , , 王 莉 , , 杨 扬 , , 罗 环 , ,崔景荣 ,
(北京大学医学部 1 药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室 , 2 病原生物学系 , 北京 10 008 3)
〔摘要」 目的 :建立适合铜绿假单胞菌的定 t 、 快速 、 体外高通 t 药物筛选方法 。 方法 : 优化甲墓唾吐蓝法检
测活细菌数 t 的实验条件 ,用 M CI 方法与 M ,I’r 法比较 2种已知抗生素的抗菌作用 。 结果 :徽 t 培养对细菌生长无影
响 , 最佳 M ,r 浓度和反应时间分别为 5 m g’ m L一 ’和 l h。 在同一培养时间 , 菌浓度在 l x l o , 一 l x 10 0I c F u · m L 一 ’ 范围
内 , 甲淤的吸收度与菌浓度呈线性相关 。 用 2 种抗生素比较 M CI 方法 与 M rT 法药敏测定的结果 一致 。 结论 : MT T
徽 t 法进行抗铜绿假单胞菌新药筛选操作简便 , 省时省力 , 成本较低 , 结果稳定 , 具有可重 复性 , 适 宜体外高通 t
药物筛选 。
[关健词】 甲墓唾吐蓝法 ; 最低抑菌浓度 ;铜绿假单胞菌 ;高通 t 筛选
[ 中圈分类号 ] R9 65 . l ; R9 7 8 . l [文献标识码 ] A [文章编号 ] l 0() 3 一 3 7 34 ( 2 0() 6 ) 17 一 14 3 一 04
A n e w m e t h o d o f S C r e e n i n g
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,
L u o H u a n
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,
Z D印 a 八二 e n :
P a `h o群 n ic B访 le 盯 , eH a l` h S e记n ce C e n et r , P e k i咭 nU沁 sr i:了 , B e ij n g 10() 0 8 3 , C h in a )
【A b s t r a c t l o bj e e t i v e : T o e s ta b l i s h a h i gh 一 t h or u g h p u t m o d e l fo r s e r e e n i n g e a n d id a t e a g e n t s a -
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.
M e山 o d s : A M竹 m e t h o d w a s s t u d i e d t o o p t im i z e d e t e e t io n o f
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o n a s a e r叮 i n o s a . Th e a n tim ie or b i a l a e t i v i t i e s o f t w o k n o w n a n t ib i -
o ti e s w e er e o m P a er d b y t h e e o n v e n t i o n a l a s s a y a n d t h e M竹 a s s a y . R e s u l tS : T h e m i e r o p r o p a g a ti o n
s h o w e d n o e fe
e ts o n t h e b a e t e ir a l 脚w t h . Th e o p t im a l d e te e t io n e o n d i t i o n w a s t o i n e u b a te th e e u l t u r e s
w i t h M竹 a t t h e e o n e e n tar ti o n o f 5 m g · m L 一 ’ fo r 1 h o u r . I n t h e s a m e g or w t h p h a s e s , t h e l i n e a ir yt o f li v i n g
b a e r e ir a l b i o m a s s w i t h fo mr
a z a n , 5 a b s o r b a n e e w a s fo u n d w i t h i n l 减 10 7 一 1 x 10 1o C F U · m L 一 1
.
In t h e t e s t
fo r a n t im i e r o b ia l a e t iv i t ie s o f ht e t w o k n o w n a n t ib i o t i e s
,
t h e M竹 a s s a y a n d t h e M I C a s s叮 s h o w e d th e
s a m e er s u l t s
.
