全 文 ：第27卷 第1期
2015年1月
Vol. 27, No. 1
Jan., 2015
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2015)01-0071-12
DOI: 10.13376/j.cbls/2015012
收稿日期：2014-09-30
*通信作者：E-mail: hzzhu@fudan.edu.cn
基因编辑技术在基因治疗中的应用进展
季海艳，朱焕章*
(复旦大学生命科学学院遗传学研究所，上海 200438)
摘　要：基因治疗领域面临关键问题之一是缺乏理想的靶向基因修饰技术，而基于锌指核酸酶 (zinc finger
nucleases, ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶 (transcription activator like effector nucleases, TALENs)、
规律性重复短回文序列簇 [clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated (Cas9),
CRISPR/Cas9]等基因编辑技术可以对基因组进行高效靶向修饰，因而，基因编辑技术将成为基因治疗领域
研究的有用工具。现就基于基因编辑技术在基因治疗中的应用进展做一综述。
关键词：基因编辑；基因治疗；ZFNs；TALENs；CRISPR/Cas9
中图分类号：Q789；Q819 文献标志码：A
Progress of genome editing approaches towards gene therapy
JI Hai-Yan, ZHU Huan-Zhang*
(Institute of Genetics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China)
Abstract: One of the key issues towards gene therapy is short of ideal targeted genetic modification technologies.
However, gene editing techniques including zinc finger nucleases, transcription activator like effector nucleases and
CRISPR/cas9 [clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated (Cas9)] achieve
targeted gene modification efficiently, thus gene editing technologies will become a useful tool in the field of gene
therapy. A brief overview of recent advances relating gene targeting methods in gene therapy is provided below.
Key words: gene editing; gene therapy; ZFNs; TALENs; CRISPR/Cas9
朱焕章，博士，教授，复旦大学遗传工程国家重点实验室 PI，主要
从事艾滋病病毒 (HIV)持续感染的分子机制及抗 HIV感染的新型药物和
生物治疗技术等研究。朱焕章教授及其团队首次提出了基因编辑技术靶
向切除整合 HIV前病毒的“斩草除根”的策略，设计并获得了一对能特
异靶向多数 HIV亚型基因保守区的 ZFN，并在体外获得了显著抗 HIV
感染的效果。近几年来，发表 SCI 期刊论文 40余篇，获得授权中国专利
11项。该研究室的主要研究方向包括：(1) HIV潜伏的表观遗传学研究；
(2)干预 HIV潜伏的药物筛选及其作用机制；(3)抗 HIV的细胞基因治疗。
随着生命科学与技术的飞速发展，以及人类对
疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，许多
疾病都与基因的结构或功能改变有关，因而，萌生
了从基因水平治疗疾病的念头和梦想。基因治疗是
指通过操作遗传物质 (无论是人类本身的或外源的 )
来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正
人自身基因结构或功能上的错乱、杀灭病变的细胞
或增强机体清除病变细胞的能力等。基因治疗能从
根本上治愈一些现有的常规疗法所不能解决的疾
生命科学 第27卷72
的途径。下面将基因编辑系统的作用原理及其在基
因治疗领域中的应用、存在的问题及展望作一扼要
综述。
1　基因编辑技术的结构和作用原理
ZFNs、TALENs和 CRISPR/Cas9系统皆是通
过在特定的靶向序列处引入双链断裂的 (double
strand break, DSB)缺口，继而通过细胞内两种 DNA
修复机制完成修复：NHEJ途径 (non-homologous end
joining, NHEJ)会使基因组 DNA缺口处有碱基的插
入或者缺失，造成移码突变，导致基因的敲除；HR
途径在提供外源 DNA模板的条件下会使基因组
DNA得到精确的基因修复或靶向基因的添加 (图 1)。
1.1　ZFNs
每个锌指核酸酶单体是由位于 C末端的非特
异性切割结构域 Fok I和位于 N端的特异性识别
