全 文 ：第23卷 第9期
2011年9月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 9
Sep., 2011
文章编号：1004-0374(2011)09-0912-05
发酵生产7-ACA基因工程菌的构建
胡又佳*，刘　艳，朱宝泉
(上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200437)
摘　要：头孢菌素类抗生素是临床用途最广的抗感染药物，其工业生产的重要中间体 7-氨基头孢烷酸 (7-
ACA)采用顶头孢霉发酵产物头孢菌素 C为前体，通过化学合成或两步酶法获得。介绍了在了解头孢菌素
C生物合成的前提下，在建立了顶头孢霉的遗传改造基础上，运用合成生物学的知识，在头孢菌素 C产生
菌顶头孢霉中分别构建了三个头孢菌素 C酰化酶的表达框架，通过发酵产物的分析并优选表达框架后，再
采用传统发酵工艺的优化获得了一株可以直接发酵 7-ACA的高产顶头孢霉工程菌。
关键词：7-ACA；顶头孢霉；头孢菌素 C；合成生物学；基因工程
中图分类号： O621.33; R978.11 文献标志码：A
Construction of an engineering Acremonium chrysogenum for fermentation
of 7-ACA
HU You-Jia*, LIU Yan, ZHU Bao-Quan
(State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,
Shanghai 200437, China)
Abstract: Cephalosporins antibiotics are the most widely used anti-infectious drugs in clinic. The important
intermediate for cephalosporins antibiotics, 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA), is produced by semi-chemical
synthesis or two-step immobilized enzymatic transformation from cephalosporin C, the metabolites of Acremonium
chrysogenum, in industry. We report here that on the basis of understanding the cephalosporin C biosynthesis and
establishing the genetic modification of A. chrysogenum, three different cephalosporin C acylase expression
cassettes were introduced into A. chrysogenum upon the advance of synthetic biology. After analysis of the
engineering strains metabolites, the best expression cassette was chosen followed by optimization of traditional
fermentation process. In conclusion, a high-yield engineering A. chrysogenum for direct fermentation of 7-ACA was
obtained.
Key words: 7-ACA; Acremonium chrysogenum; cephalosporin C; synthetic biology; genetic engineering
收稿日期：2011-03-15
基金项目：“十二五”重大新药创制项目(2011zx
09203-001-06)
*通信作者：E-mail: huyj@sipi.com.cn
