全 文 ：第25卷 第9期
2013年9月
Vol. 25, No. 9
Sep., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)09-0843-10
病毒准种多样性及其在免疫选择压作用下的演变
崔治中
(山东农业大学动物医学院，泰安 271018)
摘　要：对人与动物 RNA病毒的基因组准种多样性的研究进展作了简单综述，特别详细概述了在体外模
型中对我国常见 4种动物 RNA病毒与病毒中和反应密切相关的蛋白基因在抗体免疫选择压作用下演化规
律的研究进展，还就病毒在免疫选择压下演变规律的研究对动物疫病防控的指导意义作了讨论，也对病毒
准种多样性的深入研究提出了展望。
关键词：动物 RNA病毒；准种；免疫选择
中图分类号：R392.1；Q939.47 文献标志码：A
Multiplicity of viral quasispecies and its evolution
under selective pressure of antibody immunity
CUI Zhi-Zhong
(College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)
Abstract: Progresses in genome quasispecies multiplicity of human and animal RNA viruses were reviewed, and
especially recent studies in evolution of common animal RNA viruses in their viral neutralization-related protein
genes under the selective pressure of antibody immunity in the in vitro models were described. Possible influence of
virus evolution under immune selective pressure on prevention and control of animal viral diseases was discussed,
and the futher studies on viral quasispecies multiplicity were suggested.
Key words: animal RNA viruses; quasispecies; immune selection
收稿日期：2013-04-26
基金项目：国家自然科学基金面上项目(30270060，30-
671571)；农业公益性行业科研专项经费项目(20-
0803019)
通信作者：E-mail: zzcui@sdau.edu.cn
准种 (quasispecies)的概念最初是作为模拟地
球上最初出现的大分子，如 RNA的演化模型提出
来的，后来由牛津大学的一批学者开始将病毒准种
(viral quasispecies)这个概念用于病毒研究，代表某
一病毒 (主要是某些 RNA病毒 )在同一个宿主体内
大量复制后形成的群体基因组遗传多样性 [1-6]。这
是因为 RNA聚合酶在 RNA复制过程中的自我纠正
功能较差，在病毒复制的几乎每一个循环，基因组
上都可能有碱基的突变。一个病毒粒子经几十次复
制循环后，很容易形成一个几乎由无限个体组成的
相互间极为相似但基因组上又有所差别的病毒准种
群体。
在体内环境的不同选择压作用下，特别是免疫
选择压作用下，这种病毒群体可逐渐向不同方向演
变。在该过程中，选择并不仅仅作用于一个单一的
突变体，而是作用于整个“准种”这一群体。“病
毒准种”是在突变与选择相互作用的平衡过程中形
成的非常类似的一群突变体，但它们相互间基因组
上已有不同的突变。这一群体之所以称之为“准种”，
主要是强调这个病毒群体的各个突变体间具有遗传
多样性，而且在同一宿主体内这一病毒群体最初仅
是由数量非常有限甚至只是一个病毒粒子复制而
来的。
20多年来，在病毒准种这个概念上，以人的
HIV (human immunodeficiency viruses)作为对象研究
得最多 [3,7-17]，主要关注的是患者的免疫反应与 HIV
∙ 评述与综述 ∙
