全 文 ：第25卷 第3期
2013年3月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 25, No. 3
Mar., 2013
文章编号：1004-0374(2013)03-0334-08
蛋白质组学技术在中药复杂体系研究中的应用
赵　霞1#，岳庆喜2*，谢正兰1#，李　铁1，黄国坚1，李井泉2，王　慧2*
(1 广西中医药大学附属桂林市中医医院，桂林 541004；2 中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所，上海 200031)
摘　要：系统生物学在中药复杂体系研究中的合理性和可行性已经得到了国内外中药研究者的广泛认可。
在后基因组的时代，蛋白质组学成为系统生物学研究的重要组成部分，近年来蛋白质组学在中药复杂体系
研究中的应用也已经有了很多成功的实例。现结合所在的实验室近年来开展的应用蛋白质组学技术对一些
中药复杂体系进行的研究工作和对蛋白质组学主要研究技术在中药复杂体系研究中的应用思路进行了综述
和探讨。
关键词：中药；蛋白质组学；生物信息学；系统生物学
中图分类号：R285.5；R446.1；Q816 文献标志码：A
The application of proteomics in the research
of traditional Chinese medicine complex system
ZHAO Xia1#, YUE Qing-Xi2*, XIE Zheng-Lan1#, LI Tie1, HUANG Guo-Jian1, LI Jing-Quan2, WANG Hui2*
(1 Guilin TCM Hospital of China, Guangxi University of Chinese Medicine, Guilin 541004, China; 2 Institute for
Nutritional Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China)
Abstract: The feasibility and rationality of systems biology on the research of traditional Chinese medicine
complex system have been well accepted by Chinese herb researchers in the world. In post-genomic era, proteomics
is the most important part of systems biology. Recently there are some successful cases of using proteomic
techniques in traditional Chinese medicinal research. In this review, based on the recent years’ research work, the
authors documented and discussed the possible application ideas of the main techniques of proteomics in the
research of traditional Chinese medicine complex system.
Key words: traditional Chinese medicine; proteomics; bioinformatics; systems biology
收稿日期：2012-08-06； 修回日期：2012-09-21
基金项目：桂林市科学研究与技术开发计划项目(2012-
0407-1)；中国博士后科学基金资助项目(2012M51-
0907)；中国科学院上海生命科学研究院博士后研究资