DNA的锌指蛋白 (zinc finger protein, ZFP)以及连接
DNA结合结构域和内切酶的一段小肽组成 [8-9]。
ZFN的特异性取决于锌指蛋白，获得高效、特异性
的 ZFN的前提便是筛选高质量的锌指蛋白 [10-13]。目
前锌指蛋白的筛选方法主要有 Sangamo Biosciences
公司提供的专利技术 (可由 Sigma公司订购该服务 )
和锌指协会开发的资源免费共享平台 (Oligomerized
Pool Engineering, OPEN) [14-16]，研究人员可根据自
己需要筛选特定锌指蛋白。ZFP通常由 3~6个锌指
组成，每个锌指识别基因组中连续的3个碱基，因此，
两个 ZFN共可以识别 18~36个碱基。ZFP一旦与
基因组中的特定序列结合，Fok I核酸内切酶便会
在 DNA双链中形成二聚体发挥内切酶活性，产生
双链切口 DSB，继而通过细胞内修复机制对断裂部
位的基因进行修饰 [17-20] (图 1)。
1.2　TALENs
基因编辑技术在靶向修饰方面飞速发展，2009
年，研究人员发现植物病原体黄色单胞杆菌
Xanthomonas编码的转录激活因子效应物 TALE
(transcription activator like effector)的氨基酸序列与
基因组中的核酸序列有较恒定的对应关系。TALE
由 N-端转座结构域 (translocation domain)、与 DNA
结合相关的中央区域 (central region of tandem direct
repeats)以及 C-端转录激活结构域 (transcription
activation domain)组成。而中央 DNA结合结构域
包含 15.5~19.5个单元模块，其中每个模块单元有
34个氨基酸残基，除第 12和 13位氨基酸可变外，
其他氨基酸都是保守的，因此，这两个氨基酸被称
病，不仅在疾病的治疗方面，而且在疾病的预防方
面发挥重要作用。1990年，美国 FDA批准了由
French Anderson主持的世界上第一个“治疗基因”
转移的正式临床试验方案，对一例因 ADA (腺苷酸
脱氨酶 )基因缺陷导致严重免疫缺损的 4岁女孩进
行基因治疗，并获得初步成功，从而在全世界掀起
了基因治疗的研究热潮。截至 2013年底，全世界
已批准的基因治疗临床试验方案达到了 1 800个。
然而，批准上市的仅 2个产品：一个是我国药品管
理局 SFDA于 2004年 1月批准的世界上第一个基
因治疗产品——“重组人 p53腺病毒注射液”；另
一个是 2012年 7月欧洲药品管理局 EMA批准的荷
兰 uniQure公司研发的 Glybera药物，用于治疗脂
蛋白脂酶缺乏。基因治疗产品上市寥寥无几的现象
说明了该领域面临许多问题，其关键问题之一是由
于目前基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其
插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入
突变及细胞恶性转化的潜在危险。理想的基因治疗
方案应该是在原位补充、置换或修复致病基因，或
者将治疗基因插入到宿主细胞染色体上不致病的安
全位置。传统的基因靶向修饰技术依赖于自然状态
下的同源重组 (homologous recombination, HR)途径
实现对基因组内源性基因的定点敲除或者替换，但
其效率非常低，约为 10-6，因而，大大限制了该技
术的应用 [1]。为了提高基因组定向修饰效率，研究
人员曾建立 Flp/FRT、Cre/loxP和细菌人工染色体
(bacterial artificial chromosome, BAC)载体等系统介
导对靶基因的定点修饰。这些系统介导的基因组靶
向修饰在多种高等真核生物细胞和模式生物中得以
应用。虽然重组酶系统介导的基因靶向修饰相对传
统的靶向修饰技术，其重组效率有所提高，但是在
一定程度上还存在耗时、操作复杂、效率低和应用
范围局限等不足 [2-6]。RNAi (RNA interference)技术
具有快速、操作便捷、成本较低等优势，在基因功
能及基因治疗研究中发挥着重要作用。该技术主要
通过效应因子小干扰 RNA (small interfering RNA,
siRNA)来降低或者是沉默目的基因的表达。然而，
RNAi介导的基因干扰持续较短，有时会受到实验
条件的干扰，若想持久抑制或者敲除基因并非最佳
选择 [7]。因此，在基因治疗领域亟需发展新的基因
组靶向修饰系统用以对目的基因进行持久、特异编
辑以达到治疗的目的。近年来，基因组编辑技术，
如 ZFNs、TALENs和最新的 CRISPR/Cas9系统的
相继出现给基因治疗领域面临的上述问题开辟了新
季海艳，等：基因编辑技术在基因治疗中的应用进展第1期 73
作重复可变的双氨基酸残基 (repeat variable di-residues,
RVDs)位点 [21]。TALEN特异识别 DNA的原理在
于 RVD可以与 DNA中的 4种碱基之一进行结合。
目前发现 RVD与 DNA碱基的对应关系如下：组氨
酸 -天冬氨酸特异识别碱基 C，即 HD (His Asp)-C；
天冬酰胺 -异亮氨酸识别碱基 A，即 NI (Asn Ile)-A；
天冬酰胺 -甘氨酸识别碱基 T，即 NG (Asn Gly)-T；
天冬酰胺 -天冬酰胺识别碱基 G或 A，即 NN (Asn
Asn)-G或 A；天冬酰胺 -赖氨酸识别碱基 G，即
NK (Asn Lys)-G；天冬酰胺 -丝氨酸可以识别 A、T、
