全 文 ：第27卷 第1期
2015年1月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 27, No. 1
Jan., 2015
文章编号：1004-0374(2015)01-0012-08
DOI: 10.13376/j.cbls/2015003
收稿日期：2014-12-05
基金项目：国家自然科学基金面上项目(31471215)
*通信作者：E-mail: wanghaoyi@ioz.ac.cn
靶向核酸酶介导基因编辑技术的发展
项光海，王皓毅*
(中国科学院动物研究所计划生殖生物学国家重点实验室，北京 100190)
摘　要：对目标基因组位点进行靶向修饰一直是基因工程研究的重点。靶向基因编辑技术能够有效地用于
建立动物和细胞疾病模型、培育动植物新品种，并具有治疗遗传疾病的重大潜力。近年来靶向核酸酶技术
取得了重大的进展，逐渐成为基因编辑的主流工具。综述了锌指核酸酶 (ZFN)、类转录激活样效应因子核
酸酶 (TALEN)、规律成簇间隔短回文重复序列 (CRISPR/Cas)这三大靶向基因编辑系统的原理和研究进展，
并讨论了其局限性和未来的发展方向。
关键词：基因编辑；锌指核酸酶；TALEN；CRISPR/Cas
中图分类号： Q789 文献标志码：A
Programmable site-specific DNA endonucleases:
powerful tools for genome engineering
XIANG Guang-Hai, WANG Hao-Yi*
(State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology,
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)
Abstract: Genome engineering technologies are invaluable tools for understanding the function of genes in health
and disease. In recent years, the programmable site-specific DNA endonucleases, including zinc finger nucleases
(ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and the clustered, regularly interspaced short
王皓毅，博士，中国科学院动物研究所研究员，计划生育生殖生物学国家
重点实验室基因工程技术研究组组长，美国杰克逊实验室杰出访问教授。长期
从事基因工程技术的开发与应用，对于转座子编辑、传统基因打靶技术、ZFN、
TALEN和 CRISPR等技术体系积累了大量的研究经验，并获得多项研究成果：
包括率先利用 TALEN系统对人类胚胎干细胞和诱导性干细胞进行了精确高效的
基因敲除和敲入操作；利用 TALEN系统建立了世界上第一只 Y染色体上的基因
敲除和敲入小鼠；率先利用 CRISPR/Cas系统建立了在胚胎干细胞中进行多基因
敲除的方法，并通过受精卵注射一步获得多基因敲除的小鼠，在进一步的工作
中通过受精卵注射 CRISPR/Cas系统的同时提供 DNA单链和双链供体，从而一
步得到基因原位敲入小鼠和条件性敲除小鼠。2014年，王皓毅研究员全职回国，
在中国科学院动物研究所组建实验室，实验室的研究方向主要有：1)进一步研
究 TALEN和 CRISPR基因编辑技术的特性，提高其效率和特异性；2)应用基因
编辑技术开发新的疾病治疗方法。3)全新基因编辑和表观遗传修饰技术的开发。
项光海，等：靶向核酸酶介导基因编辑技术的发展第1期 13
对目标基因组位点进行靶向修饰一直是基因工
程研究的重点。靶向基因编辑技术能够有效地应用
于建立动物和细胞疾病模型、培育动植物新品种，
并具有治疗遗传疾病的重大潜力。基因打靶技术
(gene targeting)是最为成熟的一类基因编辑技术，
最初由 Mario Capecchi在 20世纪 80年代提出 [1]。
他利用细胞内在的同源重组机制，将含有同源序列
的外源 DNA片段导入细胞，使其定点整合到基因
组的特异位点，从而改变某个具体基因的功能、表
达，或修复基因突变。基因打靶技术与胚胎干细胞
技术的结合使得建立具有精确基因修饰的动物模型
成为现实，这一伟大突破被广泛应用于基因敲除小鼠
的建立，而为发展这一技术做出重大贡献的三位科学
家：Mario Capecchi、Martin Evans和 Oliver Smithies
