全 文 ：第25卷 第1期
2013年1月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 25, No. 12
Jan., 2013
文章编号：1004-0374(2013)01-0126-07
收稿日期：2012-06-22；修回日期：2012-08-20
基金项目：国家重点基础研究发展计划(“973”项目)
(2010CB529902)
*通信作者：E-mail:zhrren@sjtu.edu.cn
TALENs：一种新的基因定点修饰技术
张金脉，任兆瑞*
(上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院医学遗传研究所，上海 200040)
摘　要： 转录激活因子样效应蛋白核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALEN)，由 TALE
(transcription activator-like effector)结构域和 Fok I核酸内切酶结构域人工融合而成，它是近几年发展起来的
一种可对基因组定点改造的新技术。TALEN能够特异识别一段 DNA序列，并能够对双链 DNA进行切割，
TALEN造成 DNA断裂后可以启动细胞对 DNA的修复，从而实现特定位点的基因操作如基因敲除、基因
敲进、基因修复等。相比 ZFNs，TALENs的获得更为容易、效果更为明显，它在理论上真正实现了对任意
序列进行基因操作的可能。综述了 TALEN技术的研究发展过程、结构与作用机制、构建 TALEN的方法，
以及目前这一技术的应用等。
关键词：TALEN ；基因定点修饰技术；作用机制；构建方法
中图分类号： Q78　　文献标志码：A
TALENs: A new genome site-specific modification technology
ZHANG Jin-Mai, REN Zhao-Rui*
(Shanghai Institute of Medical Genetics, Children′s Hospital of Shanghai, Shanghai Jiao Tong University,
Shanghai 200040, China)
Abstract: Transcription activator-like effector nuclease (TALEN) is an artificially engineered hybrid protein that
contains a transcription activator-like effector (TALE) domain and a Fok I endonuclease cleavage domain. It has
recently emerged as a powerful molecular tool for targeted genome modifications. TALENs recognize and bind to
specific DNA sequences to generate a double-strand break (DSB) by its nuclease activity. Based on this finding,
various genetic methods, including gene targeting (gene disruption), gene addition, gene editing are being designed
to manipulate the genomes at specific loci. Compared with ZFNs, TALENs are obtained more easily and much more
effective. It is TALEN that really achieving gene modification at any site of genome. Here, we reviewed the recent
progress and prospects of TALEN technology, the mechanism of how it works, construction methods, as well as a