助项目(2012KIP516)；2012塞诺菲-安万特-中国科学院上
海生命科学研究院优秀青年人才在站博士后奖励基金
#共同第一作者
*通信作者：岳庆喜，E-mail: qxyue@sibs.ac.cn，Tel:
021-54920980；王慧，E-mail: huiwang@sibs.ac.cn，
Tel: 021-54920941
中药是我国传统文化的宝贵财富，中药治疗的
有效性吸引了无数从事现代药学研究和开发的科学
家及制药公司的极大兴趣。他们已在中药化学、药
理和制剂等领域中取得了令人瞩目的成果，如抗疟
疾药物青蒿素、抗白血病药物三氧化二砷、抗肝炎
药物五味子甲素以及抗老年痴呆药物石杉碱甲等都
是从传统中药中寻找单一有效成分的成功范例。中
药包括复方的现代化研究是中医药界近年来关注的
焦点和研究的热点，但由于中药的来源具有多样性
以及其临床应用形式多以复方为主，所以，中药的
复杂性致使研究其药效物质基础和作用机制非常困
难。中药复杂体系的研究需要以中医传统的理论体
系为指导，借助现代生物医学的研究方法，通过多
视角切入、多技术辅助、多学科渗透交叉，才能够
全面、系统、准确地阐明中药及其复方的作用靶点、
作用环节和作用过程。
2007年 7月，Nature 杂志一篇专门谈论中医
赵　霞，等：蛋白质组学技术在中药复杂体系研究中的应用第3期 335
药的文章指出“中医药要取得突破性进展必须依靠
系统生物学技术”[1]。系统生物学的技术平台包括
基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等。
系统生物学已成为目前中药现代化研究的热点，它
为中药复杂体系的研究提供了崭新的思路和方法。
迄今为止，不少科研工作者在系统生物学研究思路
指导下开展了对中药复杂体系的研究。蛋白质组学
(proteomics)是系统生物学的重要组成部分；蛋白
质组学研究是生命科学研究进入后基因组时代的里
程碑，同时也是功能基因组时代生命科学研究的核
心内容之一。本文综述了目前将蛋白质组学应用于
中药复杂体系研究的一些成功实例和研究思路。
1　蛋白质组学的概念、技术和研究内容
在静态基因组碱基测序完成之后，系统生物学
已经进入了后基因组学时代，蛋白质组学等功能基
因学的研究目前已成为系统生物学研究的重点。澳
大 利 亚 Macquarie 大 学 的 Wilkins 和 Williams 在
1994年第一届意大利锡耶纳蛋白质会议上最早提出
蛋白质组 (proteome)的概念 [2]。蛋白质组 (proteome)
是指细胞、组织或生物体中的完整基因组所对应的
全套蛋白质，而研究细胞、组织或生物体蛋白质组
的组成及其变化规律的科学被称为蛋白质组学
(proteomics)。蛋白质组学的研究方法分为两大类，
即基于蛋白质的蛋白质组学 (以双向电泳分离结合
质谱鉴定为例 [3])和基于肽的蛋白质组学 (以酶解
后直接进行液质联用分析为例 [4])。蛋白质组学的研
究内容包括表达蛋白质组学、结构蛋白质组学、比
较蛋白质组学和功能蛋白质组学。
2　蛋白质组学在中药复杂体系研究中的应用
由于疾病的发生和药物治疗靶点大多数是在蛋
白质 (包括酶、受体及信号转导蛋白 )水平，因此，
蛋白质组学适用于研究药物的作用机制、寻找有效
的药物靶点以及开发新药。根据已有的文献报道，
蛋白质组学在中药复杂体系研究中的应用包括以下
三方面的内容：(1)通过比较正常状态、疾病状态
以及中药单体化合物、有效部位或复方提取物治疗
后蛋白质组表达的差异，寻找与其作用可能相关的
靶点蛋白；(2)运用反向对接等生物信息学方法 (例
如 INVDOCK技术 )预测中药单体化合物可能直接
结合的靶点蛋白，同时通过化合物和蛋白质相互作
用的方法 (例如化合物与蛋白质共结晶 X射线衍射
技术、蛋白质结合位点序列定点突变技术、表面等
离子体共振技术等 )进行验证；(3)根据比较蛋白质
组学的结果，结合在蛋白质相互作用数据库中与中
药 (包括中药单体化合物、有效部位或复方提取物 )