也于 2007年获得诺贝尔生理学或医学奖。靶向基
因编辑技术的建立促进了基础研究，也给生物医学、
个体治疗带来了曙光。但是基因打靶技术主要依赖
自然发生的同源重组，这一过程在大多数物种和细
胞类型中发生频率极低，使得这项技术的应用受到
限制。二十世纪 90年代，有研究报道 DNA分子发
生双链断裂 (double-strand break)时，能够引发 DNA
以同源重组 (homo logous recombination, HR)或者非
同源末端连接 (non-homology end joining, NHEJ)方
式修复受损的 DNA[2]，同时引入碱基突变、缺失或
者插入。因此，利用各种方法在基因组特定位点诱
导 DNA双链断裂，从而引发 DNA修复活动，使
得基因靶向编辑效率大大提高。近年来，多种新型
高效的 DNA靶向内切酶被发现并投入应用，其中
应用最为广泛的为锌指核酸酶 (zinc finger nucleases,
ZFN)、类转录激活样效应因子核酸酶 (transcription
activator -like effector nucleases, TALEN)、规律成簇
间隔短回文重复序列 (clustered regularly interspaced
short pali dro mic repeats, CRISPR/Cas)系统。 这三大
系统主要通过在目标位点造成 DNA双链断裂，从
而介导以同源重组或非同源末端连接方式修复受损
DNA，实现对基因的定点敲除 (Knock-Out)[3-9]、敲
入 (Knock-In)[10-11]，基因修正 (gene correction)[12-13]
等多种修饰。此外，这些系统也可以被应用于对基
因表达水平的调控 (transcription regulation)[14-18]和表
观遗传修饰的编辑 [19-22]等，本文将只介绍靶向核酸
酶基因编辑方面的应用。接下来，我们将详细介绍
基因打靶技术和这三大靶向核酸酶系统的发展与应
用，并对其局限和未来发展方向做简单的分析。
1　基因打靶技术(gene targeting)
传统的基因打靶技术在小鼠中得到最为广泛的
应用，它是基于小鼠胚胎干细胞的获取和同源重组
能够引入外源 DNA这两个概念和技术上的突破而
建立的。
胚胎干细胞是从早期胚胎中分离出来具有无
限分裂能力并可分化为各种成熟细胞类型的一类
细胞。 Evans和 Kaufman [23]，以及 Martin等 [24]于
1981年最早报道了从体外培养的小鼠囊胚中分离出
胚胎干细胞 (ES cell)，并证明 ES细胞具有与畸胎
瘤细胞 (EC)一样的核型。Bradley等 [25]随后又证
明 ES细胞通过显微注射到囊胚中，能够整合到生
殖系细胞中，遗传到下一代，最终获得基因修饰的
动物。
早期研究报道外源遗传物质通过磷酸钙共沉
淀的方法能够引入到哺乳动物基因组。但是在正常
情况下，同源重组方式介导基因整合的频率极低
(10-8~10-9)[1]，外源 DNA往往通过随机整合方式插
入到染色体某一位点。Mario Capecchi在 1986年报
道了外源 DNA能以较高频率 (10-3)通过同源重组
的方式整合到哺乳动物基因组中，他建立了一株潮
霉素 Neo筛选标记缺陷的细胞系，然后通过引入外
源 DNA修复 Neo筛选标记，从而证明了外源 DNA
和哺乳动物染色体间能够发生同源重组。同一时期，
Smithies等 [26]也报道了在体外培养的人类细胞中外
源 DNA以极高频率通过同源重组方式整合到
β-globin位点，第一次实现了外源 DNA定点插入到
基因组中。随后，Thomas和 Capecchi [27]报道了在
小鼠胚胎干细胞中进行基因打靶的实验，成功突变
了基因 HPRT，并插入了 Neo筛选标记。
以上两项技术的协同使用，奠定了基因打靶技
术的基础，但是该项技术依赖于：(1)胚胎干细胞
palindromic repeat (CRISPR) system, have gained tremendous popularity and become widely used for genome
engineering in cell lines and animal species ranging from Drosophila to primates. Here, we reviewed the principle,
progress, limitation and prospect of ZFN, TALEN and CRISPR/Cas systems for genome engineering.