collection of species and genes that have been successfully modified by TALEN.
Key words: TALEN; genome site-specific modification technology; mechanism; construction
基因修饰技术是重组 DNA技术研究的热点之
一，现在已广泛应用到医学与农业领域。为了实现
有效的基因修饰，目前主要发展了以下几种方法：
包括慢病毒载体技术 [1[、Cre/loxP系统 [2[、PiggyBac
转座子系统 [3[、PhiC31整合酶系统 [4[、锌指核酶 [5[
以及最新研究发展的 TALEN技术 [6[。每种技术各
有其优缺点。慢病毒载体可以介导外源基因整合到
基因组中，其优点为整合效率高、整合时间短；其
缺点是随机整合、插入外源片段相对较小以及病毒
基因所带来的安全性问题等 [1[。Cre/loxP系统最主
要的优点是可以进行条件性基因敲除或者敲进，因
此它在制备实验动物模型中得到广泛应用；Cre/
loxP系统缺点则是首先要向基因组中插入 loxP序
列，因此不适合用于基因治疗及转基因大动物的制
备 [2[。PiggyBac转座子系统与 phiC31整合酶存在
张金脉，等：TALENs：一种新的基因定点修饰技术第1期 127
一些相似的特点，如都可实现外源基因位点特异性
整合，外源基因的整合依赖于存在于基因组中特异
识别位点。PiggyBac最主要的优点是可以介导大基
因片段进入基因组，并且可以把大片段重新导出基
因组；PiggyBac的缺点则是容易把外源基因整合入
基因内，破坏细胞内源基因 [3[。PhiC31整合酶系统
可以实现外源基因在基因组中稳定的位点特异性整
合，而且整合位点多为基因外区域；但是 phiC31
整合酶只能实现位点特异整合，不能实现定点整
合 [4[，限制了它在基因治疗等一些领域的应用。
ZFNs (zinc-finger nucleases, ZFNs)曾被认为是
最有潜力的基因改造技术，它实现了基因的靶向操
作，并得到了广泛的应用。利用 ZFNs对 HIV感染
者 T细胞中 CCR5基因进行敲除，并把改造后的细
胞重新输入患者体内现在已经进入基因治疗的临床
试验阶段。然而从商业公司获得高效的 ZFNs需要
支付高昂的费用，从锌指核酶委员会及 Addgene上
获得的 ZF模块质粒，自行组装针对特定 DNA序
列的 ZFNs，所需的工作量大，花费也十分昂贵，
而且最终产生的 ZFNs在细胞内会产生细胞毒性 [5[，
因此有必要发展更为高效的基因定点修饰技术。最
新发展起来的 TALEN技术，具备了 ZFNs技术特
异结合目标 DNA特异性的优点，同时消除了它的
一些缺点 [6-7[ 。
1989年，科学家在植物病原菌黄单胞菌属 (Xan-
thomonas)中分离出一类 TALE (transcription activator-
like effector)转录激活因子样效应蛋白，TALEs蛋
白在宿主细胞中能引起植物得病，为了抵抗病毒
TALEs蛋白，植物在进化中也产生了与 TALEs蛋
白类似的蛋白用于抵抗病毒 TALEs的毒害 [8[；2007
年，Kay等 [9[发现 Xanthomonas致病菌可以把合成
的 TALE蛋白—— AvrBs3注入宿主细胞内，并发
现 AvrBs3能够进入宿主细胞核，然后结合到宿主
upa20基因的启动子上，激活宿主 upa20；进一步
研究发现植物病原体合成的 PthXo1、AvrXa27等一
系列 TALE蛋白其发挥作用的方式都与 AvrBs3类
似，能够识别并结合到宿主基因相应的启动子序列
上，激活宿主基因的表达 [10-12[。2009年，Moscou
等 [13[在前人工作的基础上，揭示出了 TALE蛋白
特异结合宿主基因启动子的机制。2011年，科学家
首次把 TALE与 FokI结合在一起组成 TALEN,并证
实了TALEN在靶基因操作中的能力 [6,14-15[； 2012年，
我国科学家施一公带领的团队通过解析 TALE蛋白
的晶体结构，清晰地揭示了 TALE蛋白特异识别
DNA的机理 [16[，为进一步改造和利用 TALEN打
下了基础。
1　TALEN技术的原理
TALENs蛋白包括两个组成部分。第一个组成