生命科学 第25卷844
准种群体演变间的相互关系，关注免疫选择压对
HIV准种群体演变的影响，这与 HIV患者的病程
和结局密切相关。此外，对人的其他病毒的准种也
有类似研究，如人的乙型、丙型和戊型肝炎病毒等。
多年来，对病毒准种概念的大多数研究多为定性研
究。Woo和 Reifman[18]开始研究了 HIV感染患者在
细胞免疫的选择压作用下 HIV准种演变量化的数学
模型。
20多年来，对动物 RNA病毒的准种研究也
已积累了一些实验资料，特别是在口蹄疫病毒方
面 [19-20]。由于在现代规模化养殖企业中，不仅饲养
的动物群体很大，而且密度也很大，这就导致同一
种病毒不仅可以在同一动物群体中迅速传播，还可
能维持持续感染状态。因此，对动物的某些病毒传
染病来说，不仅每一个感染个体存在该病毒的准种，
同一病毒可能在该群体中形成相互相关的更大的准
种群。在过去几十年中，为了预防一些烈性病毒传
染病，我国的养殖业，特别是养猪业和养鸡业都一
直实施了高强度的疫苗免疫程序，有效地控制了疫
病的大流行，显著地降低了死亡率；但也为病毒的
变异建立了强大的免疫选择压环境，并由此可能促
发了我国动物群体中病毒的变异，特别是抗原性的
变异。这导致已有疫苗的免疫效果显著下降，不得
不持续不断地更新疫苗。一些 RNA病毒病尤为如
此，如 H5亚型高致病性禽流感、猪牛口蹄疫、猪
的高致病性蓝耳病、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎
等。本文将根据本实验室近几年的研究进展，对我
国常见的几种动物病毒的准种多样性及不同选择
压，特别是免疫选择压对病毒演化的影响作一综述。
借此，可以从一个新的角度来深入理解我国动物疫
病预防控制的难度以及疫苗免疫对动物疫病预防作
用的局限性。
1　猪繁殖与呼吸综合征病毒的准种多样性及
其在免疫选择压作用下的变异
猪繁殖与呼吸综合征病毒 (porcine reproductive
and respiratory syndrome viruses, PRRSV)是动脉炎
病毒属的一个种，其基因组为 15 kb的单股正链
RNA，引起一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪
的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。本病自
1987年首次报道以来，现已遍及世界各主要养猪国
家和地区，给全球的养猪业造成巨大的经济损失。
PRRSV基因组包含有 8个开放阅读框 (ORF)，其中
ORF5所编码的 GP5蛋白被认为是最重要的抗原蛋
白之一，也是其变异最快的一个基因。
为了研究 PRRSV野毒株 SD0612准种的多样
性，并比较其在有抗体的细胞培养上连续传代过程
中准种多样性演变规律，将 SD0612在 Marc-145
细胞上分别进行有抗 SD0612抗体和无抗 SD0612
抗体两个组连续传代，每组又包括 3个平行的传代
系列。连传 40~80代，将原始毒株及传代 40~80
代病毒的细胞培养物提取 RNA 并扩增和克隆
ORF5基因。每个病毒培养物样品选取多个阳性克
隆子测序，以此来比较原始分离病毒培养物在传代
过程中的准种多样性及其在抗体免疫选择压作用下
的演变规律。
1.1　SD0612株PRRSV的准种多样性分析
根据最易变的 ORF5基因，原始的 SD0612株
分离物是由核酸同源性介于 97.7%~100%的不同病
毒粒子组成的一个准种群。该准种群中 17/60个病
毒粒子 (28.8%)为 ORF5基因序列完全相同的优势
准种。在有抗体或无抗体的细胞培养上连续传代过
程中，该基因又分别存在着不同程度的 [21-22]准种多
样性变化 (表 1和表 2)。
1.2　在传代过程中抗体免疫选择压对SD0612演变
的影响
为了确定抗体免疫选择压对 PRRSV变异的影
响，将 PRRSV野毒株 SD0612在Marc-145细胞上
分两组连续传代：І组培养液中不添加抗血清，包
括 A、B、C等 3个平行的传代系；ІІ组培养液中
添加一定比例的抗血清，包括 D、E、F等 3个平
行的传代系。分别于各传代系列 10代、20代、30代、
40代收获病毒并对其 ORF3、ORF4和 ORF5进行
扩增、克隆和序列分析。结果显示：有抗体组在
