全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2006年第3期
麦谷蛋白中富含有人体必需氨基酸之一的赖
氨酸,高分子量谷蛋白亚基 (HMW-GS)中所含的
Cys残基的二硫键赋予面团弹性,是影响面粉加工
品质和烘烤品质的重要因素[1],小麦品质与 HMW-
GS关系密切[2]。通过基因工程手段改善小麦品质已
成为广泛的共识,小麦 HMW-GS及其基因的研究也
因此成为各国育种工作者的重要课题之一。
现在常用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来
分析 HMW-GS[3],费事费力。DNA分子水平上的检
测,在小麦早代选育过程中有快速、准确、方便的特
点,因而在国内外受到人们的重视。许多学者致力
于小麦品质的改良,获得了部分高分子量谷蛋白亚
基基因的分子标记,同时尝试利用分子标记结合常
规育种方法来聚合优质亚基,以期加快品质改良的
步伐。应用分子标记能够在基因水平上直接鉴定高
分子量谷蛋白亚基,为分子标记辅助育种奠定坚实
基础。
1 高分子量谷蛋白亚基基因的染色体定位
与序列分析
1.1高分子量谷蛋白亚基基因的染色体定位
高分子量谷蛋白亚基是由小麦第一部分同源
染色体上的 3个复合位点控制的,分别位于染色体
1A、1B、1D长臂的近着丝点处,分别记做 Glu-A1、
Glu-B1、Glu-D1。每个位点由两个紧密连锁的基因组
成,根据两者编码亚基分子量的不同,分别命名为
X型和 Y型,X型亚基分子量略大于 Y型亚基。高
小麦HMW - GS基因及其AS - PCR分子标记研究进展
孙宪印 1,2吴科 2 钱兆国 2 米勇 2 李斯深 1
(1山东农业大学农学院,泰安 271018;2山东省泰安市农业科学院,泰安 271000)
摘 要: 小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)与小麦品质性状,尤其是沉降值性状显著相关。利用其做分子标记
选育聚合优质亚基的品种,具有快速、简单、实用、有效的特点。目前,普通小麦基因组中已有15个已命名Glu-1基因被克
隆和测序,这使设计引物序列、进行等位基因的特异性扩增成为可能。对普通小麦高分子量谷蛋白亚基基因组成特点及
分子标记现状进行了分析,并针对国内利用高分子量谷蛋白亚基进行分子标记辅助育种做了展望。
关键词: 小麦 高分子量谷蛋白亚基 分子标记 辅助育种
Researches on HMW-GS Genes and Their AS-PCR
Molecular Markers in Wheat
Sun Xianyin1,2 Wu ke2 Qian Zhaoguo2 Mi Y ng2 Li Sishen1
(1College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Taian 271018;
2Taian Academy of Agricultural Science, Taian 271000)
Abstract: Wheat HMW-GS is associated with wheat quality characters, especially significantly with sedimentation value.
The molecular marker of HMW-GS is quick, easy and efficient in convergent breeding. Now, Primer designed and allele
specific PCR are applicable because the fifteen genesat Glu-1 site in wheat are cloned and sequence analyzed. The characteristic
of HMW genes and their molecular markers are reviewed in this paper. At the same time, the future research prospects on
marker assisted selection breedingin our countryisdiscussed.