1　7-ACA的工业生产方式
7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)是生产头孢菌素类
抗生素的重要中间体。头孢菌素类抗生素属于 β-
内酰胺类抗生素，与同属此类药物的青霉素在母核
结构上不同的是，头孢菌素类抗生素用一个二氢噻
嗪环代替了青霉素的噻唑环与 β-内酰胺环相连。
正是由于这种差异，使其不易受青霉素酶的破坏，
对许多青霉素耐药菌有效；不良反应发生率也较青
霉素和其他抗菌药物要小。基于这些优点，头孢菌
素类抗生素已成为临床上广泛使用的重要抗感染药
物。
7-ACA是由顶头孢霉的发酵产物头孢菌素 C
(cephalosporin C, CPC) 经过化学半合成或两步酶催
化而获得的。传统工艺主要以化学法由头孢菌素 C
胡又佳，等：发酵生产7-ACA基因工程菌的构建第9期 913
裂解生产 [1]。由于化学裂解法环境污染大，原料成
本高，现在大部分厂家采用生物酶催化法进行
7-ACA生产。生物酶催化法采用固定化酶作为催化
剂，体外转化 CPC形成 7-ACA。现有生物酶催化
法包括两步酶法 [2]及一步酶法 [3]。两步酶法涉及到
两个酶 (D-氨基酸氧化酶 D-amino acid oxidase和戊
二酰酰基转移酶 glytaryl-7-ACA-acylase)分步催化，
已有用于工业化生产的报道；一步酶法是利用头孢
菌素 C酰基转移酶直接催化 CPC形成 7-ACA，尚
未见工业化生产的报道。由 CPC到 7-ACA的生产
路线见图 1。
2　发酵生产7-ACA基因工程菌的构建
尽管一步酶法尚未能应用于产业化，但它通过
转化从 CPC来生产 7-ACA仍然是目前国际上研究
的热点，这其中的关键问题是要解决 CPC酰基转
移酶对底物 CPC的特异性 [4]。不过，无论是二步
酶法还是一步酶法，都需要发酵获得 CPC后再通
过体外酶催化反应来生产 7-ACA。国外有过报道，
将 D-氨基酸氧化酶和戊二酰酰基转移酶的基因克
隆至顶头孢霉，结果在顶头孢霉体内表达的两个酶
可以将顶头孢霉发酵获得的头孢菌素 C直接在体内
转化成 7-ACA，实现了直接发酵生产 7-ACA的目
的 [5]。但由于出发菌株本身头孢菌素 C的发酵水平
就较低，且两个酶同时转化顶头孢霉，按现代合成
生物学的理论，再加上对顶头孢霉基础研究的缺乏，
很难使代谢流达到平衡。因此，没有任何实用价值。
随着一步酶法研究的深入，对头孢菌素 C底物特异
性更强的头孢菌素 C酰化酶被发现，我们设想能否
将 CPC酰基转移酶基因直接引入顶头孢霉，从而
使经改造的工程菌具备发酵生产 7-ACA的能力，
而对一个表达框架的调控相比两个来说要容易得
多，使之最终能应用于产业化。
2.1　头孢菌素C的生物合成
对顶头孢霉进行基因改造，首先必须要对头孢
菌素 C的生物合成机制有清楚的阐明。按现有文献
总结，参与头孢菌素 C生物合成的基因分为两簇：
早期基因簇由 pcbAB-pcbC 和 cefD1-cefD2 组成，
pcbAB-pcbC编码的蛋白负责 CPC生物合成的前两
步反应 [6]，cefD1-cefD2编码的蛋白负责将异青霉素
图1 7-ACA的二步酶法和一步酶法生产
生命科学 第23卷914
N异构化为青霉素 N[7]；晚期基因簇由 cefEF和
cefG组成，所编码的蛋白负责 CPC生物合成的最
后二步反应 [8]。
CPC的生物合成途径见图 2。pcbAB编码了
ACV合成酶，负责将三个前体氨基酸：L-α-氨基
己二酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸缩合成三肽 ACV，
然后在 pcbC编码的异青霉素 N合成酶的催化下环
化形成异青霉素 N。异青霉素 N再异构化形成青霉
素 N，在顶头孢霉中，编码这一步酶的基因由两个
组成：cefD1-cefD2。cefEF基因在顶头孢霉中编码
了一个独特的双功能酶：脱乙酰氧头孢菌素 C合成
酶 -羟化酶，分别顺次将青霉素 N转化成脱乙酰氧
头孢菌素 C(DAOC)和脱乙酰头孢菌素 C(DAC)，最
后一步由 DAC生成 CPC则是由 cefG编码的 DAC