ORF3、ORF4、ORF5分别出现了 4、2、9个可连
续遗传的点突变，上述突变除 ORF4外均为有义突
变；无抗体组则在 ORF4和 ORF5各出现了 1个可
连续遗传的点突变。无抗体组 ORF3、ORF4和
ORF5有义突变与沉默突变 (NS/S)比值分别为 1.30、
1.00、1.00，而有抗体组则分别为 11.00、0.50、13.00。
有抗体组传代过程中病毒的 ORF3，特别是 ORF5
突变如此高的 NS/S比，充分显示了抗体选择压的
作用。将上述传代过程中产生的突变株 F40按上述
方法进行第二轮抗体免疫选择压试验，结果显示，
有抗体组在 ORF3、ORF4、ORF5分别出现了 2、2、
6个可连续遗传的点突变，分别造成了 1、1、4个
氨基酸的变化；无抗体组则分别在 ORF3、ORF4、
ORF5出现了 1、2、5个可连续遗传的点突变，仅
崔治中：病毒准种多样性及其在免疫选择压作用下的演变第9期 845
表1 SD0612原始毒株及其传代过程中ORF5基因准种多样性的演变
组别 代次 克隆a 序列完全相 序列不完全 核酸d 核酸突e 优势准
系列 总数 同的克隆数b 同的克隆数c 同源性(%) 变位点 种比例f(%)
原始株 Ori 60 17 43 97.7~100 78 28.33
第一次传代
无抗体组 A40 27 3 24 98.5~100 35 11.11
B40 27 3 24 98.3~100 27 11.11
C40 28 5 23 98.7~100 46 17.85
有抗体组 D40 28 7 21 98.8~100 22 25.00
E40 28 9 19 99.0~100 20 32.14
F40 38 15 23 99.0~100 29 39.47
第二次传代
无抗体组 a40 27 5 22 99.0~100 34 18.51
b40 27 0 27 97.8~99.8 49 0
c40 28 3 25 98.5~100 39 10.71
有抗体组 d40 27 9 18 99.0~100 24 33.33
e40 36 16 20 99.0~100 36 44.44
f40 27 9 18 99.0~100 26 33.33
注："Ori"，SD0612原始株；a，所有测定可正确编码的ORF5克隆序列数：b，序列完全相同的克隆数；c，所有克隆相互之
间序列不完全不同；d、e，所指的核酸同源性及核酸突变位点为a列中所有克隆序列之间的比较和统计；f，优势准种的比例
指b列中序列完全相同的克隆数与a列中克隆总数的比值[22]。
表2 SD0612原始毒株及两次连续传代实验中不同组
ORF5优势准种比例的比较
组别 克隆总数a 序列完全相 优势准种
同的克隆数b 比例c(%)
原始株 60 17 28.33
第一次传代
无抗体组 82 11 13.41
有抗体组 94 31 32.98
第二次传代
无抗体组 82 8 9.76
有抗体组 90 34 37.78
注：c列优势准种比例为b列克隆数与a列克隆总数的比值[22]。
在 ORF5造成了 3个氨基酸的变化。无抗体组
ORF3-ORF5的 NS/S比值分别为 0.33、0.33、1.40，
有抗体组则分别为 3.50、0.67、4.00。再次显示，
ORF5最易在免疫选择压的作用下发生演变。上述
结果表明，抗体的免疫选择压是促使 PRRSV快速
变异的重要动力之一。抗体的选择压对 ORF5影响
最大，其次为 ORF3，而对 ORF4无影响。这也说
明 ORF5和 ORF3是 PRRSV与病毒中和反应关系
最密切的蛋白。
从表 1和表 2可见，SD0612株的原始毒株在
没有抗体的细胞上经 40~80次连续传代后，准种的
多样性在增加，表现为优势准种的比例下降。例如，
其中经传 80代的 b40的所有 27个克隆列中，没有
序列完全相同的克隆子；但在有抗体的连续传代中，
抗体的免疫选择压使 SD0612的准种多样性逐渐减
少，而其优势准种的比例在逐渐上升 (表 1和 2)。
而且，在抗体选择压的作用下，准种内的同源性升
高，但其优势准种随着传代次数的增加，其与原始
毒株优势准种的核酸同源性越来越低 [21-22](表 3)。
显然，抗体的选择压显著减少了 PRRSV的准种多
样性，并使某些准种演变为新的优势准种。
1.3　PRRSV在抗体选择压下抗原性的变异
利用 SD0612株病毒人工接种后康复猪血清分