Key words: Wheat HMW-GS Molecular marker Marker assisted selection
收稿日期:2005-02-28
基金项目:国家“十五”科技攻关课题[15(种质资源)-002-03],科技部农业科技成果转化资金项目(2004-309)
作者简介:孙宪印(1969-),男,在读硕士,研究方向:小麦遗传育种
通讯作者:李斯深(1963-),男,教授,博士后,主要从事小麦遗传育种和分子生物学研究
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
分子量谷蛋白亚基不同亚基组合对品质特性的影
响较大,是决定面包品质优劣的重要因素[4~6]。
1.2 高分子量谷蛋白亚基基因组成
Shewry等[5]从小麦基因组种中克隆了第一个高
分子量谷蛋白亚基基因,到目前以有许多命名的Glu-
1基因被克隆和测序,包括Ax1、Ax2*、Ax2*B、Ax-nul、
Bx7、Bx7、Dx20、Dx2、Dx2.2、Dx5、Ay(沉默基因)、
By8、By9、Dy10、和Dy12等(NCBI网站查询)。在小麦
家族进化中,高分子量谷蛋白亚基的 X型亚基比 Y
型亚基积累的差异较少,进化的慢一些[6]。
HMW-GS的基因结构分为三部分,无重复结构
的 N-末端和 C-末端以及中部重复区域。与之相同
的氨基酸序列也反映出相同的空间结构。包含较多
半胱氨酸残基的密码子的 N-末端序列,是形成二硫
键交错网所必需的结构,并且决定蛋白质的水溶性
[7]。非重复的 N-端和 C-断共同决定蛋白质多肽链形
成 α-螺旋。重复区域序列决定谷蛋白多肽链形成 β
-转角,进而影响面团弹性。进一步研究表明,Glu-1
位点等位基因的差异主要是由于基因中部重复序
列的大小及重复次数的不同。变异是由该区域内
DNA序列的插入或缺失造成的 [8~11]。1Dx5与 1Dx2
之间的差异便源于此。
理论上讲,编码高分子量谷蛋白亚基的基因有
6个位点,1Dx、1Dy和 1Bx在所有小麦品种中都表
达,1Ax和 1By在部分品种中表达。而 1Ay是一个
沉默基因(Silentgene),不表达的原因是,在一些品
种中 1Ay 结构基因上游的启动子区域核酸发生
了变异,包含一个终止子;而在另一些品种中,1Ay
的编码区存在一个类似转座子的插入序列(长度为
8.0kb),使其结构基因断裂而无法表达。
高分子量谷蛋白亚基基因之间的序列大小很
接近。各亚基 N-末端和 C-末端序列很保守,同源性
很高,只有个别碱基存在差异,而且等位基因序列
的同源性更高,如 5和 2亚基,10和 12亚基序列的
同源性分别为 98.7%和 97.8%[12]。这为等位基因的鉴
别带来困难,而且中部长的重复区域也使测序工作
难度不小。只有在熟悉其序列结构特点的基础上才
能更好地完成分子标记的引物设计。
2 高分子量谷蛋白亚基基因的分子标记
20世纪 80年代中期以来,随着生物技术的迅
速发展,以 DNA片段的多态性为基础的分子标记
技术在遗传图谱的构建、基因定位及图位克隆、外
源 DNA片段的鉴定、品种资源的多样性分析及
DNA指纹图谱的建立方面得到了广泛应用。在众多
的分子标记中,RFLP是应用最早、使用范围很广的
一种方法[13]。PCR技术诞生后,基于 PCR的多种分
子标记应运而生。在小麦遗传育种研究中应用较为
广 泛 的 有 以 下 几 种 :SSR、AFLP、SCAR、STS和
RAPD。但是,目前在研究贮藏蛋白基因的多态性及
变异上,主要应用基因特异 PCR(genespecificPCR,
GS-PCR)或等位基因特异 PCR(alelespecificPCR,
AS-PCR)方法[14]。
随着一系列高分子量谷蛋白亚基基因序列的
测序完成,一系列特异 HMW-GS引物被开发出来,
用于扩增其完整序列编码区,这包括 Ax、Bx、By、