Key words: gene editing; ZFN; TALEN; CRISPR/Cas
生命科学 第27卷14
的建立和胚胎干细胞在注射到早期胚胎中形成嵌合
动物生殖细胞的能力；(2)同源重组在胚胎干细胞
中具有较高的效率。这两点使得基因打靶技术一直
局限于小鼠的几个特定品系中，而最近随着大鼠胚
胎干细胞培养体系的进步才成功应用于大鼠 [28-29]。
对于其他重要的哺乳动物，如猪、牛、和非人灵长
类等其胚胎干细胞的分离和培养条件依然在努力优
化中。此外，在人类胚胎干细胞和诱导多能性干细
胞中，同源重组的效率很低，极大限制了该方法的
应用。因此，传统的基因打靶技术的应用比较有限，
但是其在理论和原理上的突破依然具有重要意义。
2　锌指核酸酶(ZFN)
2.1　ZFN的构造和原理
锌指蛋白最早报道见于 1985年，Miller等 [30]
发现细菌 5S RNA的体外转录需要一个 40 kDa的
结合蛋白参与，对这个蛋白质分析表明其含有 9个
串联的相似的功能单位，每个单位有近 30个氨基
酸且含有 Cys-Cys-His-His的保守结构域。后续研
究表明，每个锌指蛋白含有 ββα状的保守构象，表
面某些氨基酸能够识别 DNA双链上的 3个连续的
核苷酸。人工串联 3~6个锌指蛋白能够特异识别
9~18个核苷酸，18个核苷酸长度的序列有 418种组
合，串联起来大约 6.8 × 109 bp DNA长度，能够覆
盖几乎所有生物的基因组，因此，足以保证与靶点
结合的特异性。
将锌指蛋白同Ⅱ型限制性内切酶 Fok I的切割
结构域串联形成人工锌指核酸酶 [31]，由于 Fok I 需
要二聚化才能发挥功能 [32]，因此，需要设计两个互
补的 ZFN分子，与靶位点特异结合后，两个 ZFN
分子间隔距离合适时，Fok I二聚化发挥切割功能，
造成靶位点断裂，启动体内的 DNA损伤修复机制。
在没有外源 DNA模板时，细胞主要通过非同源末
端连接修复方式，引入碱基的缺失和插入 (Indels)、
突变，达到基因敲除的目的；如果存在与靶位点具
有同源序列的修复模板，细胞可通过同源重组修复
方式实现靶基因的精确修复或在此位点插入基因，
如筛选标记、荧光蛋白等。目前，锌指核酸酶的构
造主要采取模块组装 (modular assembly)的方法 [33]，
即根据实验验证的锌指蛋白同三联核苷酸的对应关
系，通过建立能够识别所有 3个串联核苷酸类型的
锌指蛋白库，共 64种三联核苷酸组合，当选定打
靶位点后，只要将相应的锌指蛋白挑选并偶联即可。
但由于不同锌指在连接后常常无法维持各自原有的
特异性，因此，合成一段识别 18个碱基的锌指链
往往需要进行锌指文库的大规模筛选。同时，并非
所有的目标序列都能找到高效特异的锌指蛋白，因
此，在目标位点的选择上有一定限制。
2.2　ZFN的研究进展
锌指核酸酶是第一个大规模应用于基因编辑领
域的工具，目前已经在体外培养的哺乳动物细胞 [34-36]
和斑马鱼 [3-4]、小鼠 [12]、大鼠 [37]、拟南芥 [38]等多
种模式生物中成功实现了基因敲除或修饰。美国的
Sangamo公司在锌指核酸酶应用研发领域处在领先
位置。2005年，Sangamo公司成功利用 ZFN在人
类细胞中实现了对一个与免疫缺陷相关的突变基因
Il2Rγ的修复 [34]；2008年，Sangamo公司又通过造
成 HIV的共同受体 CCR5基因的突变，大大提高了
T淋巴细胞对于HIV病毒的抗感染能力 [35]；2010年，
Holt等 [36]报道了突变人类造血干细胞中的 CCR5
基因，并将造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠中，发现
小鼠对 HIV病毒具有免疫排斥；2014年，Genovese
等 [39]报道了利用 ZFN在造血干细胞中精确修饰并
插入 Il2RG基因的 cDNA，然后将造血干细胞移植
到免疫缺陷小鼠模型中，能够重建小鼠的造血系统。
此外，Sangamo公司治疗 HIV的 ZFN药物已经进
入二期临床试验。另外，学术界的大量科学家也在
不断地推动 ZFN技术的发展和应用，比较突出的