乙酰转移酶催化的。其中，pcbAB、cefEF和 cefG
被普遍认为是整个生物合成过程中的限速步骤 [9]。
2.2　顶头孢霉的遗传改造
由于 pcbAB基因较大，遗传改造比较困难，因
此以往对顶头孢霉的分子育种主要着重于 cefEF 和
cefG。另外研究者还发现，提高编码 CPC外排泵基
因 cefT的拷贝数也证明对 CPC的生产水平有正面
的影响 [10]。由于顶头孢霉的发酵是个极度耗氧过程，
CPC生物合成途径中的限速酶均为需氧酶，因此，
来源于透明颤菌的血红蛋白基因 vgb也引起了人们
的重视。因为据文献报道，携带有 vgb的异源表达
菌株能大大提高在限氧条件下利用氧的能力，从而
改善菌株的发酵水平，这已经在曲霉中得到证实 [11]。
最早的顶头孢霉菌种改造见于 Eli Lilly公司研
究人员的报道，他们将 cefEF-cefG片段导入顶头孢
霉后 CPC的产量提高了 15%~40%，显示了分子育
种的巨大应用价值 [12]。
将 vgb基因导入顶头孢霉后，果然能明显改善
在发酵后期发酵液很黏稠的情况下，菌丝利用氧的
能力，并维持更高的比生长速率与比生产速率，这
使得 CPC的产量能大幅度提高 4~5倍 [13]。据我们
现在采用分子手段验证得出的结论，国外的顶头孢
霉生产菌种都含有重组的 vgb基因。
另外有一项研究是将 cefT基因导入顶头孢霉，
结果发现可以使 CPC的发酵水平提高近 1倍 [14]，
推测可能是由于增加的 CefT表达量使发酵产物的
外排得到了加强，更有利于降低胞内酶受终产物反
馈抑制的影响从而提高最终产量。
值得注意的，目前文献报道的这些顶头孢霉的
遗传改造均针对的是模式菌株 C10等，出发菌本身
的发酵水平比较低，大概为 1 mg/mL左右，远远低
于 CPC的工业生产水平，因此虽然在提高顶头孢
霉发酵水平以及发酵产物的改造上取得了不错的结
果，但离菌种的产业化仍相当遥远。
我们实验室则重点针对高产菌株并探索工程菌
的产业化应用前景。我们尝试将克隆到的 cefG/
cefEF/cefT/vgb以不同的组合分别引入顶头孢霉中，
构建了不同的工程菌。结果发现，对于 CPC高产
菌株来说，引入额外拷贝的 cefG基因能够明显提
高 CPC的发酵水平，不同的转化子有不同的提高
幅度，其中提高幅度最高的达 100%以上。相比较
而言，vgb基因则没有那么明显的效果，但与仅仅
引入一个拷贝的 cefG工程菌相比，再额外引入一
个拷贝的 vgb基因可以使 CPC的发酵水平进一步
提高 30%左右。同时，我们也发现，引入 cefEF和
cefT对于 CPC高产菌株来说几乎没有什么作用，
这一方面说明了模式菌株与高产菌株间的区别；另
一方面也可能是由于高产菌株已经经过了几轮的诱
变育种，内源性的 cefEF和 cefT基因可能已经达到图2 头孢菌素C的生物合成途径
胡又佳，等：发酵生产7-ACA基因工程菌的构建第9期 915
了相当高的活性 [15]。
对于菌种的遗传改造来说，除了外源基因的导
入，内源基因的阻断或沉默也是一个常用手段。近
年来新兴的 RNAi技术可以作为同源重组的一种替
代方法实现目的基因的表达沉默。顶头孢霉中的
RNAi现象由 Janus等 [16]首次报道。Ullan等 [17]用
RNAi技术沉默产黄青霉中的 pcbC基因和顶头孢霉
中的 cefEF基因。这些实验表明，在丝状真菌顶头
孢霉体内实现 RNA干扰具有很大的可行性。
我们构建了一个含可形成 cefG双链 RNA转录
单元的 RNAi载体，并将其导入 CPC工业生产菌株
中。定量 PCR分析转化子 cefG的转录水平，检测到
其中两个转化子的 RNA转录水平在发酵第四天较
出发菌株降低了 80%以上。HPLC分析它们的 CPC
发酵水平较出发菌株分别降低 34.6%和 28.8%[18]。
这一研究结果不仅证明了 RNAi应用于顶头孢霉工
业生产菌株的可行性，而且为在顶头孢霉中重构宿
主菌的代谢途径，为其代谢产生新的化合物打下了
基础。
2.3　7-ACA基因工程菌的构建
对顶头孢霉，尤其是高产菌株乃至工业生产菌
株的成功改造，使得导入头孢菌素 C酰化酶并构建
直接发酵生产 7-ACA工程菌成为可能，而对于这
一目标来说，我们需要在顶头孢霉中构建一条新的