作用相关的蛋白信息，通过生物信息学的手段绘制
出与中药作用相关的蛋白质相互作用信号网络，同
时运用生物学的实验方法 (例如基因过表达技术、
RNA干扰技术等 )对蛋白质相互作用信号网络中的
关键蛋白进行功能验证。
2.1　中药作用相关靶点蛋白的寻找
通过比较对照细胞或动物组织的蛋白质表达谱
和给予中药后蛋白质表达谱的差异，可以寻找到与
中药作用相关的靶点蛋白。目前，蛋白质组学在中
药研究中的应用实例大部分属于此类，该方法已被
用于中药单体化合物、有效部位及复方提取物作用
机制的研究。
2.1.1　中药单体化合物作用相关靶点蛋白的寻找
2003年，MacKeigan等 [5]通过蛋白质组学技
术发现MEK抑制剂和紫杉醇 (paclitaxel/taxol)合用
时改变了 RhoGDIα (Rho GDP-dissociation inhibitor
α) 和 RS/DJ-1 (RNA-binding regulatory subunit/DJ-1
PARK7)蛋白的表达；2004 年，Wenzel等 [6]通过蛋
白质组学技术发现槲皮素 (quercetin)促进人结肠癌
HT-29细胞凋亡和分化的分子机制；2005年，Lee
等 [7]利用蛋白质组学的方法研究了紫杉醇作用于人
宫颈癌 HeLa细胞可能的靶点蛋白；2006年，Wang
等 [8]利用蛋白质组学技术研究了从湖北黄精中提
取的薯蓣素 (dioscin)对于人髓系白血病 HL-60细胞
毒性的分子作用机制；2006年，Ha等 [9]通过蛋白
质组学技术阐明从远志科植物乌棒子 (Polygala
caudata)中分离的单体化合物 euxanthone诱导小鼠
成神经细胞瘤 2a细胞分化的分子机制；2006 年，
Chen等 [10]利用蛋白质组学方法考察了芍药苷
(paeoniflorin)对于局部缺血性中风模型大鼠神经保
护的分子机制；2007年，Wang等 [11]进一步通过蛋
白质组学技术阐明薯蓣素 (dioscin)通过触发线粒体
氧化应激反应诱导 HL-60细胞的凋亡；2008年和
2010年，Yue等 [12-13]分别利用蛋白质组学技术研究
了中药灵芝单体化合物灵芝酸 D、B、F、K、AM1
(ganoderic acid D、B、F、K、AM1)对于人宫颈癌
HeLa细胞毒性的作用机制，发现了多种与灵芝酸
类化合物作用相关的靶点蛋白；2009 年，Wang等 [14]
利用蛋白质组学技术发现中药藤黄单体化合物 S型
藤黄酸 (S-gambogic acid)抑制人肝癌 HepG2细胞增
殖的靶点蛋白 stathmin 1；2010年，Cui 等 [15]运
生命科学 第25卷336
用蛋白质组学技术研究了中药灵芝单体化合物 9,11-
dehydroergosterol peroxide对于人宫颈癌 HeLa细胞
毒性的作用机制；2011年，Feng 等 [16]、Ma等 [17]
和 Xu等 [18]分别运用蛋白质组学技术考察了丹酚酸
B保护大鼠 H9C2细胞、离体血小板和心肌缺血再
灌注损伤模型大鼠的分子机制；2011年，Liu等 [19]
采用蛋白质组学技术考察了丹参酮 IIA保护阿霉素
造成的小鼠肾损伤的分子机制。
2.1.2　中药有效部位作用相关靶点蛋白的寻找
2008年，Yue等 [20]通过蛋白质组学技术阐明
了灵芝总三萜 (ganoderma triterpenes)与临床肿瘤化
疗药物阿霉素合用对于人宫颈癌 HeLa细胞毒性的
分子机制，其协同作用机制可能是通过增加氧自由
基和 DNA损伤以及诱导细胞凋亡从而杀死肿瘤细
胞；2008年，Yao等 [21-22]分别利用蛋白质组学技术
考察了与丹参总酚酸和三七总皂苷抗大鼠血小板聚
集作用相关的靶点蛋白；2008年，Ma等 [23]通过蛋
白质组学技术寻找到可能与灵芝孢子总多糖
(polysaccharides)刺激小鼠脾脏单核细胞增殖作用相关
的靶点蛋白；2008年，Cheng等 [24]分析了中药重楼
(Rhizoma paridis)中的总皂苷作用于人肝癌 HepG2细