部分来自于天然 TALE蛋白，其 N端含有一个易位
结构域；中间是一段由 1.5~33.5不等的 TALE单元
组成的重复氨基酸序列，每个单元又由 34个氨基
酸组成，其中 32个氨基酸是高度保守的，只有第
12位和 13位氨基酸是可以变化的，能够特异地结
合一个碱基序列，因此这两个氨基酸又被称为重复
变异双残基 (repeat variant diresidue, RVD)，最后的
0.5个单元只含有前面的 20个氨基酸；天然 TALE
蛋白的 C端含有一个核定位信号以及转录激活因
子，能帮助 TALE蛋白从细胞质进入细胞核同时发
挥转录激活作用。以水稻白叶枯病菌分泌的 TALE-
AvrXs10蛋白为例，它结合宿主细胞内 19 bp的
DNA序列需要 17.5个单元，在天然的 TALE蛋白
中发现其 5端第一个碱基为 T不需要 TALE蛋白单
元的结合，最后一个碱基由最后的 0.5个单元约 20
个氨基酸结合 [8-13[。清华大学施一公等 [16[利用没有
结合 DNA的 TALE和结合了 DNA的 TALE进行晶
体结构解析比较发现 TALE以一种螺旋 -转角 -螺
旋的方式结合到 DNA上，其中第 12位氨基酸主要
起到稳定 RVD环的功能，发现只有第 13位氨基酸
是真正识别特异碱基的氨基酸。
2009年 12月，Science第 326期同时发表了两
篇破解植物病毒分泌的 TALEs蛋白能够特异识别
碱基序列的机制，其中Moscou等 [13[完全采用生物
信息学的方法得到了 TALEs蛋白识别碱基的规律，
而 Boch等 [17[则用实验手段破译了这一“密码”。
他们发现 TALEs蛋白中第 12位和 13位氨基酸组
合 (天冬酰胺 -异亮氨酸 -NI)、(天冬酰胺 -丙氨
酸 -NA)、(组氨酸 -天冬氨酸 -HD)、(天冬酰胺 -
甘氨酸 -NG)可分别高效特异地识别碱基 A、G、C、
T, 并提出将来可以像 ZFNs一样把它改造成为基因
定点修饰的工具。2011年，Li等 [6[和Mahfouz等 [15[
分别对天然 TALE蛋白进行改造，把 C端的转录激
活子替换为 FokI核酸内切酶，首次实现了 TALE
蛋白的人工改造，并显示具有良好的效果。此后，
研究人员以天然的 TALEs蛋白为骨架，构建了针
对人、大鼠、小鼠、斑马鱼等不同生物基因的
dTLEs (design TALE)，并跟 FokI核酸内切酶、转
录因子以及表观遗传修饰酶结合在一起实现对，不
生命科学 第25卷128
同物种基因组的定点修饰或调控 [18-24[。研究发现，
植物病毒合成的天然 TALEs蛋白中的 C端和 N端
氨基酸的数目能够影响最终 TALEN的活性，为了
优化 TALEN技术，Sun等 [25[采用酵母双杂交系统
评价不同的 N端和 C端氨基酸数目及结合 DNA序
列数目组合对 TALENs活性的影响，结果发现 N
端和 C端氨基酸残基都需要保持在一定数目时
TALEN才能保持活性。
TALENs的第二个组成部分为来自细菌的 IIS
型核酸内切酶 FokI，当两个 FokI发生二聚化后就
会发挥活性对 DNA双链进行切割，细胞 DNA损
伤后会启动两种修复机制过程，一种为末端非同源
依赖的修复机制 (NHEJ)，另一种是依赖同源重组
的修复机制 (HDR)[26[。当没有外源的同源序列加入
时，细胞就会启动 NHEJ修复机制，将断开的 DNA
末端重新结合在一起，但是这种修复机制是一种存
在缺陷的修复过程，往往会引入新的突变，因此也
就达到了进行基因敲除的目的 (图 1)。如果此时加
入外源的同源碱基序列就可以启动第二种修复机制
HDR修复，利用同源修复机制，可以帮助我们实
现基因敲进和基因修复，但是如果外源的同源序列
是存在缺陷的，那么同样可以达到基因敲除的效果。
2　TALENs技术的操作要点
利用 TALEN技术实现基因组定点修饰的流程
包括以下几个步骤。第一步，从选定的目标序列中
寻找合适的 TALE候选靶位点 (如果目的是突变基
因，一般选择比较靠前的外显子中的靶位点 )，选
择的 DNA序列 5端第一个碱基最好为 T。为了能
快速获得合适的 TALE候选靶位点，目前已经建立
了多个在线软件：(1) https://boglab.plp.iastate.edu[27[；(2)
http://idtale.kaust.edu.sa[28[；(3) http://zifit.partners.