G、C中的任一种 NS (Asn Ser)-A、T、C、G [22-23]。
2010年，研究者利用 Xanthomonas中 TALE模块与
DNA序列对应的关系，将 Fok I核酸内切酶与
TALE模块相连，构建靶向基因组中预设的 DNA
靶位点的重组核酸酶 TALENs，TALEN的 DNA结
合结构域将每个模块单元固定在识别序列上，异源
Fok I形成二聚体切割 DNA双链 [24-25] (图 1)。
1.3　CRISPR/Cas9
伴随着对基因打靶技术深入的研究，Qi等 [26]
发现一种更加简便的基因编辑工具——CRISPR/
Cas系统。该系统主要根据细菌或是古细菌中对外
源入侵分子防御系统改造而成，可通过蛋白质和
RNA的复合物对基因组中特定序列进行切割。应用
比较广泛的是 II型系统 Streptococcus pyogenes——
SF370。其 5端为 tracrRNA (trans-activating crRNA)
基因，中间为 Cas9蛋白编码基因，3端为 CRISPR
基因座。Cas9蛋白的 N端和中部有发挥切割活性
的功能结构域；CRISPR基因座包括前导序列
(leader)、间隔序列 (protospacers)和重复序列 (direct
repeats)。前导序列执行启动子的功能，间隔序列捕
获外源 DNA分子的一小段并将其整合在两个重复
序列之间，以便与外源 DNA配对 [27]。该系统在寻
找候选靶点时一般遵循 5-GN19-NGG-3的原则。
NGG被称为 PAM (protospacer adjacent motif)。CRISPR
基因座转录成前体 RNA(pre-crRNA)，与其重复序
列互补的 tracrRNA也同时转录出来，其 5端与经
Cas9、RNase III核酸酶加工成熟的 crRNA的 3端
有约 13 bp 的配对。crRNA、tracrRNA 和 Cas9 组
成复合体，识别并结合于 crRNA互补的 DNA序列。
在后续实验中研究人员将 tracrRNA 和成熟的
crRNA表达为一条嵌合的向导 RNA (guide RNA,
gRNA)，模拟天然 crRNA和 tracrRNA形成的茎环
结构，并在体外证明 gRNA可以发挥各自的功能。
Cas9蛋白含有 RuvC和 HNH两个活性位点。HNH
图1　基于基因编辑技术的基因靶向修饰
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负责与 crRNA互补链的切割，切割位点多数在
PAM上游第 3个碱基外侧。RuvC负责非互补链的
切割，切割位点在 PAM上游的 3~8碱基之间。若
将 Cas9两个活性位点之一 (D10A或 H840A)突变
便只能切割单链 [28-31] (图 1)。
2　基因编辑技术在基因治疗中的应用
基因治疗是基于对细胞内基因修饰的策略来治
疗各种疾病。单基因疾病是由于碱基突变引起，可
通过恢复基因的表达水平实现疾病的治疗。而多基
因疾病的治疗相对来说比较困难。传统的基因治疗
手段通过正常基因的导入弥补缺陷基因，但是基因
导入的效率又是一个难题。随着病毒载体的发展和
应用，研究人员试图通过病毒载体介导基因导入用
以对疾病的基因治疗。其中逆转录病毒介导的基因
治疗首先进入临床。之后，慢病毒 (lentiviruses)、
腺病毒 (adenoviruses)、腺相关病毒 (adeno-associated
viruses, AAVs)等也在基因治疗临床中予以试验。例
如，逆转录病毒介导患有腺苷脱氨酶严重联合免疫
缺陷症 [adenosine deaminase (ADA)-severe combined
immunodeficiency, SCID]和 X-连锁重度联合免疫缺
陷症 (X-linked severe combined immunodeficiency, SCID-
X1)的 CD34+骨髓细胞的修饰 [32]、慢病毒介导患有
地中海贫血症 (β-thalassemia)的 CD34+骨髓细胞的
纠正 [33]、尾静脉注射 AAV 载体治疗血友病 B
(hemophilia B)[34]。虽然，诸如逆转录病毒一类的治
疗载体可以将所需目的基因整合到基因组中，持久
表达用以代替缺陷基因，但是，逆转录病毒的整合
具有随机性，倘若引起原癌基因的激活引发癌症，
那么它的安全性将受到质疑。寻找特异、高效修复
的打靶工具在基因治疗领域中备受关注。基因编辑
技术的出现和应用为人类疾病的治疗提供有力的手
段。主要途径是通过体外纠正致病基因并回输体内
用于疾病治疗研究。近年来 ZFNs、TALENs和
CRISPR/Cas9系统在遗传性疾病、传染性疾病和癌
症方面取得许多可喜的成绩，并推动了基因治疗领
域发展的步伐。
2.1　遗传病
2.1.1　杜氏肌营养不良(duchenne muscular dystrophy,
DMD)
DMD这种单基因遗传病仅仅通过基因打靶工
具对移码突变的表达框进行纠正即可，不需要外源
供体 DNA模板的辅助。DMD疾病是由于移码突变
导致编码基因不能正确形成有功能活性的抗肌萎缩
蛋白 dystrophin。针对这一疾病机理，Ousterout等 [35]
针对性地设计靶向 dystrophin基因 5号外显子的
TALEN，通过该技术介导基因修复实现该基因的正
确翻译并形成有功能的抗肌营养不良蛋白。结果证
实，经 TALEN纠正后的靶细胞 (骨骼肌成肌细胞、
皮肤成纤维细胞 )可以正常表达 dystrophin基因并
形成相应的组织器官。此外，该项技术介导的基因
修饰对其靶细胞没有毒性效应。