Dx、和 Dy编码区[9]。可是,这些 PCR扩增产物并不
能区分每个位点的不同等位基因。因此,又设计出
新的引物可以特异地鉴定和从 Dy10中区分 Dy12
[15]。既然 Dx5-Dy10和 Dx2-Dy12是 Glu-D1位点常见
的亚基组合,Dx5的引物设计被调整去鉴别这些等
位基因[16]。最近,出现了可以鉴别区分各亚基间只
有少数核酸序列有区别的引物序列,选择性地扩增
其 全 编 码 序 列 , 如 Ax2*、Ax1,Ax、Nul,Dx5和
Dy10。若是全部扩增,片段长度大小超过 2kb。
我国在小麦基因的研究中,虽然起步较晚,但
起点较高,发展较快,已取得不少进步。1992年,程
子刚[17]构建了小麦基因组文库,合成三个探针,从
国外烘烤品质优良的小麦品种中分离出 HMW-GS
基因,但未见进一步报道;同年,复旦大学李育庆[18]
等人用 PCR方法从具有优良品质的“扬麦 4号”的
核 DNA中扩增出小麦 HMW-GS的基因片段并进行
了克隆和测序,发现该扩增所的序列代表了一个新
的 HMW-GS基因;同年,忻骅[19]等人从小麦基因文
库中分离到 HMW谷蛋白基因,并对其序列进行了
分析;1998年,田靫[20]利用小麦 HMW-GS1DX5探针
研究 HMW-GS1DX5基因表达的规律,发现了 1Dx5
基因的时间特异性表达;继 1996年 Blechl[21] 和
Altpeter[22]等用基因枪法分别将含有 HMW-GS基因
的质粒导入到小麦中获得成功表达之后,1997年,
张晓东[23]等利用基因枪法将 HMW-GS5+10的基因
22
2006年第3期 孙宪印等:小麦HMW-GS基因及其AS-PCR分子标记研究进展
和编码除草剂 Basta抗性的 bar基因的亚克隆重组
质粒导入小麦不同外植体获得稳定表达的转基因
植株;1999年张晓东等[23]将来自美国优质小麦品种
Cheyenne的 HMW-GS基因导入北京地区高产抗病
的优良小麦的幼胚、幼穗和花药,获得一批转基因
小麦植株和后代子粒,得到有关部门鉴定证实。
同时,梁荣奇[24]等采用 D’Ovidio设计的引物也
从含 Dx5亚基的品种中扩增出 450bp的片段,辅
助选育优质面包小麦。张晓科等[25](2003)和赵辉等
(2004)设计了略有不同的另一对引物又从含有 1Dx5
基因的品种中扩增出 450bp的片段。
这样利用 PCR分子标记提供一种似乎替代基
本 SDS-PAGE对高分子量谷蛋白亚基选择的方法,
但是这种方法并不像 SDS-PAGE那样同时分析多
个等位基因[26]。为此,人们又进行了多重 PCR(mul-
tiplexPCR)扩增,可以同时鉴定两对与三对等位基
因。特异性标记 Dx5和 Dy12及同时能区分 Bx7和
Bx17的引物被开发出来,利用两对引物同时在同一
体系中反应,由于 Bx7基因的扩增片段超过 2kb,
而 Dx5和 Dy12基因的扩增片段小于 700bp,结果
这一反映体系只在 Dx5和 Dy12基因中建立起来。
Dx5-Dy10和 Dx2-Dy12是许多品种存在的亚基组
合,这个实验只针对了 Glu-D1位点。后来,利用前
人设计的引物,设计不同的引物组合进行了二重
PCR(duplexPCR)和三重 PCR[27],MarcinMoczulski
针对澳大利亚本国品种情况,选用基因出现频率较
高:2*为 45.4%,7+8为 36.4%,7+9为 15%,5+10为
30.5%,且同时出现在三个位点,品质评分较高的亚
基组合类型,改进引物设计,分别从编码区、中部重
复区、启动子区、N-末端、C-末端不同部位设计引
物,以避免引物间聚合,利于引物特异识别,组建
Ax2*,Bx和 Dx基因的单重 PCR扩增体系和三重
PCR扩增体系[28]。
国内多重 PCR方面,在农业上研究的较少。赵
久然等应用多重 PCR技术,采用玉米 SSR引物扩
增,建立玉米 DNA指纹库。多重 PCR技术用在动物
