全 文 ：第23卷 第2期
2011年2月
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
Vol. 23, No. 2
Feb., 2011
文章编号：1004-0374(2011)02-0212-04
基于微生物源的抗虫基因发掘
张四维，王　兵，王成树*
(中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海 200032)
摘　要：植物转基因抗虫技术在害虫控制方面取得了巨大成功。商业化运用的抗虫基因目前全部来源于苏
云金杆菌 (Bacillus thuringiensis, Bt)的杀虫晶体蛋白基因，存在抗虫谱较窄及害虫逐渐产生抗性等问题，表
明新型抗虫基因的筛选尤为重要。已有的文献研究表明，除了继续发掘 Bt来源的新型杀虫蛋白基因以外，
非 Bt杀虫细菌及杀虫真菌也具有重要的发掘价值。
关键词：苏云金杆菌；非 Bt杀虫细菌；杀虫真菌；抗虫基因
中图分类号：S482. 292；Q786 文献标识码：A
Exploration of microbial origin insecticidal genes
ZHANG Si-Wei, WANG Bing, WANG Cheng-Shu*
(Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences,
Shanghai 200032, China)
Abstract: The technology of insect-resistant transgenic plants is being applied as a successful strategy for the
control of insect pests. The insecticidal genes currently used in commercial genetically modified crops are all from
the insect pathogenic bacterium Bacillus thuringiensis (Bt). After years’ applications, it is highly required to
discover new genes to alleviate the issues of narrow anti-insect spectrum of Bt toxins and the occurrences of insect
resistance against the toxic proteins. A review of the literatures shows that besides further studies of B. thuringiensis,
it is promising to explore novel microbial origin insecticidal genes from non-Bt insect pathogenic bacteria and
insect-killing fungi.
Key words: Bacillus thuringiensis; non-Bt pathogenic bacteria; pathogenic fungi; insecticidal gene
收稿日期：2010-12-27
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项
(2008ZX08009-003，2009ZX08009-035B)
*通讯作者：E-mail: cswang@sibs.ac.cn
害虫生物防治是指利用昆虫与其他生物物种间
的相互关系，以一种、一类生物或其相关产物控制
害虫的方法，其中包括植物转基因技术，即通过人
为遗传改造，利用外源的杀虫或抑虫蛋白基因进行
植物遗传转化，使植物获得可稳定遗传的抑制害虫
取食或直接杀死取食害虫的特性。自 1987年成功
报告植物转基因抗虫以来，植物转基因抗虫技术在
害虫控制方面取得了巨大的成功，已经成为害虫控
制的重要手段之一。主要农作物棉花、玉米和大豆
等转基因品系得到了大规模推广种植，世界范围内
达数千万公顷 [1]。
转基因作物品种 (系 )的抗虫效率主要由所使
用的抗虫基因种类及其控制元件等因素所决定，虽
然有植物源、动物源的杀虫 (抑虫 )蛋白基因的报
道 [2-4]，然而，目前获得成功商业化应用的杀虫蛋
白基因均来源于苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis,
Bt)。由于存在杀虫谱较窄及害虫抗性产生等问题，
除了继续从不同Bt菌株克隆、鉴定新型杀虫蛋白外，
已有研究表明，大量的非 Bt杀虫细菌及杀虫真菌
等昆虫病原微生物中也存在有不同类型的杀虫或抑
虫蛋白基因，因而具有重要的发掘价值，为植物转
基因抗虫提供了新的基因来源。
张四维，等：基于微生物源的抗虫基因发掘第2期 213
1　苏云金杆菌来源的抗虫基因
杀虫微生物苏云金杆菌的主要杀虫活性成份为
δ-内毒素类的杀虫晶体蛋白 (insecticidal crystal
proteins， Cry)，目前发现的晶体蛋白达 570余种。
基于氨基酸序列相似性原则，即与已有蛋白同源性
小于 45%为一级水平 (primary rank)的新型蛋白、
45%~78% 为二级 (secondary rank)，78%~95%为三
级 (tertiary rank)[5]，杀虫蛋白模式基因型 (holotype)
在一级水平分属于 71个类群，其中包括 68个 Cry
基因群以及 3个 Cyt基因群 (cytolysins，能够引用
昆虫细胞裂解 )，分别对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、
膜翅目、同翅目和直翅目等昆虫有毒杀作用 [6]，以
及近期发现的抗线虫 Cry蛋白 [7]。其中的一些蛋白
家族来源于非 Bt细菌，如 Cry16和 Cry17 来源于
双酶梭菌 (Clostridium bifermentans)，Cry18分离于
日本金龟子芽胞杆菌 (B. popilliae)，Cry43分离于
缓死芽胞杆菌 (Paenibacillus lentimorbus)，二元毒素
(binary toxin)Cry48/Cry49来自于球形芽胞杆菌 (B.