2.1.2　帕金森疾病(Parkinsons disease, PD)
α-突触核蛋白 (α-synuclein)是在 PD发病中发
挥关键作用的蛋白质，其基因的点突变可直接导致
常染色体显性遗传的家族性、早发性 PD，而异常
聚集的 α-突触核蛋白是在散发性和家族性 PD中常
出现的特征性病理变化。来自怀特海德生物医学研
究所的研究小组利用 ZFN在不改变 hiPSC细胞基
因组中其他部分的前提下，针对 α-突触核蛋白基因
点突变致病位点插入或是删除单个碱基对，从而成
功对 PD疾病进行基因治疗，该项技术与 iPSC技术
结合使用在疾病基因治疗中显示出巨大的潜力 [36-37]。
2.1.3　大疱性表皮松解(epidermolysis bullosa, EB)
大疱性表皮松解疾病是一种因皮肤和黏膜对机
械损伤易感而形成大疱为特征的遗传性皮肤病。针
对这一发病机制，Wang等 [38]基于 ZFN基因治疗
技术在体外将引起皮肤起疱的缺陷性基因关闭，使
其失活。为了能够验证该方法的有效性，研究人员
首先利用基因工程手段将其皮肤干细胞改造成携带
有绿色荧光蛋白的皮肤细胞，随后用 ZFN进行处理，
结果显示每 5个处理的细胞就会有一个荧光蛋白不
表达的细胞，随着 ZFN剂量的加大，皮肤干细胞
再生潜力依然保持。隐性营养障碍大疱性表皮松懈
症 (recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB)
主要是由编码胶原蛋白 VII的 COL7A1基因缺陷所
致。研究人员在原代纤维母细胞中通过 TALEN介
导的 HR途径对突变基因 COL7A1进行纠正，结果
显示纠正后的细胞可以正常表达胶原蛋白 VII，同
时基因组扫瞄测序显示 TALEN导致的脱靶位点有
3处，该项结果证实 TALEN介导的位点靶向修饰在
基因治疗领域中显示了一定的安全性和特异性 [39]。
2.1.4　α1-抗胰蛋白酶缺陷症
α1-抗胰蛋白酶缺陷症 (α1-antitrypsin, A1AT)
是因血中抗蛋白酶 α1-AT缺乏引起的一种先天性常
染色体遗传代谢病。针对这一发病机制，2011年，
研究人员基于 ZFN基因编辑技术以患者皮肤细胞
来源的 iPSCs中的缺陷 A1AT基因为靶点进行纠正，
季海艳，等：基因编辑技术在基因治疗中的应用进展第1期 75
通过 HR途径将利于阳性重组子筛选的正负标记基
因插入到基因组中，最后再通过转座酶 (transpose)
将其外源插入片段从细胞中剔除，在靶位点处不存
在 DNA被破坏的痕迹，最终获得由 hiPSC转化后
的肝细胞。随后，研究人员在试管和小鼠实验中证
实 ZFN纠正后的肝细胞活力很好，从而证明基于
ZFN技术可以实现对 α1-抗胰蛋白酶基因缺陷引起
的肝病的基因治疗 [40]。这一事例也用 TALEN技术
得到证实 [41]。
2.1.5　X连锁的严重联合免疫缺陷
ZFN在人干细胞中的优化和筛选为该技术介导
的单基因遗传性疾病的治疗提供了有力的手段。目
前对遗传病的治疗可以通过外源基因对疾病基因进
行修饰，从而恢复正常基因的表达水平。该技术介
导的遗传性疾病的治疗的实例较多，其中 ZFN技
术针对引起 X连锁的严重联合免疫缺陷 (X-linked
form of severe combined immunodeficiency, X-SCID)
的白介素 2受体链 (interleukin 2 receptor gamma chain,
IL2RG)突变基因进行修饰为一个例子。Urnov等 [42]
通过 ZFN介导的 HR途径在慢性髓原白血病细胞
K-562中对两条 X染色体中第 5号外显子突变的
IL2RG基因进行纠正，约有 7%的突变基因恢复到
原有基因的表达水平。而在体内观察经 ZFN纠正
后的细胞相对原始突变的细胞具有一定选择的优
势，因此，该技术介导突变基因 IL2RG的纠正可
为该疾病的基因治疗提供新的前景。2014年，
Genovese等 [43]首先通过细胞因子对 HSCs细胞进
行 48 h的预刺激，目的有两个：一是降低预处理的
细胞对核酸酶的进入引起的毒性效应的敏感性；二
是促使细胞进入到细胞周期介导同源重组。随即在
第二天利用非整合型慢病毒载体将用于对突变基因
IL2RG纠正的 DNA模板导入细胞中，随后通过电
击方法对细胞进行锌指核酸酶基因转染。此外，为
了保持干细胞状态，避免其过早分化，该课题组成
员用两种芳 (香 )烃受体蛋白抑制剂 dmPGE2和
SR1处理了细胞，这一实验方案使得研究人员在
HSCs细胞中实现位点特异性基因组编辑，并在免
疫缺陷小鼠模型体内证实，经 ZFN修饰的 HSCs可
以维持正常的造血功能并生成有功能的淋巴细胞。
这一可喜成果为治疗 SCID-X1和其他基因缺陷疾
病开辟了一条新途径，解决了 HSC这些静息细胞
编辑效率低下的局限。Matsubara等 [44]利用 TALEN
技术在 IL2RG基因缺陷的细胞模型中也成功实现了
基因的纠正。
2.1.6　镰刀型细胞贫血症(sickle cell anemia, SCD)
血红蛋白疾病是由血红蛋白分子突变致使结构
或合成异常引起的一类疾病，包括血红蛋白病和地
中海贫血两大类。前者表现为镰刀状贫血症，其血
红蛋白分子的珠蛋白肽链结构异常，主要是由人 β
球蛋白基因 (human β-globin)点突变引起的遗传性
疾病。研究人员基于 ZFN技术针对致病基因 HBB
进行修饰 [45-46]，试图从基因修复这一角度验证该项
技术是否可以对突变基因进行替换，结果显示该项
技术介导突变基因HBB的纠正效率达到 40%，同时，