org/ZiFiT[21[。第二步，获取针对靶序列的特异
TALE蛋白。这一步是 TALEN技术最为重要和复
杂的一步，目前已经有多篇文章报道了改进后的获
取 TALEN的方法 [18-22[。第三步，选择合适的 FokI
TALEN蛋白的第12、13位氨基酸NN、HD、NI、NG可以特异识别G/A、C、A、T碱基具有特异性的TALE蛋白和FoxI核酸内
切酶组成TALEN后可以特异识别DNA序列并有效进行切割，断裂后的DNA序列可以启动细胞的修复机制，一种是不依赖同
源片段的非同源末端连接机制，另一种是依赖同源片段的同源修复机制，非同源末端修复往往会引入突变而同源修复可造成
基因插入和基因修改。
图1　利用TALEN蛋白进行基因敲除的原理
张金脉，等：TALENs：一种新的基因定点修饰技术第1期 129
结构域，利用分子生物学的方法把 TALE和 FokI
组装在一起构建完整的 TALEN蛋白。第四步，将
完整的 TALEN引入细胞进行基因组定点修饰操作。
第五步，筛选阳性克隆，评价效果。以上并不是每
个 TALEN必经的步骤，有的会在第三步与第四步
之间加入酵母双杂交等评估，首先确定其活性，然
后再用于实验。
TALEN技术的发展主要体现在上述基因组定
点修饰流程第二步的不断改进中，改进的目的则主
要围绕在：减少劳动量、高通量获取、减少构建过
程中的的突变等方面。到目前为止，已经发展了以
下几种 TALEN组装方法。(1) Gateway组装法：这
是最早出现用于构建 TALEN的方法，Gateway技
术是 Invitrogen公司的专利技术，主要有两个步骤，
首先把 TALE序列克隆进入门载体，入门克隆中目
的基因的两侧为 attL 序列，这些 attL 序列用于在重
组酶的作用下，把表达克隆中 TALEN片段重组进
入表达载体中 [15[。(2) Golden Gate 组装方法：为了
加快 TALEN载体的制备，北京大学张博等 [29[把
PCR及 Golden gate shuttle技术结合，以 TALE家
族成员 AvrBs3为骨架，首先利用 PCR方法扩增出
加入酶切位点识别不同碱基序列的 TALE单元，然
后把这些单元利用 Golden gate shuttle方法在一个体
系中实现所有的酶切酶连反应，这种方法大大缩短
了构建周期，可以在一周之内快速完成针对特异序
列 TALEN载体的构建。为了减少 PCR可能带来的
突变问题，Weber等 [30[改进了 Goden gate组装方法，
减少了 PCR的使用量。(3) Toolbox 组装方法：该
法与 Golden Gate 方法类似，也采用等级组装的方
式进行 TALE蛋白模块的组装，通过 PCR方法引
入同尾酶的酶切位点，每六个单元首先组合在一起
通过，然后构建出三个含有六个单元的载体，再把
这三个载体连在一起就构成了含有针对特定碱基序
列的全部 TALE单元载体，最后再把它插入到
TALEN克隆骨架中。 相比 Golden gate组装方法，
Toolbox统一了限制性内切酶，这种方法只需要两
种酶就可以实现组装，因此进行片段的酶切割更为
方便，应用这种方法也可以在一星期之内完成
TALEN的构建 [31[。Li等 [28[在已经构建的 100个质
粒的基础上，同时结合 Goden gate及 Gateway技术
可以在 24 h内完成 TALEN蛋白载体的组装。(4)
FLASH 组装方法：最近美国麻省总医院 Reyon等 [32[
在 Nature Biotechnlogy 上发表了他们开发的构建
TALEN的新方法，在已有的 376个载体基础上，
首先把第一个 TALE蛋白单元生物素化，然后再把
生物素化的 TALE蛋白单元与磁珠相连，这样就可
以实现 TALE蛋白单元的固定化，随后的酶切酶连
反应就可以在自动化仪器中快速完成。他们利用这
种方法构建了针对含有 EGFP报告基因的 48个
TALENs载体，在含有 EGFP报告基因的人细胞中
显示 100%有效；针对人细胞的 96个内源基因设