sphaericus)[8]。目前基于一级水平 Cry蛋白基因的
报道越来越少，但仍有发现，如近期报道的
Cry56Aa1基因蛋白对于双翅目及鳞翅目昆虫均具
有毒性 [9]。
除 Cry蛋白外，苏云金杆菌营养生长期产生的
杀虫蛋白 (vegetative insecticidal proteins, VIPs)是一
类新型杀虫毒蛋白，它能在一定程度上克服许多害
虫对 δ-内毒素弱敏感、不敏感或产生抗性的缺陷，
具备成为第二代抗虫基因的潜力。已经发现和鉴定
的 VIP蛋白有 VIP1、VIP2、VIP3系列 [10]，其中对
VIP3A的研究、应用最为成熟，VIP3A蛋白可与敏
感昆虫表皮细胞尤其是柱状细胞相结合，导致细胞
崩解而使昆虫肠道严重受损 [11]。它对目前危害严重
的、Cry蛋白无效的甜菜夜蛾 (Laphyma exigua)、小
地老虎 (Agrotis ypsilon)等害虫具有特异性，具有良
好的应用前景。基于 VIP蛋白基因的转基因作物仍
没有商业化品种，有意思的是，在杀虫真菌 -球孢
白僵菌 (Beauveria bassiana)中高水平表达 vip3Aa1
基因，工程菌株对于斜纹夜蛾 (Spodoptera litura)的
杀虫活性显著提高 [12]。另外，从 Bt中分离、鉴定
的分泌型杀虫蛋白 (secreted insecticidal protein, SIP)对
于鞘翅目的马铃薯甲虫 (Leptinotarsa decemlineata)、黄
瓜星叶甲 (Diabrotica undecimpunctata howardi)和玉
米根萤甲 (D. virgifera virgifera Leconte)均具有杀虫
活性，为一类新型的杀虫蛋白 [13]。上述研究报道表
明，不同菌株的苏云金杆菌仍为新型抗虫基因发掘
的重要来源。
值得一提的是，与苏云金杆菌近缘，具有杀蚊
效应的球形芽胞杆菌除了能够分泌 Cry4、Cry11和
Cyt1等 Bt类似杀虫蛋白外，还能特异性地产生杀
蚊毒素蛋白 (mosquitocidal toxi, MTX)[14]和二元毒
素蛋白 (binary toxin, BIN)等，对于蚊虫幼虫控制具
有重要的作用 [15]。
2　非Bt杀虫细菌来源的抗虫基因
除苏云金杆菌外，能够经消化道感染引起昆虫
致病、死亡的细菌还包括有嗜虫沙雷氏菌 (Serratia
entomophila)、粘质沙雷氏菌 (S. marcescens)、嗜虫
假单胞菌 (Pseudomonas entomophila)、摩尔摩根氏
菌 (Morganella morganii)等，与杀虫线虫共生的细
菌发光杆菌 (Photohabdus luminescens)和嗜线虫致
病杆菌 (Xenorhabdus nematophila)等，以及能够引
起昆虫及人类病症的耶尔森菌 (Yersina spp.)，不同
的抗虫蛋白基因从这些细菌中被克隆、报道 [16,17]。
随着害虫对 Bt及其毒素蛋白产生抗性，这些细菌
逐渐被认为有潜力发展为下一代的微生物杀虫剂及
杀虫蛋白基因的来源 [6]。
与 Bt中 Cry基因不同，在这些细菌中发现的
杀虫蛋白基因一般以操纵元 (operon)形式存在，并
且一般需要其中的不同基因产物同时存在时才能发
挥更好的杀虫或抑虫作用。如在嗜虫沙雷氏菌中鉴
定的位于质粒上的 sepA、sepB、sepC基因簇蛋白
能引起新西兰草地蛴螬 (Costelytra zealandica)停止
取食 [18]。类似的基因簇存在于费氏耶尔森菌 (Y.