未检测到明显的脱靶现象，而且纠正后的细胞的分
化潜能依然存在。最近，Suzuki等 [47]基于 TALEN
技术以患者皮肤细胞来源的 iPSCs中的突变 HBB
基因为靶点进行纠正，通过 HR途径在识别靶位点
处插入外源片段利于重组子的筛选，为了不在基因
组中留有异常序列 (ectopic sequences)，通过转座酶
将其从基因组中再剔除。经 TALEN纠正后的
hiPSCs可以保持完整的分化潜能和正常的核型。最
新结果显示，分别使用第三代腺病毒载体 (helper-
dependent adenovirus vector, HDAdV)、TALEN 和
CRISPR/Cas9三种不同工具，对 SCD患者的 hiPSC
中的突变基因 HBB进行纠正，这 3种基因纠正方
法介导的打靶效率相近。此外，全基因组深度测序
结果显示，TALEN和 HDAdV在对突变基因纠正
过程中显示的脱靶效应较低。为了能够提高基因靶
向修饰效率，研究人员将 TALEN和 HDAdV整合
在一起，构建一种兼有特异切割基因组 TALEN和
高效导入途径的 HDAdV整合载体。实验结果表明，
重组打靶载体介导的基因纠正效率要比单独使用
TALEN、CPRISPR高很多，相信该项技术的不断
优化，会在不同种类的血红蛋白疾病的基因修复过
程中得到广泛应用。
2.1.7　X连锁慢性肉芽肿病
慢性肉芽肿 (chronic granulomatous disease, CGD)
为少见的一种遗传性疾病，分为 X连锁 CGD
(X-CGD)和常染色体隐性遗传 CGD两种。X-CGD
为最常见的一种类型，其致病基因为编码还原型烟
酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADPH亚单位 gp91-
phox蛋白的 CYBB基因。研究人员通过 ZFN对
X-CGD症来源的 hiPSCs中的致病基因进行修饰，
结果显示纠正后的细胞分化形成的中性粒白细胞表
型与正常的很相似，具有抵抗外界菌源的作用 [48]。
2.1.8　血友病
血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾
生命科学 第27卷76
病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍、凝血
时间延长、终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患
者没有明显外伤也可发生“自发性”出血，分为血
友病 A、血友病 B和血友病 C 3种。血友病 B是一
种肝脏缺乏凝血因子 IX的 X-连锁的遗传出血性疾
病，主要特征为凝血因子 IX表达水平极低，不足
正常水平的 1%。多种基因治疗手段在该疾病前显
得束手无策。ZFN的出现为突变型凝血因子 IX表
达水平的修复提供了希望。Li等 [49]通过 AAVS病
毒载体将靶向凝血因子 IX的 ZFN导入其缺陷的人
源小鼠模型中，通过 ZFN介导 HR途径对突变基因
凝血因子 IX基因 F9进行替换，并以血浆中的凝血
因子 IX表达水平是否升高为最终纠正指标。结果
显示，经 ZFN介导修饰的小鼠的血液在近乎正常
的时间内凝结，这些小鼠中的凝血因子表达水平约
为正常水平的 6%~7%，足以维持正常的凝血功能。
而未经 ZFN介导修饰的小鼠维持正常凝血功能的
时间仅六周。Park等 [50]基于 TALEN技术在 hiPSC
细胞将含有 F8基因的 140 kb染色体片段倒置，旨
在建立人源化的小鼠血友病 A模型。此外，为了能
够更好地验证 TALEN技术可以纠正该疾病致病基
因，研究人员再次通过 TALEN基因编辑工具将其
之前倒置的 140-kb的染色体片段再重新恢复到正
常，结果显示经 TALEN纠正修饰的疾病细胞可以
检测到 F8基因的 mRNA，而未经 TALEN介导修
饰的细胞却未检测到 F8基因的 mRNA。该项结果
提示，TALEN基因编辑工具既可以建立疾病模型，
又可以介导疾病的再次纠正。
2.1.9　β-地中海贫血症
β-地中海贫血症 (β-Thalassemia, β-Thal)是由
于编码 β珠蛋白的基因突变或是碱基缺失造成的一
种血液病。全球约有 4.5%的人群携带有这种突变
基因，对全球卫生健康构成一定的威胁。纠正疾病
基因将是此疾病治疗的一个理想靶点。Ma等 [51]以
患者来源的 hiPSCs为靶细胞，通过 TALEN技术对
疾病基因 HBB进行纠正，用以完成对疾病基因的
治疗。结果显示，该项技术介导修饰的 hiPSCs中
的突变基因得到修复，同时，这些细胞保持着分化
成造血干细胞的潜能，进一步形成能够正常表达 β
珠蛋白的成红血细胞。
2.1.10　遗传酪氨酸血症
遗传酪氨酸血症 (hereditary tyrosinemia)，又称
先天性酪氨酸血 (症 )，是一种因富马酰乙酰乙酸盐
水解酶 (fumarylacetoacetate hydroxylase, FAH)缺乏
引起的酪氨酸代谢异常、肝严重损伤及肾小管缺陷
的常染色体隐性遗传性临床综合征。急性患者有肝
大、肝细胞脂肪浸润或坏死症状；慢性患者可有肝
纤维化、肝硬化，甚至发生肝癌。Yin等 [52]利用
CRISPR/Cas9技术对携带突变 FAH酶的成年小鼠
模型中的肝细胞中的突变基因 FAH进行纠正修复，
通过高压注射方法 (hydrodynamic injection)快速将
这些纠正后的细胞释放到静脉中，最后回流肝细胞
中用以纠正疾病。该项研究结果显示，纠正后的正
确基因插入到了 1/250的肝细胞中，在后续的 30天