有 Keith Joung、Daniel Voytas和 Dana Carroll等。
2.3　ZFN的局限和未来研究方向
作为最先应用的靶向核酸酶之一，科学家们应
用人工锌指核酸酶，探索了多种靶向基因编辑技术
的实验策略和应用方向，并进行了临床应用的尝试。
这些研究也为后来的 TALEN和 CRISPR/Cas系统
研究提供了重要借鉴；但 ZFN的构建耗时耗力，
且构建费用较高，而且现在尚不能针对任意靶点设
计相应的 ZFN实现特异切割 [40]。另外，ZFN存在
一定的脱靶效应，也限制了 ZFN的广泛应用。
ZFN经过十几年的发展和应用，前期积累了大
量的临床数据，因此对临床基因治疗和细胞治疗具
有巨大的意义。未来的方向是努力提高特异性 ZFN
的设计和生产效率，降低 ZFN诱导的脱靶效率。
3　TALEN技术
3.1　TALEN的构造和原理
TALE蛋白最早报道于 1989年 [41]，但是直到
2009年，才有两个研究小组同时在 Science杂志上
报道了 TALE蛋白能特异性地识别 DNA序列，并
项光海，等：靶向核酸酶介导基因编辑技术的发展第1期 15
破译了 TALE蛋白与 DNA碱基识别的密码 [42-43]。
2010年，Christian 等 [44]首次报道了 TALE与 Fok I
偶合形成 TALEN，并证明了其靶向切割能力。
2012年，TALE蛋白特异识别 DNA序列的晶体结
构又获得解析 [45]。
不同的 TALE蛋白其 DNA结构域由高度保守
的重复单元组成，每个重复单元含有 33~35个氨基
酸，除了 12和 13位两个氨基酸不同外，其他氨基
酸在不同 TALE中是高度保守的。这两个氨基酸被
称为重复序列可变的双氨基酸残基 (repeat variable
diresidues, RVD)，参与对 DNA双链上的碱基识别，
每一个 RVD识别 4种碱基中的一种或几种。虽然
不同的 TALE蛋白具有多种 RVD，但目前最为广泛
使用的为以下 5种 RVD(表 1)。
非常困难。2013年，Wang等 [51]在成功利用 TALEN
实现了Y染色体上性别相关基因 Sry和Uty的突变，
并且成功获得了基因修饰的动物。2013年，Carlson
等 [5]和 Tan等 [ 10]在猪中实现了基因的敲除和敲入。
2014年，Liu等 [49]报道了利用 TALEN获得了 Rett
综合征和孤独症相关的基因 Mecp2突变的基因修饰
猴。
3.3　TALEN的局限和未来研究方向
TALEN技术较 ZFN技术有巨大的进步。首先，
在构建上，TALEN要远远简单于 ZFN，在一般的
分子生物学实验室即可完成；其次，TALEN识别
位点选择范围更加广，唯一的限制是在识别位点前
的第一个碱基必须是“T”； 但是，TALEN的应用
也存在一定局限。TALEN同 ZFN一样，也存在脱
靶效应，这在临床基因治疗上是一个重要的参考因
素。与 ZFN类似，进一步提高基因精确修饰效率
和降低脱靶效应也是 TALEN的未来研究方向。由
于 TALEN蛋白的编码序列比 ZFN要长的多，因此，
如何有效地将 TALEN表达载体输送到疾病相关细
胞中也是 TALEN在疾病治疗应用方面需要解决的
重要问题。
4　CRISPR/Cas系统
4.1　CRISPR/Cas系统的构造和原理
CRISPR的重复序列特征在 1987年被发现 [53]，
2002年被重新定义 [54]。CRISPR的基因结构非常稳
定，广泛存在于原核生物基因组中，主要由高度保
守的同向重复序列 (repeat)和间隔序列 (spacer)构
成，重复序列长度在 25~50 bp之间，具有回文序列，
能与 tracrRNA形成发夹结构。2007年和 2010年，
CRISPR/Cas系统被发现在原核生物中表现出某种
获得性免疫功能，能使宿主获得抵抗噬菌体、质粒
等外来 DNA入侵的免疫能力 [55-56]。
CRISPR/Cas系统的作用机制大体分为 3个阶
段 [57]：噬菌体入侵的起始阶段， Cas 蛋白复合物
靶向并裂解噬菌体基因组中的原型间隔序列
(protospacer)，原型间隔序列被整合到宿主基因组