计了 TALEN蛋白，证实其中的 84个有效。他们预
测使用这种方法一年内可以制造出超过 7 200对
TALENs，而平均每对的价格小于 200美元，这些
让人欣喜不已。利用 FLASH组装技术可以大规模
地制备 TALEN，这一点是目前所有筛选 ZFNs技术
达不到的，因此在未来可以预见 TALEN技术将在
基因靶向操作领域大放光彩。
3　TALENs技术的应用
自 2009年破译 TALE“机密”以来，TALEN
技术已经应用到人细胞、植物细胞、酵母、斑马鱼
及大、小鼠等模式生物中，未来 TALEN技术最具
应用价值的领域莫过于基因治疗，结合干细胞最新
的研究成果，如采用来自患者自身的 iPS细胞，利
用 TALEN技术对有缺陷的基因进行改造，然后把
改造后正常的细胞重新输入患者体内，达到治疗疾
病的目的。另外，在大动物转基因方面，通过
TALEN技术实现基因敲进，将会加快动物乳腺反
应器等领域的研究步伐。
3.1　TALEN技术在人细胞中的应用
目前 TALEN技术针对人基因组基因操作大部
分在体外培养的细胞中进行，Sun 等 [25[为了选择最
有效的 TALEN，利用酵母双杂交系统筛选出 TALEN-
AvrXa10最优化的 C末端和 N末端组合，然后根据
这一组合设计出针对人镰状细胞病中 HBB基因位
点进行靶向切割的 TALEN。与之前的报道相比，
他们设计的 TALENs可以有效地结合到 HBB基因位
点并进行有效切割，切割后发生同源重组的能力比
经典的方法提高了 1 000倍，而且没有观测到细胞
毒性。Sun等 [25[的研究表明，优化后的 TALENs是
用于基因修改达到基因治疗的强有力工具。
Bultmann等 [24[对 TALENs在人胚胎干细胞和 iPS
细胞是否如 ZFNs一样能够对靶基因序列进行切割
进行了评估，他们选取了 5个内源基因，表明 TALEN
可以达到 ZFNs的精确程度；Sun等 [25[通过改造
TALE蛋白的 C端和 N端氨基酸数目，优化 TALEN
的效果，点对点地比较 TALEN与 ZFNs在人细胞中
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对内源基因 NTF3和 CCR5的删除效果，发现在效
率大体相同的情况下，就目前所得到实验数据显示
TALEN所产生的细胞毒性比 ZFNs小很多。
3.2　TALENs技术在模式生物中的应用
模式生物在基因研究中发挥了重要作用，找到
一个合适的基因修饰工具将大大加快基因功能和生
产应用的步伐。近年来 TALEN技术已经在模式动
物斑马鱼、小鼠、大鼠等和模式植物拟南芥中成功
实现了内源基因的切割和改造。
斑马鱼是生命科学研究中重要的模式动物，长
期以来一直缺乏高效的基因敲除方法。最近很多实
验室建立了 ZFNs用于敲除斑马鱼基因的技术平台，
但是 ZFNs筛选复杂，很难实现大规模对斑马鱼基
因进行敲除 [20[。TALEN技术以其快速获取和高效
等优点将加快我们对斑马鱼用于基础研究的步伐，
在 2011年先后有两篇文章报道了 TALEN技术在斑
马鱼中的应用。Sander等 [21[为了比较 TLANE与
ZFN技术的差异，选取了用 ZFNs实现过敲除的
Gria3a和 Hey2基因来验证 TALEN的效果，发现
两者的基因敲除的效率类似，但是 TALEN所产生
的细胞毒性要远远小于 ZFNs。Huang等 [22[则证实
利用 TALEN技术对斑马鱼基因进行切除后，携带
基因突变的斑马鱼可以通过生殖细胞稳定传递到下
一代，这为 TALEN技术在其他脊椎动物的应用提
供了实验依据。
随着大鼠胚胎干细胞系被建立，大鼠已逐渐成
为研究人类疾病的首选模型。2009年，科学家用
ZFN技术在大鼠胚胎干细胞中完成了基因敲除实
验。为了验证 TALEN是否同 ZFNs技术一样可以
实现对大鼠基因的靶向操作，2011年，美国科学家
Tesson等 [23[利用 TALEN技术成功突变了大鼠 IgM