中，正常 FAH基因的细胞正常增殖，取代病变的细
胞，最终占据约 1/3的肝细胞，使小鼠能够在脱离
NCTB药物后生存下来。
2.1.11　白内障遗传疾病
老化、遗传等因素会引起晶状体囊膜损伤使其
渗透性增加，丧失屏障作用或导致晶状体代谢紊乱，
使晶状体蛋白发生变性，形成混浊而导致白内障。
中科院上海生化与细胞所李劲松课题组选择小鼠白
内障遗传疾病模型进行研究。该模型小鼠携带显性
突变的 Crygc基因，随后因产生变性的晶状体蛋白
而发生晶状体混浊，携带一个突变位点的新生小鼠
即表现出症状。研究人员利用 CRISPR/Cas9技术设
计针对突变基因的单导向 RNA，将它与 Cas9核酸
酶直接注入受精卵，发现 1/3新生小鼠的白内障症
状得到治愈。白内障小鼠治愈后，也能通过生殖细
胞将修复的基因传递给下一代，证明白内障遗传疾
病可被根治 [53]。
2.2　传染性疾病
2.2.1　艾滋病
艾滋病病毒 (HIV)感染细胞需要首先与主受体
外的辅助受体 CCR5/CXCR4结合。“柏林”患者的
成功治愈提示了通过 CCR5/CXCR4敲除产生修饰
细胞对 HIV耐受的基因治疗的可能性。
2.2.1.1　CCR5靶点
对于 HIV-1基因治疗而言，敲除 CD4+T细胞
和 CD34+HSCs细胞表面的 CCR5分子是一个理想
的出发点。Perez等 [54]通过 ZFN介导 50%的原代
CD4+T细胞表面的 CCR5分子敲除，脱靶效率
<5%。经体外扩大培养修饰的 CD4+T细胞回输到免
疫缺陷 NOG小鼠后，表现出明显的抗病毒能力。
Holt等 [55]通过核转将 ZFN导入 CD34+HSCs细胞
对 CCR5基因进行定点修饰，并将修饰后的 HSCs
回输到免疫缺陷的 NSG小鼠中，发现小鼠体内免
疫细胞被激活、数量增多，表现出良好的抗病毒效
季海艳，等：基因编辑技术在基因治疗中的应用进展第1期 77
果。ZFN介导的 CCR5基因修饰已经在人类造血干
细胞中取得成功。Yao等 [56]相继证实 ZFN也可以
在 ESCs和 iPSCs中对 CCR5基因进行定点修饰。
此外，Lambardo等 [57]利用非整合型慢病毒 (integrase-
defective lentiviral vector, IDLV)载体介导 ZFN靶向
修饰 HSCs细胞中的 CCR5基因，纠正效率约为 5%。
在后续报道中，该课题组利用 Ad5/35嵌合型腺病
毒载体介导 ZFN对原代 T细胞 (primary T cells)、
人类神经干细胞 (human neural stem cells, hNSCs)和
iPSCs中的 CCR5基因进行纠正。Li等 [58]在体外通
过腺病毒介导 ZFN靶向修饰经蛋白激酶 C刺激的
成人造血干细胞 (adult hematopoietic stem cells, adult
HSCs) 表面的 CCR5，敲除效率 >25%，回输到
NSG小鼠模型后表现出抗HIV/AIDS的能力。最近，
由宾夕法尼亚大学医学院 Pablo Tebas研究小组 [59]
采用 Sangamo BioSciences公司开发的靶向 CCR5
基因的 ZFN (SB-728-T)对从 12名 HIV感染者体内
提取的未被感染的 T细胞进行修饰，并回输到患者
体内用以检测抗感染效果。研究人员将这 12名感
染者分为两组，每组 6人，每人一次性输入 100亿
个 T细胞，其中一组 4周后停止服用抗逆转录病毒
药物 12周。结果表明在停药的 6名感染者中，4人
体内的 HIV病毒数量变少，1人由于先天存在
CCR5突变基因使得病毒检测结果显示阴性，提示
基因编辑技术治疗艾滋病的有效性及可行性。
Ye等 [60]利用 TALEN和 CRISPR/Cas9技术以
人源 CCR5基因为靶点，在 hiPSC中形成 CCR5天
然缺失的突变细胞，并将其诱导成单核巨噬细胞。
结果显示，CRISPR/Cas9和 TALEN对单等位基因
敲除效率为 100%，而对双等位基因的敲除效率分
别为 14%和 33%，均获得了抗 HIV-1的单核巨噬
细胞。相对之前的 HIV-1基因治疗而言，这种方法
克服了 HSC细胞分离困难的局限，可以利用正常
健康的 hiPSC细胞诱导分化成 CCR5δ32缺失的抗
HIV-1细胞，并剔除了 CCR5敲除位点整合的外源
基因，保留了 CCR5天然缺失的基因组痕迹。
2.2.1.2　CXCR4靶点
随着对病毒感染过程的研究深入，研究人员发
现 CCR5分子并不是 HIV-1病毒感染所需的唯一辅
助受体，CXCR4为病毒后期感染靶细胞的重要分
子。因此，单纯以 CCR5分子为靶点阻断病毒感染
是行不通的，需要寻找阻断 CXCR4-病毒感染的方
法。Doms课题组首次利用 Ad5/35型嵌合型病毒载
体介导 ZFN靶向修饰 CD4+T细胞表面的 CXCR4
分子，体外检测发现 CXCR4分子表达量减少，
CD4+T细胞功能正常且对 CXCR4-病毒株表现出抗
病毒能力，将此纠正后的 CD4+T细胞回输到 NSG
小鼠后检测到具有一定的抗病毒能力 [61]。Yuan等 [62]
相继将 shRNA干扰和 ZFN介导修饰的 HSCs回输
到小鼠体内，比较抗病毒效果。结果表明，前者在
一定程度上可以降低 CXCR4分子的表达量，但是
并未敲除，所以病毒还有继续感染的机率；后者可
以对 CXCR4分子进行敲除，从而阻断病毒感染，
抗病毒效果显著。
上述策略是基于 ZFN 介导 CCR5 或 CXCR4
基因突变的细胞回输到体内对病毒产生抵抗能力。
目前，利用该技术介导 CCR5基因敲除的研究已