胞 48 h后蛋白质组的表达变化；2009年，Ma等 [25]
又采用蛋白质组学技术寻找到与灵芝孢子多糖对抗
由环磷酰胺引起的小鼠胸腺组织免疫抑制作用相关
的靶点蛋白。
2.1.3　中药复方提取物作用相关靶点蛋白的寻找
2004年，Guo等 [26]研究了由熟地黄、当归、
白芍和川芎 4味中药组成的四物汤对于放射线照射
后导致的血虚证小鼠骨髓蛋白质表达谱的影响，结
果发现，四物汤发挥补血作用，可能通过调节骨髓
组织糖代谢和促进造血生长因子信号转导和造血细
胞的生长和分化，进而逆转放射导致的血虚证；
2006年，Wu等 [27]利用蛋白质组学技术阐明台湾
民间真菌药材樟芝 (Antrodia camphorata)乙醇提取
物抑制非小细胞肺癌 A549细胞增殖的分子机制可
能与内质网应激反应有关；2006年，Liu等 [28]研
究了由熟地黄、当归、白芍和川芎 4味中药组成的
四物汤对于由环磷酰胺导致的血虚证小鼠骨髓蛋白
质组的影响，结果发现四物汤可能通过影响与细胞
凋亡和造血祖细胞增殖分化相关的蛋白，进而促进
骨髓造血；2008 年，Wang等 [29]通过基因芯片和蛋
白质双向电泳等方法研究台湾民间药材狭叶紫锥菊
(echinacea purpurea)丁醇提取物作用于树突状细胞
引起的基因组学和蛋白质组学的变化；2008年，
Yang等 [30]运用蛋白质组学技术考察了由熟地黄、
当归、白芍和川芎 4味中药组成的四物汤对于血虚
证患者血清蛋白表达谱的影响，结果发现四物汤可
能通过增强免疫、增加血红蛋白、减轻基因损伤等
途径治疗血虚证。2009年，Lee等 [31]考察了由茵
陈蒿、大黄和栀子等中药组成的复方茵陈蒿汤 (Yin-
Chen-Hao-Tang)作用于由胆管结扎造成的肝纤维化
模型大鼠 27 d后肝脏蛋白质组的表达变化，结果发
现茵陈蒿汤治疗大鼠肝纤维化的作用机制可能与调
控脂类物质的生物合成抑制以及正常肝细胞的凋亡
有关。2009年，Nquyen-Khuong等 [32]考察了由中
药五味子、栝楼、大豆和西地格丝兰提取物组成的
混合物MINA-05作用于人膀胱癌细胞 72 h后蛋白
质组的表达变化，鉴定了多种与蛋白质降解、能量
代谢、细胞骨架以及肿瘤抑制相关的蛋白。2012年，
Yue等 [33]通过蛋白质组学技术考察了丹参多酚酸和
三七总皂苷联合应用对于心肌缺血再灌注损伤模型
大鼠的保护作用 [33]。
2.2　中药直接结合靶点蛋白的预测和验证
日益完善的蛋白质空间结构数据库使得运用生
物信息学技术和方法预测与中药单体化合物直接
结合的靶点蛋白成为可能，常用的蛋白质空间结
构数据库有 PDB、MMDB、ISSD、CATH、SCOP等；
其中，PDB (protein data bank)数据库是目前收录最
为详尽的蛋白质结构数据库，该数据库包含了通过
X射线晶体衍射和磁共振获得的蛋白质三维结构数
据。根据已知蛋白质的空间结构，可以采用小分子
配体搜索潜在结合蛋白的方法 (简称反向对接技术 /
inverse docking)预测中药单体化合物可能直接作用
的靶点蛋白 [34]。例如，Yue博士期间所在的实验室
采用反向对接软件 (INVDOCK)寻找能够分别与灵
芝酸 D和丹酚酸 B直接结合的靶点蛋白，结果表
明，14-3-3蛋白可能是灵芝酸 D直接结合的靶点蛋
白 [12]，而 EGFR蛋白可能是丹酚酸 B直接结合的
靶点蛋白 [16]。对于生物信息学预测的化合物直接作
用的靶点蛋白，还需要采用生物学实验方法进行验
证。Yue博士期间所在的实验室采用 BIAcore 3000
仪器通过体外表面等离子体共振技术 (surface
plasmon resonance, SPR)分别对灵芝酸 D与 14-3-3
蛋白以及丹酚酸 B与 EGFR蛋白或 integrin蛋白的
结合能力进行了验证 [12,16-17]。目前，作者已经通过
生物信息学手段获得多种与双氢青蒿素直接作用的
靶点蛋白。随后，作者将通过体外表面等离子体共
振技术对于双氢青蒿素直接作用部分靶点蛋白进行