基因，并发现注射 TALEN-DNA产生的突变率为
19%，而注射 mRNA突变率可以提高到 59%。另外
综合比较显示，TALEN实现基因敲除的效率要比
ZFN高两倍。
4　TALE蛋白的其他应用
TALE蛋白不仅可以和 FokI连接构成 TALE核
酸酶对特定基因进行切割，还可以和转录因子
(transcription factor, TF)、表观遗传修饰酶 (epigenetic
modification enzyme, EME)等结合组成 TALE-调节
蛋白系统来实现基因转录调控。Zhang等 [29[利用
Golden gate组装方法构建了针对人内源基因 SOX2、
KLF4、c-MYC、Oct4的 TALE-TFs，把它们转染进
293T细胞后，通过 qRT-PCR检测后发现 Sox2和
Klf4基因比对照组表达分别上调了 5.5和 2.2倍，这
一结果表明 TALE-TF可以用于基因表达调控，但是
c-MYC和OCT4基因的表达并没有发生明显的改变，
他们猜测可能与基因所在区域的染色体开放状态有
关系。Bultman等 [24[通过抑制细胞内的组蛋白甲基
化转移酶的功能来验证染色体状态是否影响 TALE-
TFs的作用，发现针对 OCT4基因的 TALE-TF的调
节功能较未加入组蛋白甲基化酶抑制剂之前的
OCT4的表达显著提升，这一研究结果为进一步改
造和利用 TALE-TF提供了有价值的参考。TALE蛋
白是否能与表观修饰酶如组蛋白甲基化转移酶、组
蛋白乙酰化转移酶、组蛋白去乙酰化酶、DNA羟
化酶等连接在一起，通过改变表观遗传修饰来调控
基因的表达目前仍处于设想阶段 ( 图 2)，并没有
实验数据证明。可以想象，在未来很可能开发出新
的基因表达调控工具，用于生命科学研究。
5　TALENs技术展望
作为一种新兴的基因组定点修饰工具，TALEN
技术正受到越来越多的关注，在未来可能代替 ZFNs
技术成为基因定点修饰操作的主要技术。相比
ZFNs，TALEN技术的优势是明显的：第一，TALEN
筛选更为简便，它不需要复杂的筛选过程，只需要
简单的分子克隆技术就可以在实验室制造出高效的
TALEN，而 ZFNs需要付出大量的劳动，甚至是巨
额的花费；第二，TALEN特异识别 DNA序列的能
力更强，用野生型不经改造的 FokI产生的脱靶率
要比 ZFNs小，而 ZFNs中 FoxI同源二聚化后会引
起细胞毒性；第三，由于 TALEN结合 DNA序列
更为严格，因此效率比 ZFNs要高。特别是在一些
难以通过传统方法实现基因打靶的模式生物、经济
物种或建立的细胞系中，TALEN技术将发挥不可
替代的作用。同时，TALEN在基因治疗领域将独
具潜力，有望成为基因治疗的一个主要手段。但是
目前 TALEN技术还存在一些问题，主要包括以下
几个方面：(1)设计识别 20个碱基序列的 TALEN
蛋白可能含有一千多个氨基酸，因而可能会引起机
体的免疫反应，这将降低 TALEN在细胞中的作用；
(2)TALEN也存在脱靶的问题，这可能由于细胞中
染色体的状态引起，如 TALEN技术对于处于异染
色体结构中的基因序列没有效果；(3)TALEN技术
是否可以胜任掺入大的片段，目前 TALEN技术的应
用主要集中在基因敲除方面，但是否适合大片段的
张金脉，等：TALENs：一种新的基因定点修饰技术第1期 131
基因插入还需进一步研究。
要实现 TALEN技术的广泛应用，在未来需要
进一步改进和完善 TALEN技术结合靶基因序列的
数据库，建立完善的 TALEN信息平台，以及优化
TALE的密码子，使其更有利于在哺乳动物细胞中
发挥作用。可以预见，TALEN技术的发展将大大
加快基因操作相关领域的研究步伐。
[参　考　文　献]
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饰，进而调节转录活性。
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