进入临床 I期试验 (NCT00842634、NCT01252641、
NCT01044654)。而最新研究成果揭示，艾滋病毒
感染者自体 CD4 T细胞 CCR5基因经过编辑后可以
再次回输到感染者体内，即使在不服用药物的情况
下也能将该病毒拒之门外。改造 T细胞可以免于使
用抗逆转录病毒药物并向 “功能性治愈 ”艾滋病方
向迈进。但是，这一令人振奋的消息之后仍存在一
定的不足：(1) ZFN(SB-728-T)介导 CCR5基因纠正
的细胞需经过体内回输，在一定程度上也比较耗时；
(2)该项技术是对艾滋病毒感染者自体 CD4 T细胞
CCR5基因进行编辑，产生抗病毒能力，但是对
CXCR4-病毒株却没有抵抗作用，而敲除 CXCR4
分子并非最佳的选择，因其参与体内多种生理机制，
如 T细胞归巢、造血功能，胚胎发育等；(3)ZFN
技术介导修饰后的靶细胞是耐受性细胞，可以将病
毒拒之门外，但是，已整合在宿主细胞基因组中的
HIV-1前病毒却难以根除。残余存在的病毒势必会
再次出现反弹，而根除这些感染或者潜伏在宿主基
因组中的残余 HIV-1病毒又是抗 HIV/AIDS治疗的
关键。
2.2.1.3　HIV前病毒
高效抗逆转录病毒治疗 (HAART) 能显著改善
HIV感染者的生存率，但该疗法并不能完全治愈患
者，其重要原因是目前抗病毒药物仅能抑制 HIV-1
病毒的复制，并不能对感染的免疫细胞基因组中已
整合的 HIV前病毒 DNA起作用。而整合的 HIV前
病毒 DNA，不仅在感染细胞中被作为病毒基因转
录的模板，而且在潜伏感染细胞中也是病毒长期潜
伏的基础以及患者停药后病毒再次反弹的根源。因
此，如何靶向清除整合在宿主靶细胞染色体上的
HIV前病毒是目前 HIV/AIDS治疗研究领域最富有
生命科学 第27卷78
挑战性的科学问题。倘若能使整合的 HIV前病毒从
宿主靶细胞基因组上缺失，那么，则可从根本上解
决 HIV/AIDS不能治愈的问题，实现“斩草除根”
的梦想。2013年，复旦大学朱焕章教授课题组设计
并获得了一对能特异靶向多数 HIV亚型基因保守区
LTR (long terminal repeat)的 ZFN，在多个 HIV感
染及潜伏细胞系上证实了 ZFN能特异靶向 HIV-1
前病毒 LTR，并介导整合的全长 HIV-1前病毒的高
效切除，获得了显著抗 HIV感染的效果，提示该方
法将可能为一个可选择的根除 HIV的治疗手段 [63]。
潜伏在基因组中的 HIV-1前病毒是病毒再次攻击免
疫细胞的杀手，为了能够将潜伏的 HIV-1前病毒靶
向性激活，朱焕章教授课题组利用转录激活结构域
VP64和特异结合 HIV-1 LTR的锌指蛋白相融合，
在多种 HIV-1前病毒潜伏感染的细胞模型中激活隐
藏的前病毒，同时证实锌指蛋白对细胞增殖、细胞
周期没有影响 [64]。该方法将可以和抑制病毒复制
的药物联合使用为抗 HIV/AIDS治疗提供一条新的
路径。
Elbina等 [65]利用 CRISPR/Cas9技术以 HIV-1
病毒的 LTR靶点，在病毒潜伏感染的细胞模型中验
证 CRISPR/Cas9介导 HIV-1前病毒基因组的敲除效
率可达 20%。 2014年，Hu等 [66]利用 CRISPR/Cas9
技术以 HIV-1病毒基因组的 LTR为靶点，在潜伏感
染的小神经胶质细胞、前体单核细胞和 T细胞中证
实 CRISPR/Cas9技术介导潜伏在宿主细胞中的
HIV-1前病毒基因组的根除，同时又证实该项技术
介导病毒基因组的敲除对宿主细胞没有产生毒性。
2.2.2　乙型肝炎
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒 (HBV)感染所引
起的传染疾病，目前仍缺乏有效治疗手段。Cradick
等 [67]设计针对 HBV特异性的 ZFN在基因组特异
位点进行切割，导致至少 36%的病毒基因组失活
和 30%的前病毒基因组 RNA表达下调。该项结果
提示，在今后的 HBV基因治疗中可以应用病毒载
体高效导入 ZFN用以提高切除病毒基因组的效率。
Bloom等 [68]利用 TALEN技术靶向 HBV基因组中
的特异位点，实现约 35%的共价闭合 DNA的突变，
在后续的小鼠模型实验中进一步验证 HBV病毒的
复制受到抑制；此外，他们也对 TALEN介导修饰
的细胞的做了安全评价，结果显示在人类基因组中
可能脱靶位点处并未检测到突变。随后，复旦大学
袁正宏教授课题组利用最新的 TALEN技术，设计
具有靶向不同基因型 HBV保守区序列的 TALEN，
在体外细胞和小鼠模型验证 TALEN可以特异结合
靶序列并切割 HBV基因组；此外，该课题组还发
现 TALEN基因靶向敲除技术和干扰素的结合应用
可以增强对病毒复制的抑制效果 [69]。这项成果不仅
为 HBV治疗领域提供新的思路，也会为其他病毒
引起的疾病的治疗研究提供更广泛的平台。
3　癌症
癌基因以及它们的作用机制在过去的几十年里
已被确定。癌基因和突变型的肿瘤抑制因子将成为
ZFN对癌细胞修饰的靶点。ZFN已成功对特异性的
肿瘤生长因子表达水平进行下调或是对突变型
TP53基因的替换。在经长春花碱处理和未处理的
K-562细胞中分别转入 OPEN技术平台筛选针对肿
瘤血管内皮生长因子 (tumor angiogenic factor vascular
endothelial growth factor A, VEGFA)的 ZFN，结果
显示，处理细胞组中 ZFN介导修饰效率为 7.7%，
而未处理细胞组为 54%[70]。此外，通过 ZFN技术