C o n e l u s i o n : Th e e o s t
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,
er l i a b le a n d er p r o d u e i b l e M竹 m ie or a n a ly s i s m a y b e u s e d
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一
t h r o u g h p u t s e er e n i n g o f d ur g s
·
【K e y w o r d s 〕 M竹 ; M IC ; sP e u do m o n a s a e r u g in o s a ; h i gh 一 t h or u g h p u t s c er e n i n g
铜绿假单胞菌是引起院内感染的首要条件致病
菌 , 近年来在临床上引起 的感染 日益增多 ,该菌对多
种抗菌药物产生耐药性 ,给临床治疗带来极大困难 ,
已成为院内感染监测的重点细菌之一 〔’ 〕。 药 物纸
片琼脂扩 散 法 ( K 一B 试 验 ) 和试管最 低抑 菌 浓度
( MCI )法作为传统的抗生素筛选方法难以适应大规
模新型药物的筛选需要 。
甲基唆噢蓝是一种能接受氢原子的染料 , 化学
名为 3 一 ( 4 , 5 一二甲基唾哇 一 2 ) 一 2 , 5 一二苯基四氮哩嗅盐
( 3
一
( 4
,
5
一
d im e t h y l th iaz
o l
一
2
一
y l )
一
2
,
5
一
d i p h e n y l te r a
一 2 0 11
-
u m br o m记e ) ,简称 M竹 。 活细胞线粒体中的脱氢酶
能使外源性的 M ,r 的四噢环还原 为难 溶性 的蓝紫
色结晶物甲脱 ( of mr az an ) , 而 死细 胞无此 作用 。 用
异丙 醇溶 解此蓝 紫色结 晶物 , 该溶液在 5 7 0 n m 波
长下的 吸 收 度 ( A )值 可 间 接 反 应 活 细 胞 数 量 。
M竹 法 已广泛 应用 于真核细 胞 的活细胞计数 、 生
物因子的活性检测 、抗肿 瘤药物 的大规模筛选 、 细
胞毒性试验等「’ · ’ 〕 。 迄今 , M竹 法在抗铜绿 假单胞
* 基金项 目 : 国家高科技 ( 86 3 ) 发展计划 ( 2 0() 2 A A 2 Z 3 4 3 C )
14 4 3 一
ch in e seJ o u m al of N e wDr u名 52以拓 , v o l · 15 N o · 17
菌药物的高通量筛选方面未见报道 。 本实验室对
现有的 M ,r 法进行改进 , 使其适用于抗铜绿假单
胞菌 药 物 的 高 通 量 药物 筛 选 ( h i g h 一 th r o u g h p u t
s c r e e n i n g
,
H T S )
。
材料与方法
1 材料
1
.
1 , 种 铜绿假单胞菌标准株 p . ae r gu ion as
^ T e e 2 7 8 5 3 (国内编号 10 2 1 1 )购于中国药品生物制
品检 定所 菌种 室 。 铜 绿假单 胞菌 临床耐 药株
p
.
ae r gu in os
。 犯 2 是从患者临床标本中采集的多重
耐药株 , 且产生绿色色素 。
1
.
2 试荆 M H 培养基为美国临床标准化委员会
( N CC L )推荐产品 ,购 自 OX O ID LT D ,批号为 3 0 16 5一。
M竹 : iB om ol 1565 5 , 华美生物工程公 司分装 ,配制成
10 m g
·
m L
一 ’ , 4 ℃储存备用 。 环丙沙星 : 购自北京天
坛生物制品公司 , 批号为 304 51 一 0 3 0 2 。 泰能 : 杭州
默沙东制药有限公司进 口分装 ,批号为 lP l 7 2 。
1
.
3 仪器 6 8 0 酶标仪购自 B i o R a d 公司 M o d e l 6 8 0
型 ;酶标微孔板 为美 国 C os t er 公司生产 ; 细菌比浊
管购 自北京天坛生 物制品公 司 ; 低速 自动离心 机
B FX S 一 3 2 0 型 。
2 常 . 培养和徽 . 培养的生长曲线比较
从 一 7 0 ℃ 低温 冰箱取 出菌种后 , 在 M H 固体
培养基 中复苏 , 传 6 代备用 。 取单个菌落接种 在
10 m L 锥形瓶中 , 充分混匀 。 l h 后 ,取菌液加入微
孔板 , 每孔 10 0 拜 L ,每隔 Z h 分别从 1 0 0 m L 锥形瓶和
% 孔微孔板中取菌液 10 拜 L , 依次 10 倍稀释后 , 用
平板稀释法进行活菌计数 ,计算微孔板和锥形瓶中
的细菌浓度 ( c F U · m L 一 ’ , C F U 即为菌落形成单位 ) ,
做对数曲线 。
3 死菌对 M T T 法的吸收度 《A )影晌
在 2 个 10 m L 锥形瓶中 , 各加人 M H 培养液
5 0 m L
,单个菌落 1 个 , 培养 18 ~ 2 4 h , 其中一瓶用
10 0 ℃ 沸水煮 4 0 m in , 从 2 个锥形瓶中各取 30 户 L ,
加入微孔板 , 每孔 10 井 L ,然后加 2 . 5 m g · m L 一 ’ M ,r
10料 L , 3 7 ℃ 放置 l h 后 ,离心 10 m i n ,弃上清 ,加人异
丙醇溶解后 ,用 5 70 n m 波长 〔` 〕测定各孔平均A 值 。
4 铜绿假单胞菌的培养与 M T T 测定
将新培养的单个细菌接种到 50 m L M H 液体培
养基中 ,在 37 ℃ 培养 6 h ,用 比浊法确定细菌数量 ,
并用 M H 培养液将细菌稀释成 1 x l o , e r u · m L 一 ’ ,
加入酶标孔 中 , 培养 20 h , 余下方法同上 , 同时用无
菌培养液作为空 白对照 。
一 14 4 4 一
中国新药杂志 2X() 6 年第 15 卷第 17 期
5 寻找苗液与 M T T 的最佳使用浓度
5
.