代谢途径，即将通过生物合成途径合成的头孢菌素
C进一步由头孢菌素C酰化酶代谢为 7-ACA。为此，
我们构建了三个不同的表达单元分别导入顶头孢霉
中，这三个表达单元分别由一个启动子控制一个基
因，或二个启动子控制一个基因，或二个启动子分
别控制二个基因。二个启动子分别选择了顶头孢霉
内源性的 pcbC基因的启动子 PpcbC和来自于构巢
曲霉 trpC基因的启动子 PtrpC，终止子则都采用了
trpC基因的终止子 TtrpC。三种头孢菌素 C酰化酶
的表达框架见图 3。
我们将文献报道的来源于假单胞菌 N176中头
孢菌素 C酰基转移酶基因 vac[19] 设计了适合于在顶
头孢霉中表达的序列，将该基因的密码子改变为
顶头孢霉偏爱性同时兼顾大肠杆菌偏爱和密码子
利用频率的平衡性，并应用 RNA secondary structure
prediction软件，选择 mRNA二级结构少、自由能
较小、结构简单、利于表达的最优基因序列 ecs，
全长为 2 349 bp，编码 783个氨基酸，ecs与 vac的
同源性为 94%，共有 121个密码子改变，占 15.45%。
将 57个 60~68 bp的寡核苷酸片段进行酶切、
拼接、PCR获得了完整的总长为2 349 bp的ecs基因，
在大肠杆菌中表达后纯化的 ECS蛋白进行酶活测
定，表明重组 ECS能将 CPC转化为 7-ACA。
同时采用本实验室构建的用于将 vgb转化至顶
头孢霉的质粒 pYG13[20]作为载体，将不同表达框
架的 ecs基因导入顶头孢霉原生质体，通过 PCR、
RT-PCR及Western证明 ECS蛋白在顶头孢霉中表
达，且发酵液中出现了目的产物 7-ACA，表明工程
菌能够将 CPC转化成 7-ACA[21]。
从结果中我们发现，不同的 ecs表达框架所获
得的工程菌产 7-ACA的水平是不一样的，二个启
动子分别控制二个 ecs基因的发酵水平最高，一个
启动子控制一个 ecs基因其次，由二个启动子控制
一个 ecs基因的则最低。具体发酵水平见表 1。此
结果也表明，要在宿主菌中构建一个表达单元，选
择合适的启动子强度与基因的拷贝数非常重要，而
单纯地增强转录水平往往并不能获得最好的效果。
我们以在大肠杆菌中表达的重组头孢菌素 C酰
基转移酶的酶学性质为基础，对工程菌进行了培养
基与发酵工艺的初步优化，即可将工程菌的 7-ACA
发酵水平提高 7倍以上 [22]。目前以头孢菌素 C生
产菌株作为对照，我们所获得的 7-ACA工程菌已
经能够将 30%的头孢菌素 C在发酵过程中直接转
化为 7-ACA，通过构建更有效的转录启动单元及多
拷贝整合重组子，并结合传统育种的工艺优化，有
表1 导入ecs基因的不同表达框架获得的7-ACA一步发
酵工程菌的发酵水平
表达框架类型 7-ACA发酵水平 (µg/mL)
PpcbC+ecs 263±37
PpcbC+PtrpC+ecs 129.5±29
PpcbC+ecs+PtrpC+ecs 350.5±36
图3 头孢菌素C酰化酶三种表达框架
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望获得国际领先的 7-ACA一步发酵生产工艺。
3　结语和展望
7-ACA属于市场需求量大、出口前景好的大
宗原料药，事实上，近几年来 7-ACA的市场价格
居高不下，出口量也逐年提高。对于生产企业来说，
7-ACA的生产成本主要取决于头孢菌素 C的发酵
成本、酶的购买成本、固定化技术及酶的重复利用
率等。从降低成本、简化技术角度考虑，世界上一
些医药工业发达国家十分重视一步酶法从 CPC转
化生产 7-ACA的研究。通过顶头孢霉的基因工程
改造结合合成生物学的知识来构建直接发酵生产
7-ACA的工程菌，不仅完全舍弃了化学制备法所造
成的环境污染，而且也省略了两步酶法转化所需要
的酶的固定化等步骤，实现绿色工艺和技术水平的
国际领先，可以大大降低头孢菌素类抗生素的生产
成本，对国内药品的价格下降，患者用药成本的降
低，以及潜在的减少能耗、降低污染都有很好的市
场及社会效益。
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