别对该株病毒的原始毒及经 40和 80次连续传代的
病毒在细胞培养上做交叉病毒中和反应，结果表明
随着在有抗体的细胞培养上传代增多，其与原始毒
的抗原差异也增大了，即对 40代毒 (F40)和 80代
毒 (e40，来源于 F40)病毒的交叉中和反应的同源
性分别下降到 62.5%和 50%，F40与其进一步传 40
代的 e40间的同源性也只有 80%[21]。
2　J亚群禽白血病病毒gp85基因准种多样性及
其在免疫选择压作用下的演变
禽白血病病毒 (avian leucosis viruses, ALV)是
一类反转录病毒，可诱发鸡群的各种细胞类型的
急性和慢性肿瘤，其基因组为 8~9 kb长的单股正链
RNA。根据它们与病毒中和反应密切相关的囊膜
蛋白 gp85的抗原性，在鸡群中分离到的 ALV分别
生命科学 第25卷846
属于 A、B、C、D、E 和 J 亚群，其中以 J 亚群
ALV (ALV-J)的致病性最强。自 1990年以来，一直
是鸡群中流行和诱发肿瘤的主要亚群。而且，
ALV-J的 gp85基因也是最易发生变异的 [23-26]。根
据分子流行病学的研究，对 ALV-J的 gp85基因在
免疫选择压作用下演变已有多篇报道 [23-24,27-28]。
2.1　ALV-J在细胞培养和感染鸡体内的准种多样性
为了阐明 ALV-J的准种多样性，本实验室曾分
别对中国分离株 NX0101的感染性克隆病毒在细胞
培养上和感染鸡体内的 gp85基因的准种多样性作
了详细研究。在该感染性克隆病毒第 5代细胞传代
毒的前病毒 cDNA做 PCR的扩增产物的 10个克隆
中，它们的gp85基因的同源性在99.2%~99.9%之间，
说明病毒在细胞内开始复制时就出现了准种多样
性，只是经过 5次细胞传代后，病毒 gp85基因发
生的变异还不大 (李薛等，未发表资料 )。
然而，当将同样的病毒接种孵化 7 d的 SPF鸡
来源鸡胚，由此孵化出的部分鸡在 6月龄时出现肿
瘤。其中一只在肝脏、肺脏、肾脏均出现了典型的
髓细胞样肿瘤，且均分离到 ALV-J。从这一只鸡的
相应脏器提取 DNA，以其中的 ALV前 cDNA为模
板扩增 ALV-J的 gp85基因，从每个组织样品的
PCR产物克隆后取 10个克隆子测序比较。结果表
明，同一只鸡的 4块不同组织的 40个 gp85的克隆
序列中，没有一个是完全相同的，相互间都有不同
程度的变异。肝脏肿瘤的 10个克隆间的同源性在
97.4%~99.7%之间，左肾大块肿瘤 10个克隆间的
同源性在 96.7%~99.9%之间，右肾 10个克隆间的
同源性在 97.4%~99.9%之间，肺的 10个克隆间的
同源性在 97.6%~99.6%之间。当然，这些准种与接
种这只鸡的原始病毒的 gp85的同源性更低，只在
93.7%~96%的范围内 (李薛等，待发表资料 )。这
表明，该病毒在这只鸡体内存在和复制 6个月后，
发生了很大的突变。这种差异的程度实际上已超过
了 ALV-J亚群内某些毒株之间的差异。
从以上结果足以说明 ALV-J在感染病鸡后，经
过一次感染过程已经不再是单一的病毒，已形成了
gp85基因发生不同变异的病毒准种群。感染性克隆
株 NX0101在同一个体变异就那么复杂多样，如果
在不同来源、不同鸡场、不同鸡舍的个体之间，更
是千变万化，复杂多样。
2.2　ALV-J在抗体免疫选择压作用下准种群的演变
为了研究与 ALV-J的病毒中和反应相关的囊膜
蛋白 gp85在抗体的免疫选择压作用下的演变，本
实验室比较了在有和没有特异性抗血清的细胞培养
上连续传代过程中相应病毒的 gp85基因的演变。
在将鸡 ALV-J中国分离株 NX0101接种到已长成单
层的鸡胚成纤维细胞 (CEF)的 6孔细胞培养板上后，
分为 A组 (培养基中无抗体 )和 B组 (培养基中含
抗体 )，每组中 3个孔分别代表 3个独立的传代系列，
连传 30代。分别对 2组共 6个传代系列的第 10代、
20代和30代病毒的囊膜糖蛋白基因 (env)进行扩增、
克隆和测序。序列比较结果表明，原始病毒与无抗
体 A组的不同传代系列的不同代次之间 gp85氨基
酸序列同源性为 97.7%~99.7%；而原始病毒与有抗
体 B组不同传代系列的不同代次之间 gp85的氨基
酸序列同源性明显下降，仅为 93.8%~96.1%。原代