1 M T T 浓度对 A 值的影响 用菌液浓度为 l x
10
9
e r u
·
m L
一 ’ , 分别加 M竹 2 . 5 , 5 . 0 , 7 . 5 , 10 m g ·
m L
一 ’ , 反应 l h 和 1 . s h ,对 M竹 浓度和 A值做线性分
析 , A 值在 1 . 5 一 2 . 0 范围内选择出最佳使用浓度 。
5
.
2 细菌与 M T T 反应不同时间对 A 值及细菌数
t 的影响 将活菌浓度分别为 l x 一。 ` ,一 10 , , l 、
10
吕 , 一 x 一0 9 e r u · m L 一 ’ 的菌液各与 M竹 反应 l , 一 5
和 Z h , M竹 浓度为 5 m g’ m L 一 ’ , 测 A 值 。 在 3 个反
应时间分别分析活菌浓度和 A 值的回归关系 。
5
.
3 细菌培养不同时间对 A 值的影晌 在微孔板
中培养铜绿假单胞菌 , 在 0 一 3 6 h , 每隔 Z h 用平板
稀释法测菌液浓度 ,用 M竹 法测 A 值 ,每次取 3 孔 ,
取平均值 。 将 0 一 1 2 h , 13 一 2 4 h , 2 5 一 3 6 h 3 个时间
阶段 , 用平板稀释法计数得到微孔板中菌液浓度与
A 值作线性分析 。
6 有效药物的筛选
` . 1 初筛方 法 将抗生 素稀 释 成 1 0 0 0 , 10 和
10 拜 g · m L 一 ’ ,每孔加药液 10 拜 L , 菌液 9 0 拜 L , 各加 3
孔 。 取培养液 10 0 料 L 为空白 , 不加药的菌液为对照
组 。 37 ℃培养 2 0 h ,用 M竹 法测 A 值 。
药物有效的判定标准 : 不加药物的菌液为对照 ,
酶标仪检测平均 A 值在 1 . 5 一 2 . 0 为宜 , 当中 、低浓
度 ( 10 和 l 拜 g’ m L 一 ’ )的药物使菌液 A 值下降 0 . 8 -
1
.
5
,抑制率妻 50 % ,则判断该药物初筛有效 .〕
抑制率的计算方法 :
抑制率 / % 二 〔(几. 和娜 一月、 一。 , 。 ) 一 (月加。 .一
A、 . 端 , . ) ] / ( A . 液对 , 一 A、 一培。 旅 ) x 10
` . 2 复筛确证方法 用 M竹 法进行微量 M CI 药敏
测定 。 分别取菌液 180 拜 L , 加人微孔板的第 l 孔内 ,
其余各孔加 10 拜 L 菌液 。 在第 l 孔内 ,加人 1 2 8 0 拜g ·
m L
一 ’ 的被选药物 2 0 拜 L , 充分混匀后 ,取出 10 拼 L 加
入第 2 孔 , 依次倍比稀释药物为 12 8 , 64 , 犯 , 16 , 8 ,
4
,
2
,
l
,
0
.
5
,
0
.
2 5
,
0
.
12 5
,
0
.