赵　霞，等：蛋白质组学技术在中药复杂体系研究中的应用第3期 337
验证，同时采用生物学实验 (如 RNA干扰、基因
过表达、酶联免疫吸附和免疫共沉淀等 )对于部分
靶点蛋白的功能进行深入研究。
2.3　中药相关靶点蛋白相互作用信号网络的绘制和
验证
随着蛋白质相互作用研究技术 (包括酵母双杂
交、pull-down、免疫共沉淀、亲和色谱、表面等离
子共振等 )的发展，目前已经获得了大量的蛋白质
相互作用数据，如 BIND数据库 (http://bind.ca/)、
DIP数据库 (http://dip.doe-mbi.Ucla.edu/)和 STRING
数据库 (http://string.emb1.de/)。
在通过生物信息学预测并验证后获得化合物直
接作用的靶点蛋白以及比较对照和给予化合物后蛋
白质表达谱的变化而获得的差异表达的蛋白质信息
的基础上，利用蛋白质相互作用数据库绘制出该化
合物的靶点蛋白作用网络。例如，Yue博士期间所
在的实验室利用该方法分别绘制了灵芝酸 D和丹酚
酸 B的靶点蛋白相互作用信号网络 [12,16-17] 。对于网
络中一些预测的中间蛋白，可以采用生物学实验，
如 RNA干扰、基因过表达等，进行深入研究。绘
制靶点作用网络的方法特别适合中药的研究；最新
的研究理念认为不需要过度抑制或者激活某一条信
号通路或者生物网络，多种靶点蛋白低亲和力的相
互作用可能更有效和更安全地稳定整个网络 [35]，而
中药单体化合物、有效部位和复方均具有多靶点和
低亲和力调控生物信号网络的特性 [36]。目前，作者
通过整理已发表的与青蒿素及其衍生物 (双氢青蒿
素、青蒿琥酯、蒿甲醚和蒿乙醚 )抗肿瘤作用相关
的基因和蛋白与 GO数据库 (The Gene Ontology)中
生物学途径 (biological process)所涉及的蛋白相匹
配 [37]，分别构建了青蒿素类化合物诱导肿瘤细胞周
期阻滞和凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭转移以及
肿瘤新生血管生成，逆转肿瘤细胞耐药性以及青蒿
素类化合物参与肿瘤细胞氧化应激反应和炎症反应
相关的蛋白质相互作用网络。
3　蛋白质组学的新进展及其可能在中药复杂
体系研究中的应用
最近十年内新出现的蛋白质组学技术包括：双
向荧光差异凝胶电泳 (DIGE)结合质谱鉴定技术、
液相色谱串联质谱 (LC-MS)鉴定技术、“自下而上
(bottom-up)” 鉴定技术和“自上而下 (top-down)” 鉴
定技术。这些新的蛋白质组学技术今后都可以应用
于中药复杂体系的研究。
3.1　双向荧光差异凝胶电泳(DIGE)结合质谱鉴定
技术
目前，蛋白质双向组凝胶电泳是广泛应用于中
药复杂体系研究的蛋白质学技术。双向凝胶电泳
(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)技术是O’Farrell
等于 1975年首先创立，其原理是根据不同蛋白质
之间的等电点和相对分子质量不同分离蛋白质 [3]。
其中第一向蛋白质水平电泳是根据蛋白质的等电点
不同，在高压电场下进行等电聚焦电泳 (isoelectric
focusing, IEF)；第二向蛋白质垂直电泳则是常规的
十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-
PAGE), 其原理是根据蛋白质相对分子质量大小的
差异导致电泳迁移率的不同而达到分离蛋白质的目
的；最后，双向凝胶电泳的凝胶经过考马斯亮蓝染
或者硝酸银染后，一般一张胶上可以出现数百至上
千个蛋白质点 [38]；配有基质辅助激光解析 /电离的
飞行时间质谱 (MALDI-TOF)适用于鉴定通过双向
凝胶电泳分离的蛋白质点。由于双向凝胶电泳对于
蛋白质的分离结果比较直观，同时也便于采用计算
机进行图像软件分析处理，并具有与质谱分析鉴定
方法相匹配等优点，因此，双向凝胶电泳至今仍是
最常用、经典的蛋白质分离技术。不过，常规的双