的 CRISPR位点的 5端；然后，这些短的掺入的序
列被转录成 crRNA；最后，当噬菌体再次入侵时，
crRNA会与 Cas蛋白的核酸酶结构域连同 tracrRNA
共同对与 crRNA互补的双链 DNA进行切割 , 从而
使细菌具有对抗同类噬菌体再次入侵的能力。
现在发现的 CRISPR/Cas系统大致分为 3类：
其中 I型和 III型系统较为复杂，由多种蛋白质的
表1　TALE蛋白识别DNA碱基密码表
氨基酸对(RVD) 识别碱基
组氨酸-天冬氨酸 (HD) C
天冬酰胺-异亮氨酸 (NI) A
天冬酰胺 -天冬酰胺 (NN) G或A
天冬酰胺-甘氨酸 (NG) T
天冬酰胺-组氨酸 (NH) G
TALE核酸酶 (TALE nuclease, TALEN)的构造
类似于 ZFN，即将 TALE蛋白的 DNA结合结构域
与 Fok I内切酶连接，从而实现在基因组特定位点
实现靶向切割，诱导 DNA修复。目前，TALEN的
构建也有多种方法，最常用的是 Cermak等 [46]发表
的“Goldengate Assembly”。其他的 TALEN构建方
法多遵循同一个思路：首先将 4种碱基对应的
TALE的 DNA结构域序列连接到载体上，然后通
过酶切连接将不同的单体 TALE组成一个阵列，最
后连到含有 Fok I 和核定位序列 (nucleic locus
sequence, NLS)的质粒中即完成了 TALEN的构建。
3.2　TALEN的研究进展
同 ZFN一样，TALEN一经发现便被广泛应用
并成功在体外培养的哺乳动物细胞 [5]和果蝇 [47]、
小鼠 [6]、水稻 [48]等模式生物中实现了基因敲除或
修饰；此外，还在大动物，如猪 [5,10]、猴 [49]等中实
现了基因定点修饰。2011年，Jaenisch研究组率先
利用 TALEN技术在人类胚胎干细胞和诱导性多能
干细胞中建立了高效率的基因精确修饰的方法 [50]。
传统基因打靶技术在小鼠 Y染色体上进行基因修饰
生命科学 第27卷16
复合体执行功能，应用比较困难；II型系统较为简
单，主要执行功能的成分只有 3种：Cas9蛋白、
crRNA 和 tracrRNA。 当 外 源 DNA 进 入 细 胞，
crRNA在 RNase III催化下加工成熟，和 tracrRNA
互作形成双链 RNA结构，介导 Cas9蛋白定向切割
与 crRNA互补的靶位点。Cas9 蛋白的 HNH 核酸酶
结构域剪切互补链，而 RuvC结构域剪切非互补链，
从而造成目标 DNA分子的双链断裂 [58]。
4.2　CRISPR/Cas系统的研究进展
CRISPR/Cas系统因其简单的组成成分和设计
上的简单，一经发现便受到了极大关注。目前已经
在体外培养的细胞和多种模式动物，包括猪、猴子
等大动物中实现了靶向基因修饰。2012年，Doudna
和 Charpentier研究小组在 Science上率先报道了利
用人工设计的 crRNA和来源于 Streptococcus pyo­
genes的 Cas9蛋白对体外 DNA进行精确切割，并
通过结合 crRNA和 tracrRNA人工设计了 sgRNA
(single-guide RNA)作为单一 RNA分子发挥引导
Cas9的功能，同时还发现对 Cas9两个不同核酸酶结
构域的突变，能够实现对 DNA单链的精确切割 [58]。
2013年，Church实验室 [8]和 Zhang实验室 [7]同时
在 Science 杂志上报道，利用来自 Strepto coccus
pyogenes的 CRISPR/Cas9系统在体外培养的人类细
胞中也能实现特定基因位点的靶向修饰。随后，
Wang和 Yang等 [9,11]在 Cell杂志上报道利用该系统
在小鼠 ES细胞内实现了同时对 5个基因进行修饰
以及通过该系统在小鼠体内实现多基因敲除、插入
点突变、GFP和 loxP位点等，并且一步获得了基
因修饰的小鼠。具有一个核酸酶结构域突变的 Cas9
nickase蛋白只能切割 DNA双链中的一条。根据
ZFN和 TALEN二聚化的原理，利用两条 sgRNA，
Cas9 nickase在目标 DNA位点造成双链断裂，有助