病毒与无抗体组差异性平均值为 (1.61 ± 0.63)%，原
代病毒与有抗体组差异性平均值为 (4.87 ± 0.87)%，
显著高于无抗体组 (P < 0.01)。当组内比较时，无
抗体传代组各系列各代次间的平均变异为 (2.5 ±
0.81)%，而有抗体组为 (4.94 ± 1.5)%，也显著高于
无抗体组 (P < 0.01)。 以上这些结果都说明，抗体
的免疫选择压的作用显著加大了病毒群体的演变。
对 gp85高变区上有义突变 (NS)与沉默突变 (S)的
比例计算分析表明，无抗体 A组 3个传代系列在
表3 有抗体传代毒株与原始毒株ORF优势准种核酸同源性比较(%)
0ri D40 E40 F40 d40 e40 f40
0ri 100 99.8 99.0 99.2 98.7 98.5 98.7
D40 100 98.8 99.0 98.5 98.3 98.5
E40 100 98.2 97.7 97.5 97.7
F40 100 99.5 99.3 99.5
d40 100 99.2 100
e40 100 99.2
f40 100
注："Ori"，SD0612原始株；D40、E40、F40分别为第一次传代中有抗体组3个系列第40代毒；d40、e40、f40分别为第二次传
代中有抗体组3个系列第40代毒[22]。
崔治中：病毒准种多样性及其在免疫选择压作用下的演变第9期 847
#110~#120、#141~#151和 #188~#193aa这 3个高变
区域上 NS/S的值分别为 2 (8/4)、1 (3/3)和 1.3 (4/3)；
有抗体 B组 3个传代系列在 #110~#120、#140~#150
和 #188~#193aa这 3个高变区域上 NS/S的值分别
为 4.1 (13/3)、4.7 (14/3)和 3.3 (11/3)，显著高于无
抗体组，这也显示出抗体免疫选择压促进了 ALV-J
gp85的演变 [27]。
进一步对序列分析还发现，这些变异主要集
中在 gp85的 3个高变区，即相当于氨基酸的第
#110~#120、#141~#151 和 #188~#193 区域 ( 图 1)，
而且在有抗体的 B组的 3个高变区上大多数变异在
低代次出现后，在高代次还继续维持这一变异。这
说明这些变异不是随机变异，而是在特异性抗体作
用下有规律地变异，且在含有同样抗体的细胞培养
上继续传代过程中能持续保留。尽管在无抗体的 A
组也发生了 11处碱基位点的变异，但都是不稳定
的随机变异。
用同样的方法研究另一个 ALV-J 野毒株
HN0001也得到了类似的结果，只是在其 gp85上类
似的高变区内发生变异的位点的碱基组成与
NX0101不同，见图 2[28]。这显然与原有毒株在该
位点的序列及采用的血清抗体的抗原表位特异性
不同相关。但是，在同样的实验中，如果采用
NX0101的感染性克隆病毒在含有与其相应抗体的
细胞培养上传代，没有发生这种有规律的演变 (未
发表资料 )，这说明抗体的存在并没有显著促进病
毒发生突变。当起始病毒是很单一的感染性克隆病
毒时，在有限的复制循环中就不容易产生这种主要
靠选择作用诱发的演变。只有如 2.1中所述，在不
同环境下经历长期大量复制循环过程中出现许多准
种多样性时，这种免疫选择压才能显出其影响病毒
(a)位于高变区hr1内的亚高变区；(b)位于高变区hrl1内的亚高变区；(c)位于高变区hr2内的亚高变区，黑斜体部分是根据己发
表资料以及本试验中NS/S的比例推测出的高变区序列。
图1 NX0101原代病毒与A和B组不同传代系列病毒gp85上高变区比较[27]
黑斜体部分是根据已发表资料以及本试验中NS/S的比例推
测出的HN0001上的高变区。
图2 HN0001原代病毒与A组(无抗体)和B组(含抗体)不
同传代系列病毒gp85上高变区比较[28]
生命科学 第25卷848
演化的作用。
3　鸡新城疫病毒在抗体免疫选择压作用下的
演变
新城疫病毒 (newcastle disease virus, NDV) 是
一种 1型禽副黏病毒，其基因组是单股、负链
RNA，由 15 186个核苷酸组成。NDV的囊膜由 F
和 HN 两个糖蛋白组成，F 糖蛋白能够融合宿主细
胞膜，使病毒侵入宿主细胞内；HN 糖蛋白具有血
凝素和神经氨酸酶活性，在病毒侵染过程中识别细
胞受体、介导病毒附着细胞膜。这两种基因产物决
定着 NDV的抗原性，与病毒中和反应密切相关。