0 6 2 5 拼g · m L 一 ’ , 以不含药
物的菌液作为对照 。 每浓度加 3 孔 , 37 ℃ 培养 2 0 h
加 M竹 , 测定 A 值后取平均值 , 计算抑制率 , 抑制
率 ) 80 % 的最低浓度为 M IC 。 用常规 M IC 药敏测
定方法 (液体试管 2 倍稀释法 〔’ 〕 )与 M竹 法 比较 。
结 果
1 徽孔板中徽 , 培养对细菌的影响
在 10 m L锥形瓶中常量培养与在 9 6
中微量培养 , 细菌的生长情况基本一致 。 1
孔微孔板
一 1 2 h 铜
绿假单胞菌的菌液浓度较小 , 13 一 2 4 h 细菌生长较
,菌液浓度达到最大值 , 25 h 后菌液浓度开始减
。 在培养 2 0 h 后 , 微孔板中孔 内菌液浓度约为
好少
l x 一。 , o e r tJ · m L 一 ’ 。 见图 l 。
幼养时间 /h
图 1 钢绿似单胞菌对数生长曲线 (平板稀释法计数 )
2 死菌对测定结果的影晌
死菌体 (沸水浴 4 0 m i n )用 M竹 法 测 A 值为
0
.
09 5
, 活 菌为 1 . 743 。 死菌对 测定结 果 干扰为
1
.
1%
,影响很小 。
3 M T T 浓度对 A 值的影晌
在反应 l h 和 1 . s h 时 M ,r 浓度和吸收度均呈
线性相关 , 其相关系数分别为 r : 卜 二 0 . 9 98 4 , r[ . 5 、 二
0
.
9 9 8 1
。
A 值在 1 . 5 一 2 . 0 范围内选择出最佳使用
浓度为 5 . 0 m g · m L 一 ’ , 既对细菌造成的衰亡数较小 ,
且 A 值与菌浓度呈线性相关 。
4 细菌与 M T T 反应不 同时间对 A 值及细菌数 ,
的影晌
各浓度菌液的 A值随反应时间延长而增加 , 但
没有线性关系 ,见表 1 。
衰 1 不同反应时间对 A 值的影晌 无 土 :
菌浓度 / C F U · m L 一 1 1 . 0 h 一 s h
中国新药杂志 2X() 6 年第 15 卷第 17 期
别为 r = 0 . 94 9 9 和 ; 二 0 . 9 7 5 。 由图 l 可知 , 2 4 h 后
细菌浓度降低 ,所以选择 20 h 前后作为培养时间 。
6 常规 M I C 药敏测定方法与 M T T 法 比较的结果
对于标准株 A T C C 2 7 8 5 3 ,用泰能和环丙沙星 2
种抗生素比较 M IC 方法与 M竹 法药敏测定的结果 。
泰能常规 M lc 结果为 16 拜g · m L 一 ’ , M ,r 法得到的抑
制率为 9 1% 时 , 药物浓度为 16 拜 g · m L 一 ’ 。 环丙沙星
常规 M IC 结果为 0 . 25 林 g · m L 一 ’ , 当环丙沙星浓度为
0
.
25 拼 g’ m L 一 ’ 时 , M竹 法得到的抑制率为 84 % 。 2
种方法的结果一致 。
铜绿假单胞菌临床耐药株 32 对泰能耐药 , 常
规 M I C > 12 5 料 g · m L 一 ’ 。 环丙沙 星 , 常规 M IC = 0 . 5
拼 g’ m L 一 ’ , 当 M竹 法得到 的抑制率为 87 % 时 , 环丙
沙星浓度为 0 . 5 拼 g 、 m L 一 ’ 。 故用环丙沙 星作为阳
性对照药物用于抗菌药物的筛选 。
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·
nóO,侧魁扭à夕
讨 论
1 x l 0 9
1 x 10 .
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.
56 9 士 0 09 3
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24 3 土 0
.
02 0
0 03 5 土 0
.
0 17
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6 88 土 0
.
14
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.
54 6 土 0
.
02 6
0
.
06 9 土 0
.