向凝胶电泳也有很多不足之处：例如对靠近 IPG胶
条极端酸性或碱性蛋白质、疏水性蛋白、部分不溶
于样品缓冲液的膜蛋白、低丰度蛋白和相对分子质
量特小 (<8 000)或特大 (>200 000)蛋白的分离仍然
具有一定的困难；双向凝胶电泳的蛋白载样量有限
以及不同的蛋白质与染料的结合差异比较大都会影
响一些低表达蛋白的分离；同时，电泳结果需要染
色处理 , 此项操作费时和费力；此外，双向凝胶电
泳技术目前尚不能与质谱直接联用，从而难以实现
完全自动化操作 [39]。
近十年来，通用 (GE)公司在传统蛋白质双向
凝胶电泳技术基础上开发的一种新型的高灵敏度荧
光染料标记的双向电泳技术即凝胶内差别电泳
(differential in gel electrophoresis, DIGE)技术逐渐被
科研工作者广泛接受并应用 [40]。与传统双向凝胶电
泳技术相比较，DIGE技术的优点是在分析中引入
了内参，通过对于不同蛋白质样品 (包括目标蛋白
质样品和对照蛋白质样品 )标记上不同的荧光，将
标记不同荧光的蛋白质样品在同一块电泳胶内分
离，消除了胶与胶之间的差异，避免了在凝胶操作
过程中的人为性和偶然性，从而使获得的结果更可
信。同时它能获得比传统双向凝胶电泳更多的靶点
生命科学 第25卷338
蛋白信息，减少了电泳次数和缩短了实验时间。目
前，作者正在采用双向荧光差异凝胶电泳 (DIGE)
结合质谱鉴定的新型蛋白质组学技术检测和分析双
氢青蒿素作用于卵巢癌细胞蛋白质表达谱的变化，
寻找与双氢青蒿素抑制卵巢癌细胞上皮 -间质转化
(EMT)相关的蛋白。同时，根据蛋白质组学的实验
结果，通过生物信息学手段构建与双氢青蒿素抑
制卵巢癌细胞 EMT相关的蛋白质相互作用信号网
络，利用分子生物学和细胞生物学手段进行确认
和验证与双氢青蒿素作用相关的靶点蛋白及其下
游信号通路。
3.2　液相色谱串联质谱(LC-MS)鉴定技术
除了蛋白质双向凝胶电泳之外，液相色谱和质
谱联用 (简称液质联用，LC-MS或 LC-MS/MS)等
新技术将成为今后研究中药蛋白质组学的主流，其
中最常用的蛋白质组学技术是 shotgun蛋白质组学，
该技术的原理：复杂的蛋白质混合物先通过离子交
换色谱、疏水相互作用色谱或亲和色谱进行初步分
离，然后通过蛋白酶将初步分离得到的蛋白质消化
成多肽混合物，最后通过在线的一维或二维 LC-MS
或 LC-MS/MS进行鉴定 [41]。
液相色谱和质谱联用技术被分为基于无标签标
记和标签标记两种类型。无标签标记的液相蛋白量
化目的是为了提供没有引进任何标记形式的蛋白质
定量信息，其原则是为了在质谱输出结果中直接寻
找到蛋白质丰度的相关指标。目前，已经开发出光
谱计数 (spectral counting)、蛋白质丰度指标 (protein
abundance index)、总离子色谱峰 (total ion chromatogram/
TIC)、重复和平均强度 (replicate and average intensity)
等一些有前景的无标签标记方法 [42]。在基于标签标
记的液相蛋白量化的方法中，可以通过体内代谢结
合和体外化学或酶结合的方法标记蛋白质样品，然
后通过比较离子信号的强度进行蛋白质定量分析。
通常，通过给予活细胞生长过程中所需要的同位素
标记的营养素，从而达到体内标记蛋白质的目的；
细胞体内标记蛋白的全过程同样也可以应用动物、
植物和微生物整体的标记 [43-44]。在体外，同位素
标签能够通过化学或酶学的方法标记蛋白质或多
肽。现在已经商品化可以直接应用于蛋白质组学研
究的同位素标签包括：iTRAQ (isobaric tag for relative
and absolute quantification)、18O incorporation、ICAT
(isotope-coded affinity tag)、isotope-coded protein labels、
AQUA (absolute quantification)和 Tandem Mass Tags。