3.1　在抗体免疫选择压作用下NDV的HN和F基因
的演变
如表 4所示，当将强毒株 TZ060107(基因 VII
型 )分别接种到含有抗 TZ06007的单因子血清的
CEF (A组 )和不含抗体的 CEF (B组 )中，每组分
为 3个独立系列连续传代。对每个系列的第 10、
20、30、40、50代病毒的 HN基因和 F基因进行扩
增克隆测序，并与原始病毒的序列比较。结果表明，
在有抗体组 HN基因有义突变 (NS)与无义突变 (S)
比值 NS/S为 6，无抗体组 NS/S只有 3.4；在有抗
体组有 5个碱基位点发生稳定的有义突变，而无抗
体组只出现一个有义稳定突变。这显示出特异性抗
体选择压作用的影响 [29]，但 F基因受免疫选择压
作用影响似乎不太明显。
将变异最大的系列 A1-50病毒 (表 4)，在含有
抗 A1-50抗体的 CEF培养基上分 3个独立系列再
连续传 50代，同时设 3个不带抗体的独立传代系
列作为对照。对第 60、70、 80、90、 100代病毒的
HN和 F基因序列比较结果显示，有抗体组 HN基
因的非同义突变 (NS)对同义突变 (S)比值 NS/S为
5.25，明显高于无抗体组 NS/S的 2.375。前 50代
在抗体选择压作用下已发生稳定的 NS突变，在含
有抗 A1-50抗体的细胞培养中连续传代仍能稳定保
持，且又出现了一个新的稳定的 NS突变位点。F
基因也出现 3个新的稳定的 NS突变。这说明 F基
因也能像 HN基因那样在免疫选择压作用下发生演
变 ,但较慢。这可能与 TZ060107株 NDV的原始毒
的准种群体中 F基因的遗传多样性较小有关。
3.2　NDV在抗体免疫选择压作用下抗原性的变异
分别用 TZ060107的原始毒及其在抗体作用下
的传代毒 A1-50和 a1-100毒与它们相应的特异性
抗血清作交叉血球凝集抑制试验 (HI)，结果表明随
着在含有抗 NDV血清的细胞培养上传代代数的增
加，在交叉 HI中的它们间的抗原性相关系数逐渐
下降 (表 5)，这说明病毒与原始病毒间在抗原性上
的差异越来越大 [30]。
4　H9N2亚型禽流感病毒在抗体免疫选择压作
用下的演变
禽流感病毒 (avian influenza virus, AIV)是指易
感染鸟类的一类 A型流感病毒，其基因组为单股负
链 RNA，分为 8个独立的节段，总共 13.6 kb。根
据 HA和 NA基因的不同，流感病毒有许多亚型。
近 10年来，鸡和其他某些鸟类的高致病性 H5N1-
AIV特别引人关注。为了研究 AIV在抗体免疫选
择压作用下的演变，本实验室选择了对鸡呈低致病
性但易于在鸡群中广泛流行的 H9N2-AIV作为研究
模型。
将制备疫苗用的 LG-1株 H9N2亚型 AIV分别
接种含有母源抗体鸡胚 (A组 )和不含有母源抗体
的 SPF鸡胚 (B组 )，并连续传代。其中 A组再分
为 4个独立的传代系列 A1~A4；B组再分为 2个独
立传代系列 B1~B2。在每个传代系列，分别对第
10、20、30、40、50代病毒的 HA和 NA基因进行
扩增克隆测序，并与原始病毒的序列比较。
4.1　H9N2-AIV的HA基因在抗体免疫选择压作用
下的演变
结果显示，LG-1株 H9N2在没有抗体的鸡胚
的传代过程中，仅发生碱基的不稳定随机变异，且
多为无义突变。在 2个传代系列共出现了 29个位
点变异，有义突变 (NS)与无义突变 (S)比值 NS/S
仅为 1.4。但在有抗体鸡胚中的传代过程中，发生
了多个呈现稳定遗传的有义突变 (表 6)。在 4个传
代系列共有 45个位点发生突变，且有义突变 (NS)
与无义突变 (S)比值 NS/S为 3.46，显著高于无抗
体组 [31]。这一结果表明，在鸡胚传代过程中母源抗
体提供的免疫选择压确实能影响 H9N2的 HA基因
的变异。
4.2　H9N2-AIV的NA基因在抗体免疫选择压作用
下的演变
与 HA基因相比，同是 LG1株病毒的 NA基因
在抗体作用下也会演变，但变异较小。在有抗体的
鸡胚连续 80代传代的 4个系列中，有 3个系列从
10~20代起在 NA基因的 #99位发生了可稳定遗传
的碱基“G”到“A”的突变，并使氨基酸由蛋氨
酸变为异亮氨酸，有 2个系列从 20~30代起在 473
崔治中：病毒准种多样性及其在免疫选择压作用下的演变第9期 849
