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万方数据
·18· 生物加工过程 第4卷第1期
O
儿A
Rfo＼鲁 +R2．oH
酯酶或脂肪酶
有机溶剂 R乒。属+且H一愈：：。
H
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∥。／R2+少H』～妙N：。
N02
图2测定酯酶或脂肪酶合成活性的原理
Fig．2AssaytodetellllinethesyTltheticactiv时oflipasesandesterase
立体选择性是酯酶和脂肪酶重要的催化特征，
越来越多的研究致力于提高酶的立体选择性上。在
定向进化的研究中，提高立体选择性的主要障碍是
如何快速的分析突变体的立体选择性。通常利用的
方法是分别测量突变体催化s型和R型手性化合
物(例如(Js)．或(R)一2一苯基丙酸对硝基酯)的水解
速度，利用它们活力的比值来估算E值。但由于这
种方法忽略了对映体化合物之间与酶的竞争性结
合，导致结果与真实值偏差很大，误差甚至可以达到
70％左右。为了提高E值的准确性，Kazlauskas
等【160在传统方法的基础上，建立了对酯酶或脂肪酶
的立体选择性进行快速、准确的高通量筛选的有效
方法：QuickE。他们在酶与手性化合物(例如(Js)．
或(尺)一2一苯基丙酸对硝基酯)的反应体系中加入非
手性化合物(例如四癸酸试卤灵酯)作为参照。脂肪
酶或酯酶水解(S)型或(月)型底物释放对硝基苯酚，
在404m检测；水解非手性参照物释放试卤灵，在
572nm检测。如公式所示，先分别计算单一手性底
物与其参照物吸光值的比值，然后将二者的比值再
进行比对就得出E值。
利用QuickE方法对酯酶或脂肪酶的立体选择
性进行筛选具有很多优点，例如，反应速度快(1rnin
内即可完成测定)，所需酶量少。但是QuiekE法也
有缺点，例如，要求单一的手性底物；必须使用带有
大的发色基团的化合物作为筛选底物；需要透明的
反应体系等。
2．2平板筛选法
由于根据菌落颜色或水解圈形成的筛选方法快
速高效，尽管也有明显的局限性，比如对性状的微小
变化不够灵敏等，平板筛选法一般仍用来对突变库
进行初步筛选。
Kim等_17o采用平板显色法对来自于＆砒．
啪懈以∞瑚ce珊KCTC1767的酯酶文库进行筛选。
如图3所示，筛选文库中的克隆经诱导表达酯酶，酯
酶催化乙酸萘酯的水解并释放出萘酚，萘酚与固蓝
RR(染料)发生反应，导致阳性克隆的菌落显现褐
色，以颜色作为初步的筛选依据。
融飚贼库＼
转化
初步筛选
活力染色
o：一乙酸萘醋
固蓝RR
·阳性克隆
·阴性克隆
图3利用平板显色法初步筛选酯酶阳性克隆的过程
F培．3 Thereactionstepsforthescreeningof
potentialclonesbyactivitys ailling
Bomscheuer等¨副利用pH指示剂的颜色反应与
菌落生长速率差异在琼脂糖平板上对来自风eu如．
啪，娜，z啪瑚ce船(PFE)的酯酶进行立体选择性的筛
选。如图4所示，在琼脂糖平板上建立突变库后，分
别转移到两个含有不同底物的基本培养基平板上，
平板中还加入pH指示剂．结晶紫和中性红。酯酶水
解酯底物释放出酸，导致平板的pH值降低。在指
示剂作用下，阳性克隆呈现红色。同时，在含有甘油
酯的平板上，阳性克隆水解甘油酯释放出丙三醇。
在基本培养基中，丙三醇可以作为菌体生长必需的
碳源，使单克隆生长速度更快。因此，颜色反应和菌
落直径作为阳性克隆筛选的双重依据。
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2006年2月 刘艳莉等：脂肪酶和酯酶的定向进化及其应用 ·19·
H。悬H。茹⋯莘佣Ho峻々H『峻Ⅳ+笠定
图4基于pH指示剂和生长速率的平板筛选方法的原理
ng．4ne州ncipleofnleaSsays stembasedonpHi础catorandenh趴ced鲫曲
2．3其他方法
嘣￡fiths等[1鲥建立了一种新颖的高通量筛选方
法一体外隔间法(讥秽拓r0companmentalization，Ⅳc)，
用来对磷酸三酯酶进行定向进化。他们将目的基因
与目的基因表达的蛋白偶联到链锁状球菌包被的微
珠(直径约1脚)上，构建基因．蛋白．微珠展示库，使
偶联在微珠上的蛋白与底物在乳状液的隔间内进行
反应，采用流式细胞法鉴定反应产物。
Reetz等㈨3建立了红外热成像法(I血批d-mer-
mo脚hics reening)，用于对脂肪酶的立体选择性进
行筛选。由于脂肪酶催化尼和．s．型底物所产生的
热量引起的红外辐射不同，光电红外(IR)成像系统
可监测到相差0．02℃的不同反应，月．型底物在红外
热成像图中显示热点，以此作为筛选依据。
除了以上介绍的几种方法之外，单分子PCR偶
联体外表达系统陋1【，噬菌体展示技术陋J，表面增强
共振拉曼散射法(su血ceEnhancedResonanceRaⅡlaIl
Scatte矗ng，sE耻峪)∞]也都被应用于酯酶或脂肪酶的
高通量筛选。但是由于这些方法需要特殊的仪器设
备，或者只适用于特定的酶，因此应用并不广泛。
3酯酶和脂肪酶定向进化的研究进展