于提高切割特异性 [14,59]。还有研究报道，突变 Cas9
蛋白的两个核酸酶结构域，并连上转录激活因子，
能调控细胞内源基因的表达 [17,60-61]，以及利用 Cas9
结合 sgRNA文库进行全基因组规模的功能基因筛
选 [62-63]。CRISPR/Cas9系统在治疗上也有很多报道，
如来自上海生科院的李劲松组在 Cell Stem Cell上报
道利用该系统修复与白内障相关的基因 Crygc的单
碱基突变，并获得了正常健康的小鼠 [13]。2014年，
Niu等 [52]在 Cell杂志上报道利用 CRISPR/Cas9系
统在猴子中实现多个基因的敲除。鉴于该系统识别
序列较短，可能会引发较高的脱靶效应，很多研究
小组相继报道了研究脱靶效应的结果，结果不一，
但总体说来该系统的脱靶效应与 ZFN和 TALEN系
统类似 [64]。最近，Zhang实验室又报道了利用多种
病毒载体包装 CRISPR系统，在多种细胞系中实现
了基因敲除，并构建了 Cas9敲入小鼠模型和 p53、
KRAS、LKB13个主要肺癌基因缺失小鼠肺癌模型 [65]。
4.3　CRISPR/Cas系统的局限和未来发展方向
首先，在 Cas9系统中切割位点必须含有 PAM
(protospacer adjacent motif)，限制了 Cas9系统对任
意序列进行切割。其次，20 bp的识别位点的特异
性有限，可能造成较高的脱靶效应。最后，来源于
原核生物的靶向核酸酶系统在真核生物中不同基因
位点作用的差别还有待进一步研究，目前有证据表
明表观遗传修饰可能对 Cas9的切割效率有影响。
未来 CRISPR系统研究重点在于降低脱靶效
率。目前的解决策略有将 dCas9同 Fok I核酸内切
酶偶合 [66-67]，增强识别特异性；CRISPR系统广泛
存在与原核生物中，不同物种中的 CRISPR系统具
有不同的 PAM识别序列和活性。因此，开发、比
较和优化不同 CRISPR系统可以进一步提高基因修
饰的自由度和效率。同时，不同表观遗传修饰和目
标序列组成对于 CRISPR功能的影响也需要进一步
的研究，从而使我们可以设计更加有效的靶向基因
修饰方案。在治疗方面的应用，由于 Cas9蛋白的
编码长度较长，在载体方面需要进一步的选择和优
化，从而达到有效地输送到目标细胞类型进行靶向
基因修饰。
5　展望
随着越来越多物种的基因组测序完成，生物研
究进入后基因组时代。基因组学的研究借助新一代
测序技术和生物信息学手段预测了越来越多与人类
生理和疾病相关的基因和基因型，而是否特定基因
型导致了疾病或生理表型则需要通过实验去进一步
验证。而研究基因的功能往往需要获得该基因功能
缺失或具有特定突变的细胞系或动物模型，因此，
快速、高效的基因编辑技术是建立这些模型的最佳
选择。ZFN的发现和应用打开了利用靶向核酸酶进
行精确基因编辑的大门，但是 ZFN对 DNA序列识
别规则复杂，位点设计选择少，构建费时费力且难
度大，使得其应用受到了限制。TALEN的出现一
定程度上弥补了 ZFN的不足，TALE蛋白与 DNA
序列的识别更加严格，规则更加简单。但是
TALEN构建也相对耗时，使其在全基因组规模的
构建和应用受到限制。相比之下，CRISPR/Cas在
项光海，等：靶向核酸酶介导基因编辑技术的发展第1期 17
设计上极为简单，且造成 DNA双链断裂的效率与
ZFN和 TALEN类似，此外在多个位点上同时进行
基因修饰非常便利。
这三大系统共同的发展方向除了进一步提高效
率和特异性，还需要提高其在静息细胞中的精确修
饰效率。因为同源重组发生在 S/G2期，而静息细
胞 (如终端分化神经元 )基本不进行分裂，因此，
自然状态下发生同源重组的机率极低。在临床治疗
方面，靶向核酸酶蛋白表达载体要进一步优化，以
及针对具体疾病治疗的临床给药方式也有待进一步
发展。总之，这三种基因编辑工具都大大提高了基
因编辑的效率，使得快速获得靶向基因修饰的细胞
和动物模型成为现实，也为多种疾病的治疗带来无
限希望。
[参　考　文　献]
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