方面,尤其是用于人类上得到了广泛深入的研究及
应用[29~30]。如血小板分型和病毒分类等。目前,四色
荧光技术与多重 PCR技术相结合,可以在一个反应
中同时扩增多达 12～15对不对引物。由 PE公司和
Promega公司等开发的 STR复合扩增试剂盒,己被
应用于人类 DNA指纹库构建及亲子鉴定和个体识
别的研究中。毛细管电泳技术与多重 PCR技术相
结合,使基因分型效率提高一倍,结果更精确可靠。
但在包括玉米、小麦在内的植物上,多重 PCR技术
的研究较少。
3 高分子量谷蛋白亚基分子标记辅助育种
的优点
分子辅助育种[31](marker-assistedbreeding)是利
用与目标性状紧密的遗传标记,在杂种后代中对目
标性状进行追踪选择的一项技术。这种间接选择不
受其它效应和环境因素的影响,因而结果比较可
靠。传统 SDS-PAGE鉴定方法存在一些局限性。
(1)高分子量谷蛋白亚基的迁移率并不总是与
其分子量呈正相关,这种不规则的迁移可能给育种
工作者在优质基因鉴定与筛选过程中带来不便。而
且对那些相对迁移率近似的亚基很难进行准确的
鉴定,如 2与 2*在 10%分离胶上不能区分,即使改
为 5%的分离胶也是勉强区分。
(2)种子蛋白是作为基因的产物,其多样性仅
是 DNA全部多态性的一部分,而且其特性易受环
境条件和发育阶段的影响。
(3)利用常规生化标记在早代选择中在要破坏
种子(胚端作蛋白质电泳,近胚端要种植),使得成
活率下降,费事费力。
利用分子标记进行高分子量谷蛋白亚基鉴定,
克服了 SDS-PAGE鉴定方法存的局限性,在小麦的
整个生育期不同部位都可以取材检测,不必破坏种
子,可以快速大量的检测有关基因;能够有效的区
分不同亚基基因,如 2*亚基基因;更重要的是,这
种特异性分子标记的引物根据 HMW-GS基因本身
设计,与常见的其他连锁标记不同,不存在分子标
记与目标基因连锁互换的问题。
4 展望
总的来讲,我国小麦面粉品质普遍较差,主要
是面筋含量低,湿面筋含量仅为 30%,与烘烤品质
所需的 38%~44%的指标相差较远,面筋的弹性和强
度较差,稳定时间短,沉降值低[32]。其中沉降值作为
重要品质性状,遗传力较高,与大多数面粉、面团品
质参数显著相关,在育种早代选择中应予重视。而沉
降值与品种亚基组成显著相关[33～34]。
23
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
根据马传喜等[35]的研究,我国小麦品种 1D染
色体上的 5+10亚基和 1A染色体上的 1或 2*亚基
较少,而 2+12亚基(1D染色体)和 1A染色体对应
的缺失(N)的品种较多,这是我国小麦品种面包烘
烤品质较差的一个重要原因。赵和等[36]的研究结果
与之相一致,国内品种中Glu-1的3个位点HMW-GS
的出现频率最高的是:N亚基(66%)、7+8亚基(54%)、
2+12亚基(80%),优质亚基 1、2*,尤其是 5+10频率
较低是我国小麦面包烘烤品质差的主要原因。
因此,借助 HMW-GS基因的 GS-PCR分子标记
技术,建立 HMW-GS基因整套稳定的扩增体系,尤
其是建立适合国情的优质亚基如 1、2*、5+10、13+
16、14+15等优质亚基基因的分子标记很有必要。
更重要的是在了解我国小麦品种亚基分布频
率的基础上,优化引物设计,建立适宜的多重 PCR
体系。这对实验本身来讲,一次扩增可以获得较多
的亚基组成信息,同时节约费用,提高效率;对育种
实践来讲,许多杂交组合是在这些基因型间进行
的,这样,在熟悉骨干亲本重要农艺性状配合力的
基础上,更利于鉴别杂种后代是否聚合了优质亚
基,以利选择。相信利用这些分子标记,会加快品质
育种进程,同时也可为品种鉴定和品种知识产权保
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