iTRAQ 是一种很好的化学标记的同位素标
签 [4]，它能够被用于分析 4个 (4-plex iTRAQ kit)或
8个 (8-plex iTRAQ kit)不同的蛋白质样品。iTRAQ
试剂盒中的每一个标签都包含一个多肽反应的基
团、一个报告基团、一个平衡基团；其中，平衡基
团是用于补偿由于报告基团的存在而引起的蛋白质
相对分子质量的增加，从而保证所有待分析的蛋白
质分子具有相同的相对分子质量。在通过液相色谱
分离和质谱鉴定之前，每组实验样品中分别标记的
多肽需要相互混合。各组样品中相同的多肽在一级
质谱MS分析中出现单一的峰值，然而标签标记的
多肽在二级质谱MS/MS分析中被分裂成碎片，其
中在 4-plex iTRAQ试剂盒中，iTRAQ标签分别在
114.1、115.1、116.1 和 117.1 m/z处释放报告离子，
报告离子峰值能被用于计算蛋白和多肽的相对丰
度。基于 iTRAQ标记的 LC-MS鉴定技术的优点是
可以直接鉴定细胞或组织抽提液中的蛋白，它克服
了传统 2-DE技术的缺陷和不足，能够获得比传统
2-DE更多的蛋白质信息。Yue博士期间所在的实验
室正在运用液相色谱和质谱联用分析和鉴定 iTRAQ
标记的与中药抗肿瘤作用相关的蛋白，相关的研究
性论文不久将会被发表。目前，Thermo Fisher公司
生产的新型杂交型质谱 LTQ–Orbitrap是生物质谱研
究领域分析蛋白质组学最优秀的仪器之一 [45]；作者
现在正在运用液相色谱与 Thermo Fisher公司生产
的新型杂交型质谱 LTQ–Orbitra联用分析 iTRAQ标
记的与双氢青蒿素抑制卵巢癌细胞上皮 -间质转化
(EMT)相关的蛋白，寻找与双氢青蒿素抑制卵巢癌
细胞上皮 -间质转化相关的靶点蛋白。
3.3　“自下而上(bottom-up)”鉴定技术与“自上
而下(top-down)”鉴定技术
在传统的蛋白质质谱鉴定过程中，蛋白质首先
被蛋白酶 (通常是胰蛋白酶 )消化成为多肽，相关
的多肽再被断裂成碎片，最后通过质谱分析和鉴定，
这种分析方法被称为“自下而上 (bottom-up)”法。
目前，“自下而上 (bottom-up)”法已经被广泛应用
于蛋白质组学的研究。与“自下而上 (bottom-up)”
法相反的蛋白质组学分析方法被称为“自上而下
(top-down)”法；在“自上而下 (top-down)”蛋白质
质谱鉴定过程中，完整的蛋白质分子不需要先经
过蛋白酶的消化直接在气相中被鉴定，而带有多
种带电离子的蛋白质分子在串联质谱中作为前体
被鉴定 [46]。与“自下而上 (bottom-up)”法相比较，“自
上而下 (top-down)”法具有获得更多包含蛋白质完
整结构信息的优势。例如，获得 50%~70%的蛋白
赵　霞，等：蛋白质组学技术在中药复杂体系研究中的应用第3期 339
质序列覆盖范围 (sequence coverage)通常是 “自下
而上 (bottom-up)”法获得的理想结果，同时这也意
味着其他 30%~50%蛋白质序列信息对于研究者来
说是未知的；而“自上而下 (top-down)”法能够获
得比“自下而上 (bottom-up)”法更高的蛋白质序列
覆盖范围 (sequence coverage)。因此，当研究者需
要充分了解一种蛋白的多态性以及其翻译后修饰的
完整信息时，“自上而下 (top-down)”法则是一种很
好的分析方法。
“自上而下 (top-down)”法这一概念起源于
1990年，但它只在最近十年才得到充分的发展。尽
管由于仪器本身的高成本阻碍了其普及，但“自上
而下 (top-down)”法主要通过与“自下而上 (bottom-
up)”法的联合应用，巩固了其在蛋白质质谱分析鉴
定中的作用。在两者联合应用的研究中，“自下而
上 (bottom-up)”法被用于蛋白质的常规鉴定，而“自
上而下 (top-down)”法被用于单一蛋白质的多态性
和翻译后修饰的鉴定 [47-48]。今后，“自上而下 (top-