表5 TZ060107原始毒与其衍生毒A1-50、 A1-a1-100
间交叉HI相关系数(r)[30]
TZ060107-Ori A1-50 a1-100
TZ060107-ori 1.00
A1-50 0.8485 1.00
a1-100 0.7483 0.8485 1.00
位发生了可稳定遗传的由“A”突变为“G” 的碱基
突变，导致相应的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸。
另一个传代系列在 50代时也发生了同样的突变。
在无抗体的鸡胚上的 2个独立对照系列同样传了 80
代，在这 2个位点没有发生突变，表明这 2个突变
与抗体的选择压相关。在抗 LG1母源抗体阳性鸡
胚的连续 40代传代过程中，NA基因在有抗体组的
四个传代系列碱基的非同义突变 (NS)与同义突变
(S)比为 4.6 (32/7)，显著高于无抗体组 NS/S比的
2.0(16/8)，也显示出抗体的选择压作用 [32]。
5　讨论与展望
有关病毒准种的概念已应用和研究了 20多年
了。一开始主要集中在一些慢性病毒患者的感染病
例分析，特别是艾滋病患者 [3,7-11,14,16-17]。对其他
RNA病毒在免疫选择压作用下演变的研究也经历
20多年了，但不论是医学还兽医学研究都还主要基
表4 NDV在有或无抗体CEF传代过程中HN和F基因发生稳定有义突变位点
HN基因 F基因
NS传代系列 #140 #776 #1058 #1439 #1563 #1703 #676 #1348
(47)* (259)* (353)* (480)* (521)* (568)* (226)* (450)*
G(S) A(E) G (R) G(R) C(S) A(D) A(T) A(I)
A1 A1-10 — — — — — — — —
A1-20 — — — — — — — —
A1-30 — G(G) — A(K) — G(G) G(A) —
A1-40 — G(G) A(Q) A(K) — G(G) G(A) —
A1-50 — G(G) A(Q) A(K) — G(G) G(A) —
A2 A2-10 — — — — — — — —
A2-20 — — — — — G(G) G(A) —
A2-30 — G(G) — A(K) — G(G) G(A) —
A2-40 — G(G) A(Q) A(K) — G(G) G(A) —
A2-50 — G(G) A(Q) A(K) — G(G) G(A) —
A3 A3-10 — — — — — G(G) — —
A3-20 — — — — A(R) G(G) — —
A3-30 — — — A(K) A(R) G(G) — G(V)
A3-40 — — — A(K) A(R) G(G) — G(V)
A3-50 — — — A(K) A(R) G(G) — G(V)
B1 B1-10 — — — — — — — —
B1-20 — — — — — — — —
B1-30 A(N) — — — — — — —
B1-40 A(N) — — — — — — —
B1-50 A(N) — — — — — — —
B2 B2-10 — — — — — — — —
B2-20 — — — — — — — —
B2-30 — — — — — — — —
B2-40 A(N) — — — — — — —
B2-50 A(N) — — — — — — —
B3 B3-10 — — — — — — — —
B3-20 — — — — — — — —
B3-30 A(N) — — — — — — —
B3-40 — — — — — — — —
B3-50 — — — — — — — —
注：#，有义突变碱基位点；()*内为相应的氨基酸位点；与原始株相同的碱基用“—”代替[29]。
生命科学 第25卷850
于病毒分子流行病学研究 [19-20,23-24,26,32-36]。在过去几
年中，利用不同的体外实验模型，本实验室比较观
察了我国几种常见动物 RNA病毒的准种多样性，
并对其在抗体免疫选择压作用下的演变做了系统的
比较研究。从这些结果可见，过去往往把从一个个
体或从同一群类似症状病例分离到的病毒称为一个
毒株，但从基因组水平来看，这往往是由许多病毒
个体组成的病毒群体即准种。对一些 RNA病毒来