0 17
5 细菌培养不同时间对 A 值的影响
为观察处 于不同时间阶段 的细菌的酶活性对
M竹 法测定结果是否有影响 。 当加 M竹 后反应时
间为 l h , M竹 浓度为 s m g · m L 一 ’ ,将在 3 6 h 内 19 个
时间点得到数据分成 3 个时间阶段 , 分别作图分析 ,
见图 2 。
6闯 1 2 h l卜 24 h 2 5、 36 h
3
2 5
2
叹 1 5
。 .
1
10
咬
菌液浓皮 1 1沪 C F U · m L」 蔺液浓度 1 1 0 , OC UF · m L」
0 0 4 0 8 1 2
蔺液浓度 1 l0 OC FU · m L
图 2 在不同生长阶段中菌液浓度与吸收度值的线性关系
当菌体处 于同一生 长阶段 时 , M rT 法测得 的 A
值都与活菌浓度呈线性相关 。 其 中 13 一 24 h 和25 -
36 h 阶段时 ,菌浓度和 A 值线性相关好 , 相关系数分
本实验结果证实铜绿假单胞菌在锥形瓶 中和在
9 6 孔微孔板中的生长曲线 变化趋势一致 , 生长情况
相近 ,说明细菌在微孔板 中微 量培养并不影响其正
常生长 , 不会因为培养环境的改变而造成细菌死亡 ,
使药物筛选出现假阳性 。 死菌对 A 值影响较小 , 所
以 M竹 法检测铜绿假单胞菌活菌数量具有可行性 。
结果表明 ,经过 20 h 培养后菌液浓度是 l 、 or ’ “ c F .u
m L
一 ’左右 ,在 l / 一。 , 一 l x l o , o e F u · m L 一 ’ 范 围内 ,
在同一生长阶段的菌液的菌浓度和 A 值呈线性 相
关 。 采用 2 种已知抗生素 , 分别对炯绿假单胞菌做
药敏检测 ,结果表明 M竹 法和常规 M lc 方法的结果
完全一致 ,说明 M竹 法结果可靠 。 我实验室用 M ,r
方法从中国科学院上海药物研究所提供的 25 个样
品中筛选出对标准株 AT C C 2 7 8 5 3有效的敏感药物
12 个 ,对临床耐药株 3 2 有效的敏感药物 7 个 16 ] ,
结果与传统 M CI 方法相同乙
为使 M竹方法中涉及 的参数标准化 , 我们研究
了活菌数量和 M竹 还原物量之 间的关系 。 M竹 与
脱氢酶进行酶促反应 , 随反应时间延长 ,反应产物 甲
成量增多 , A 值增加 。 M竹 浓度越高 ,其反应速度越
快 ,在相同时间内产物多 。 与 M竹 反应 Z h 的菌液
与未加 M r 的空白菌液用平板稀释法计数 , 分别为
1
.
3 1 x 10
, 和 4 . 8 x 10 , C FU · m L 一 l , 减少 了 7 3% 。
可见反应时间过长 , M竹 抑制细菌活性 。 比较不 同
反应时间 ,使用不同浓度 M rT 得 到的 A 值 , 以 M竹
为 5 m g’ m L 一 ’ , 反应 l h 时产物适量 , A 值与活菌数
线性相关性好 , 可准确反映活菌数 。 当细菌浓度低
一 14 4 5 一
c hi e ns e o J
u rna lo f New Du r护 2以拓 , v o l · 15 NO · 17
于 106 c F u · m L 一 ’ 时 , A 值与菌数无线性关系 。 菌浓
度过高时 , M竹 可能相对不足 。 当 M竹 和菌液浓度
同时很高时 , 其产物过 多 , A 值超过酶标仪量程
范围 。
总之 ,本研究结果显示 M rT 比色法可 以用来评
价天然产物与合成化合物的抗菌活性 。 与在这个领
域中普遍应用的其他方法相比 , M竹 比色法只需极
小量样品便可获得满意的结果 , 而且操作简便 ,省时
省力 ,成本较低 ,结果稳定 ,具有可重复性 , 适宜体外
高通量药物筛选 。 通过吸收度可计算抑菌率 ,具有
客观性和可比性 , 可准确描述抑菌作用 ,本方法也适
用于其他细菌的高通量筛选 ,但应注意不同细菌其
脱氢酶的含量和活性不同 ,实验条件 (温度 、 反应时
间 、 M竹浓度 )也不同 7[] 。 经过不断试验 , 最优化这