近10年来，定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶
性质改造领域取得巨大的成功，主要集中于提高酶
的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，
对映立体选择性等方面。
其中一个典型的例子就是针对酯酶活性和稳定
性的改造。氯碳头孢(10mcarbef)的核心成分是对硝
基苯甲基酯。酯酶能在水溶液中水解对硝基苯甲基
酯。但是，工业生产条件下需要在反应体系中加入
有机溶剂二甲替甲酰胺(DMF)，以增加底物溶解度，
而酯酶在DMF中活性很低，因此需要对其进行改
造。Moore等[241改造了来自觑埘珊s曲￡i玩的酯酶。
经过连续易错PCR和DNAshufning，得到性状改良
的突变体，在15％二甲替甲酰胺(DMF)溶液中水解
对硝基苯甲酯的活力提高150倍。蛋白结构分析表
明，没有任何一个导致活力提高的突变位点直接参
与底物的相互作用，因此也突显出“理性设计”的局
限性。
Kau妇fmann等对来自B叼iff凇￡胁m“。co招nuk￡凇
(B眦)的脂肪酶进行定向进化，以提高其磷脂酶的
活性。通过一轮易错PCR进行随机突变，获得3个
突变体，相对于野生型，磷脂酶活力提高11至12
倍。D．G础[iths等¨9。采用一种新颖的高通量筛选方
法一体外分隔法(流口如r0companmentalization，
IVC)对磷酸三酯酶进行定向进化。对参与底物结
合的位点进行随机突变，筛选3．4×107个突变克隆，
最后得到活力高于野生型63倍的突变体。值得一
提的是，这是目前已知对酯酶和脂肪酶定向进化中
所筛选的最大的突变库。本实验室对来源于嗜热古
菌Ae印川册职m执的酯酶进行定向进化，利用
APEl5钾特殊的稳定性，建立了准确的高通量高温
酯酶筛选方法。通过两轮易错PCR和筛选，获得了
一株最优突变体(R526v)，其总活力与野生型相比
提高约6倍∞J。
寻找热稳定性酶和提高酶的热稳定性一直是生
产和科研关注的热点。(Js)．酮洛芬是一种具有重要
商业意义的消炎化合物。来自风e“如瑚n∞，z∞瑚．
o吣KCTC1767的酯酶催化其形成，但是酶的热稳定
性很低，限制了它的应用与开发。Ⅺm等利用定向
进化技术提高了酯酶的热稳定性。经过易错PCR
和交错延伸重组引入突变，采用活力染色法进行平
板筛选，得到带有3个突变位点的良性突变体。
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·20· 生物加工过程 第4卷第1期
50℃保温2h，野生型完全失活，而突变体仍然能保
持30％的活力汹j。GiverL127o将嗜热酯酶基因经过
连续6轮随机突变、重组和筛选，共积累了12个氨
基酸突变位点，使来自枯草芽孢杆菌(觑垅ws如矗一
胁)的对硝基苯酯酶(pNB)的￡。值从52．5℃提高到
66．5℃，而在低温状态下的酶活力并未降低。目
前，定向进化已用于提高酯酶和脂肪酶的对映立体
选择性研究中，HorsmaJl等‘2副利用0uickE方法，对
来源于恐M面脚n∞，z∞麟ce，醛的酯酶进行定向进
化。获得突变体Thr230Ile，提高对甲基(S)一3一溴一2一
丙酮的立体选择性，E值从12提高到19。Ree恒
n0’281驯通过定向进化提高了来自ReH如瑚，娜伽兀撕．
，跏Ⅱ的脂肪酶对2．甲基癸酸的立体选择性。除了易
错PCR、饱和突变和DNAsh衄ing方法进行随机突
变外，还采用组合式多重盒式诱变技术(combinat嘶al
咖ltiple．cassettemutagenesis，cMcM)，在与立体选择
值提高相关的敏感氨基酸序列区域进行随机编码，
最后得到立体选择性显著提高的突变体，对(Js)一2一
甲基癸酸的对映体选择值E从1．1提高到>51
(e．e．>95％，转化率24％)。同时也筛选到立体选
择陛完全相反的突变体，即R一型的立体选择性
(E=30)。
定向进化技术应用酯酶的改造，可提高其催化
重要功能性非天然化合物的性能。例如，大环内酯
类抗癌药物埃博霉素(Epothilone)的关键结构与3一羟
基酯很相似，然而很多天然水解酶由于空间位阻的
影响，并不能接受3．羟基酯作为底物。Bomscheuer
等跚。利用定向技术改造酯酶的底物特异性。对来
自风e“幽脚麟尼uo船cem的酯酶基因，采用突变菌
株E．∞如xLl．Red引入随机突变，以平板上菌落的
显色和菌斑生长速率为标准进行双重标准的高通量
筛选。得到的突变体(A209D和L181V)能够水解3一
羟基乙烷酯。然而，突变体的立体选择性非常低
(e．e．=25％，E～5)。
定向进化已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取
得巨大的成功。但如何快速准确的搜索尽量大的突
变库，仍是未来一个阶段对酯酶、脂肪酶定向进化中
研究的重点和难点。在现有的结构一功能基础上，结
合理性和非理性的因素将随机突变集中在少数特定
的位点上，进行“蛋白质半合理设计”b1|，可以大大降
低突变库的容量。这种新策略使现有的筛选方法也
可以快速的覆盖整个突变库，在没有合适的强力筛选
方法时，可以有效的增加获得阳性突变体的可能性。
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