down)”法与“自下而上 (bottom-up)”法的联合应
用也可以用于研究中药复杂体系作用机制中蛋白质
的鉴定、量化、多态性以及翻译后修饰的分析。
蛋白质组学技术可以应用于小分子活性化合物
作用的多靶点蛋白的研究 [49]；目前，已有基于蛋白
质组学技术研究中药单体化合物作用的多靶点蛋白
的报道：Yue等 [12]通过传统的蛋白质组学技术系统
研究了从中药灵芝中提取的单体化合物 (灵芝酸 D、
B、F、K和 AM1)抑制人宫颈癌 HeLa细胞增殖和
促进其凋亡的分子机制，寻找到多种靶点蛋白，并
通过生物信息学手段构建了与灵芝酸 D作用相关的
蛋白质相互作用信号网络，其相关研究成果 2008
年发表于蛋白质组学研究领域的最高杂志Molecular
Cellular Proteomics，至今已被引用 67次。2008年，
陈竺和陈赛娟院士领导的课题组揭示了中药复方黄
黛片中的三种单体化合物硫化砷、丹参酮和靛玉红
联合应用于治疗急性早幼粒细胞性白血病 (acute
promyelocytic leukemia, APL)多靶点蛋白协同作用
的分子机制，首次在分子网络水平阐明了中药复方
的治疗机制 [50]；2010年，该课题组又运用化学蛋
白质组学技术发现了癌蛋白 PML-RAR是中药
As2O3 (俗称砒霜 )治疗 APL的直接药物靶点，揭
示了砷剂治疗 APL的分子机制 [51]。除了蛋白质双
向凝胶电泳，其他新兴的蛋白质组学技术也可以应
用于中药复杂体系研究中蛋白质鉴定、蛋白质量化
以及蛋白质异构体和翻译后修饰的鉴定。Van Eyk
等 [52]观察发现，通过不同蛋白质组学技术分析和
鉴定的蛋白重复率在 30%以下，因此，多种蛋白
质组学技术联合应用于中药复杂体系的研究，可以
增加蛋白质鉴定的数目和种类。
4　结语
历经 2000多年的临床应用，中药的有效性、
实用性和科学性已经勿庸质疑。中国中医科学院科
学家屠呦呦因其领导的团队在青蒿素的发现及其在
全世界范围内应用于治疗疟疾方面所做出的杰出贡
献而获得 2011年美国拉斯克－狄贝基 (Lasker
DeBakey)临床医学研究奖，中国工程院院士王振义
和中国科学院院士陈竺因其在应用传统中药砒霜
(三氧化二砷 )与西药 (全反式维甲酸 )结合治疗急
性早幼粒细胞白血病研究中取得的原创性成果以及
在该研究基础上开发的全新治疗方法而获得 2012
年美国第七届圣 •乔奇 (Szent-Györgyi)癌症研究
创新成就奖，这些都是传统中药应用于临床的成
功范例。
目前，系统生物学应用于中药复杂体系研究的
合理性和可行性已经获得广大中药研究者的认可 [53]。
在后基因组学时代，作为系统生物学研究的重要组
成部分的蛋白质组学也是系统生物学领域研究的热
点，蛋白质组学在中药复杂体系研究中的应用将会
给中药的发展带来巨大的空间。需要强调的是，尽
管蛋白质组学技术已被证实了是鉴定小分子活性化
合物靶标分子的一种非常有用的工具 [49]，但在中药
作用机制的研究中，蛋白质组学技术仍然需要被调
整去适应于更复杂的样品或者实验条件。因此，开
发适用于中药复杂体系作用机制研究的高通量蛋白
质组学研究方法是必需的。此外，还需要建立和分
享包含与中药作用可能相关的靶点蛋白的公用数据
库 [54]。目前，蛋白质组学技术运用于中药复杂体系
作用机制的研究仍然处于早期阶段。为了阐明中药
复方中不同组分之间配伍可能产生的协同效应，作
者认为：首先，需要分析中药材中不同化合物之间
的相互作用；然后，需要分析中药复方中不同中药
材之间的相互作用；最后，需要开发适用于蛋白质
组学数据分析的生物信息学工具，该工具可用于分
析与中药复方中不同组分作用可能相关的靶点蛋白
之间的相互作用。相信随着自身技术的不断发展，
蛋白质组学将更有助于中药复杂体系物质基础和作
用机制的阐明，从而更好地为中药的现代化和国际
化服务。
生命科学 第25卷340
[参　考　文　献]
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