个筛选系统的参数 , 已用于抗铜绿假单胞菌活性 的
药物的高通量 筛选 。 用所建立 的 M竹 法 H rS 模
型 ,我们筛选了大量待检药物 , 并用 M竹 法进行微
量 M IC 药敏测定确证了一些新化合物的抗菌活性 。
【作者简介】 肖晶 ( 19 82 一 ) , 女 , 硕 士研 究生 , E一 m ial : ix ao -
j i
n g @ 坷二 u e d u · c n 。
[通讯作者』 崔景荣 ( 195 2 一 ) , 女 ,教授 . 主要从辜肿瘤药理学
研 究。 联系电话 : ( 01 0) 8公幻公场7 , E 一画卜j二 in @ bj m .u ed .u cn 。
朱永红 ( 19 5 0 一 ) , 女 , 剐教授 , 主要从事细菌学和病毒学研 究。
联系电话 : ( 0 1 0 ) 82 5似9 6 2 , E一 m ia l : z h u yh@ bj m u · e d u · c n 。
中国新药杂志 2仪巧 年第 巧 卷第 17 期
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编辑 : 朱振家 / 接受 日期 : 2《M场 一 04 一 0 5
左旋咪哇葬腔给药改变小鼠变应性鼻炎薪膜局部的
T h l / T hZ 免疫应答
王鹤尧 ’ ,郑文婕 ,
( l 首都医科大学附属北京朝阳医院药剂科 , 北京 10 0 2 ;0 2 北京理工 大学生命科学院 , 北京 l 0( 刃81 )
[摘要』 目的 : 考察盐故左旋味吐鼻腔给药对小 民变应性鼻炎局部钻膜免疫应答的影 响 。 方法 : 建立雄性
B AL B c/ 小鼠变应性鼻炎模型。 实脸设 正常对照组 、模型组 、布地奈德 ( Bud , 97 . 3 拜 g’ m L 一 ’ )阳性对照组和盆映左旋味
哇低 、 中 、 高浓度 ( L H , 20 , 40 , 160 挤 g’ m L 一 ’ ) 组 ,每组 10 只小鼠 。 给药组均在激发前 60 m in 鼻腔给药 , 滴鼻 10 户卜 d 一 ’ ,
每侧 5 . 。料L , 连续给药 3 周 ; 正常对照组和模型组给予等体积的生理 氛化钠溶液 。 采用 RT一 P C R 测定各组小 鼠鼻钻
膜 T h l 型细胞因子 ( I L一 12 , I L一 1 8 , I F N 一 , )和 ThZ 型细胞因子 ( I L 4 , I L一5 , 一L一 1 3 ) 的 m R N A 水平的变化 ,并用免疫组化
染色检测 IL 4 和 IL 一 12 的表达 。 结果 :对于 T hZ 细胞 因子 IL 4 m R N A , I L一 5 m R N A 和 IL 一 13 m RN A ,模型组这些指标
较正常对照组均明里升商 , L H 低 、 中 、 商浓度组则较模型组荆 t 依核性地降低 ( P < 0 . 05 ) , B u d 组这些指标也里著
降低 。 对于 Thl 细胞因子 IL一 12 m R N A , I L一 18 m R N A 和 IF N 一 , m RN A , L H 低 、 中 、 高浓度组则较模型组剂 t 依软性地
升高 ( P < 0 . 0 5 ) , 而 B u d 组这些指标与模型组无明显变化 。 L H 低 、 中 、高浓度组对 IL 4 和 I-L 12 的 m RN A 水平的影
响与免疫组化染色结果 一致 。 结论 : LH 鼻腔给药可将小民变应性鼻炎钻膜局部的 T h Z 型免疫应答向 TM 型转交 ,
有可能成为新的变应性鼻炎的治疗药 。
[关工词」 变应性鼻炎 ; 盆映左旋咪噢 ; bT l 型细胞因子 ; T hZ 型细胞 因子 ; 免疫应答
[ 中圈分类号 ] 9R 6 7 ; 7R 6 5 . 2 1 [文橄标识码 ] ^ [文章幼号 ] lX() 3 一 3 7 3 4 ( Z lx场 ) 一7 一 l材 6 一 04
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