在肿瘤细胞模型对突变型 TP53基因的纠正效率约
为 0.1%。以上结果显示，HR途径在肿瘤细胞中的
纠正效率不是很理想，但是对肿瘤细胞的基因治疗
还是提供了路径 [71]。为了能够提高 ZFN在癌细胞
中的纠正效率，需要寻求一种高效导入工具和生物
活性高的候选 ZFN，相信在不久的未来，肿瘤基因
的治疗将会有很大程度的进步。
上述是以癌细胞生长相关的基因为靶点，除此
之外还可以以 T细胞表面受体为靶点间接杀伤肿瘤
细胞。肾上腺糖皮质激素受体在各种细胞表面广泛
分布，而肾上腺糖皮质激素受体与配体结合后会在
不同的细胞表面引发不同的细胞反应。肾上腺糖皮
质激素与 T淋巴细胞表面受体结合会影响 T淋巴细
胞的免疫活力。Reik等 [72]利用 ZFN将 CD8阳性
的毒性 T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)表
面的肾上腺糖皮质激素受体突变，使其活性失活而
不能与其受体结合，最终得到有免疫活力的 CD8阳
性毒性T淋巴细胞，应用于恶性脑胶质瘤的免疫治疗，
该成果已经进入 1期临床试验阶段 (NCT01082926)。
HPV (human papillomavirus)感染和人子宫颈癌
的发生密切相关，HPV致癌作用的主要基因为 E6、
E7。癌蛋白 E6和 E7通过与 P53和 Rb蛋白作用使
后者失活，导致细胞周期调节紊乱。以 E6、E7为
靶点将是 HPV基因治疗研究领域中的理想靶点。
Zhen等 [73]利用 CRISPR/Cas9技术介导 E6/E7基因
的启动子区域和编码基因的敲除，在建立的肿瘤小
季海艳，等：基因编辑技术在基因治疗中的应用进展第1期 79
鼠模型中证实，经 CRISPR/Cas9技术介导纠正的宫
颈癌细胞生长受到抑制。该项成果为 HPV诱发的
宫颈癌或是 HPV相关的癌症治疗提供了应对策略。
4　存在的问题和展望
与传统的同源重组技术相比，基因编辑技术提
高了基因靶向修饰的效率，为疾病的基因治疗提供
了有力的手段。倘若要应用到临床试验中，仍需要
解决譬如脱靶切割、基因导入等问题。
4.1　脱靶效应
ZFN脱靶效应部分是由于锌指结构域的非特异
性结合，部分是由于 Fok I核酸酶导致的。Fok I在
基因组中需形成二聚体才能发挥切割活性。同源二
聚体对细胞产生的毒性很大，人们设计出改造过的
Fok I二聚体界面以便尽量产生异源二聚体，可以
降低但是不能完全消除脱靶切割。此外，研究人员
试图通过体外筛选得到特异性较高的 ZFP，增强
ZFN对目标序列识别的特异性。还可以通过调控型
或特异性启动子调控 ZFN的表达水平，减少脱靶
切割造成的毒性。TALEN实现了能够识别基因组
中任意序列的目的，不需筛选，但是由于模块组装
长度的影响，造成分子生物学操作困难。倘若将
TALEN骨架中的非必要结构去除或者缩短，一定
程度上能减小其相对分子质量，但是对识别序列的
特异性是否造成影响仍不清楚，是否因此会降低或
增加脱靶切割造成的细胞毒性效应也未知。对
TALEN的脱靶效应尚没有进行仔细分析。奇特的
是，当 TALE与野生型 Fok I融合产生 TALEN时，
毒性相对较小。CRISPR/Cas9系统虽然能够高效靶
向修饰基因，但其较高的脱靶效应妨碍其进一步应
用，特别是在临床基因治疗上应用。通过改进
CRISPR/Cas9系统，利用 Cas9单切口酶和成对
sgRNA，在不降低基因突变效率的前提下，可有效
降低 CRISPR/Cas9系统在基因组上的脱靶效应。成
对 sgRNA的选择比较关键，两条 sgRNA结合不同
的 DNA链，其 PAM序列要以尾对尾 (tail to tail)出
现，并且两个 sgRNA结合的位点不能相隔太远，
Cas9切口酶会在每个 sgRNA结合的地方造成小小
的单链切口 (single strand break, SSB)。而在潜在脱
靶区域，单个 sgRNA造成的 SSB会通过碱基切除
修复方式精确修复该区域，不会引入突变。
4.2　基因导入系统
基因导入方法的不同依据特定的靶细胞或是组
织而言。细胞模型所需的转染方法多为脂质体、电
转两种；体内导入途径多倾向于病毒载体的借助。
目前，遗传性疾病的基因治疗方案大多借助逆转录
病毒载体，但其随机插入整合存在潜在的安全性风
险。非整合型慢病毒载体、腺病毒和腺相关病毒载
体的出现可以在一定程度上避免随机插入导致的风
险，降低细胞毒性。ZFN在诸多病毒载体借助下可
成功导入靶细胞，而 TALEN和 CRISPR/Cas9受到
重复单元和片段大小的影响，病毒包装方面可能相
对局限。此外，病毒载体导入体内做到真正靶向性
还是比较困难，如腺病毒颗粒在体内会被一些组织
吞噬，真正到达肿瘤组织的量却很少。因此，在基
因治疗领域改善和优化基因导入系统的靶向性和效
率、构建新的基因定点整合载体、提高原位纠错效
率是关键的。
总之，上述 3种基因编辑技术在细胞中应用时
大多数是通过 DNA修复途径中的非同源末端连接
实现靶基因的修饰，而利用同源重组介导对目的基
因的替换、删除的方案较少。在今后的基因编辑技
术发展中，倘若能够通过提高同源重组的效率，则
可实现高效的基因定向修饰；此外，针对这些基因
编辑工具引起的免疫反应和脱靶效应若能建立安
全、有效的检测手段，则会减弱对细胞造成的毒性；
最后，若能建立高效、安全的基因导入系统，在一
定程度上会大大提高基因靶向修饰效率，有望在基
因治疗领域中得到广泛的应用同时为人类疾病的治
疗带来更多的福音。
[参　考　文　献]
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