说，从患者或病畜 (禽 )分离到的最初分离物就已
是遗传多样性的准种。其后，在不同的体外宿主细
胞 (鸡胚 )上传代适应和复制过程中，准种中的优
势群体逐渐变化，一些遗传特征的准种可能逐渐消
失，复制中的突变又产生新遗传特征的准种群。由
野毒在不同宿主细胞 (鸡胚 )传代适应所形成的一
些弱毒疫苗，实际上也可能是由基因组上有变异
的准种群组成 [37]。实际上，弱毒疫苗生产规程都
严格规定种毒的传代次数，以避免其遗传特征的进
一步演变。
本实验室在体外实验模型中对动物中常见的四
种不同 RNA病毒的研究结果都表明，这些病毒在
抗体的作用下，它们与病毒中和反应相关的抗原基
因很容易发生演变。因此，在为这些病毒传染病制
定相应预防控制措施时，有必要考虑这些因素。既
然这些病毒是具有非常广泛遗传多样性的准种群，
这些病毒很容易在免疫选择压作用下发生演变，逃
逸疫苗免疫赋予机体的保护性免疫力，就很难指望
仅靠疫苗免疫接种达到完全预防感染的目标。
除了免疫选择压外，病毒的演化方向还可能受
其他选择压的影响。例如，本实验室的研究还发现，
在提高横向传播性这一正选择压作用下，整合进禽网
状内皮增生病毒的长末端重复序列的重组马立克氏病
毒演化为在鸡群中比较容易分离到的流行毒株 [38]。
本文提及的不同的体外实验模型中，所研究的
四种病毒都能在含有特异性抗体的传代过程中发生
表6 H9N2-AIV的HA基因ORF中有连续两个以上代次发生变异的碱基位点及相应氨基酸
稳定有义突变位点 17* 313* 477* 496* 592* 593* 672* 796* 806*
原始株碱基(氨基酸) T(L) A(N) G(M) A(N) G(A) C(A) G(M) C(H) C(S)
有抗体组
A1 A1-10 — — — — — — — — —
A1-20 — — — — — — — — T(S)
A1-30 C(P) — A(I) — — — A(I) — T(S)
A1-40 C(P) — A(I) — — T(V) A(I) — T(S)
A1-50 C(P) — A(I) — — T(V) A(I) — T(S)
A2 A2-10 — — — — — — — — —
A2-20 — — — — — T(V) — — —
A2-30 — G(D) — — — T(V) — — —
A2-40 — G(D) — — — T(V) — — —
A2-50 — G(D) — — — T(V) — — —
A3 A3-10 — — — — — — — T(Y) —
A3-20 — — — — A(V) — — T(Y) —
A3-30 — — — G(D) A(V) — — T(Y) —
A3-40 — — — G(D) A(V) — — T(Y) —
A3-50 — — — G(D) A(V) — — T(Y) —
A4 A4-10 — — — — — — — T(Y) —
A4-20 — — — — — — — T(Y) —
A4-30 — — — — — — — T(Y) —
A4-40 — — — — — — — T(Y) —
A4-50 — — — — — — — T(Y) —
无抗体组
B1 B1-10 — — — — — — — — —
B1-50 — — — — — — — — —
B2 B2-10 — — — — — — — — —
B2-50 — — — — — — — — —
注：与原始株相同的碱基用“—”代替；()内为相应的氨基酸[32]。
崔治中：病毒准种多样性及其在免疫选择压作用下的演变第9期 851
若干个氨基酸的突变，这些突变位点很可能是与病
毒中和反应相关的抗原表位。利用这一方法，再结
合其他鉴别病毒中和反应相关抗原表位的方法，就
可能加快确定在病毒中和反应相关蛋白上那些保守
的病毒中和抗原表位，从而有助于设计更有广泛适
应性的重组疫苗。在现有的报道中，还仅是对常规
的 PCR产物克隆一一测序，依靠增加测序克隆的
数量来显示准种的多样性。但成本和人工操作都限
制了数量的进一步增加，也就限制了对一个个体内
某种病毒准种多样性及其演化过程真实面貌的了
解。近几年开发的高通量测序技术的应用，有可能
使对病毒准种及其演化的研究产生一次质的飞跃。
[参　考　文　献]
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