frederiksenii)中 [19]。发光杆菌中的毒素蛋白基因簇
(Toxin complex, Tc)， Tca、Tcb、Tcc和 Tcd位点 (locus)
包含有不同数目的基因，各位点基因同时被表达后
才表现出对目标害虫的毒杀作用 [20]。于嗜虫致病杆
菌中紧密连锁分布的 xptA1、xptB1、xptC1及 xptA2
基因产物对大菜粉蝶 (Pieris brassicae)、菜粉蝶 (P.
rapae)和烟芽夜蛾 (Heliothis virescens)具有很好的
杀虫活性，但单基因表达产物的杀虫作用不明显。
不同基因蛋白的组合试验发现，XPTA1、XPTB1
和 XPTC1组合对于两种菜粉蝶具有杀虫活性，而
XPTA2、XPTB1和 XPTC1组合对于烟芽夜蛾具有
杀虫活性 [21]。另外，与 Bt中 Cry基因不同的是，
目前发现的这些非 Bt杀虫细菌的毒素基因编码蛋
白均比较大，一般在 1 000个氨基酸左右或以上，
如 SEPA、SEPB及 SEPC蛋白分别由 2 376、1 428
生命科学 第23卷214
及 973个氨基酸组成。嗜虫致病杆菌的 XPTA1、
XPTB1、XPTC1和 XPTA2蛋白分别由 2 523、1 014、
1 401和 2 538个氨基酸组成。从发光杆菌中鉴定的
杀虫蛋白MCF(makes caterpillars floppy)由 2 929个
氨基酸组成，能够破坏昆虫血细胞的细胞骨架 [22]。
从发光假单胞杆菌 (P. fluorescens)分离的 FIT(For P.
fluorescens insecticidal toxin)基因与MCF具有 70%
左右的相似性，编码 3 004个氨基酸的杀虫蛋白 [23]。
不过从这些细菌中也报道有较小相对分子质量的杀
虫蛋白，如广泛存在于光杆菌及致病杆菌不同菌株
(种 )的一个相对分子质量约 40 k的蛋白，被命名
为 Txp40 (toxin from Xenorhabdus and Photorhabdus,
40 k)，对昆虫细胞系具有显著的毒性，但对哺乳动
物细胞无毒，在低剂量水平 (30~40 ng/g幼虫体重 )，
注射能够杀死大蜡螟 (Galleria mellonella)、棉铃虫
(Helicoverpa armigera)、印度谷蛾 (Plodia interpunctella)
和铜绿蝇 (Lucilia cuprina)幼虫 [24]。
以上发现的非 Bt细菌抗虫基因具有成簇性、
协同作用性、较大的基因结构或仅具有昆虫血腔注
射毒性等特点，因而影响了利用这些基因进行植物
转基因抗虫操作的可行性及存在杀虫效率问题。然
而，从非 Bt杀虫细菌发掘高效的杀虫蛋白基因仍
具有良好的前景，尤其是Waterfield等 [25]发展的快
速毒力注释技术 (rapid virulence annotation, RVA)，
可显著加快来源于不同细菌新型抗虫基因的发掘速
度。RVA技术的基本原理是利用细菌基因组 DNA
构建 cosmid(或 formid)文库，再以单克隆的大肠杆
菌菌液或裂解液注射一定数量的目标害虫或易于人
工饲养的昆虫，如大蜡螟或家蚕 (Bombyx mori)幼虫，
一定时间后 (一般为 24 h)观察不同克隆菌液的杀
虫活性，对于能够重复引起 100%或 90%以上杀虫
活性的克隆进行测序，生物信息分析结合单基因表
达产物杀虫活性验证，可以快速及高通量地筛选到
新型的抗虫基因。
3　杀虫真菌来源的抗虫基因
不同于昆虫病原细菌，昆虫病原真菌菌丝通过
昆虫体壁进行穿透入侵而杀死昆虫，其种类有近千
种，主要分布于子囊菌门 (Ascomycota)，代表物种
有金龟子绿僵菌 (Metarhizium anisopliae)、蝗绿僵
菌 (M. acridum)、球孢白僵菌及布氏白僵菌 (B.
brongniartiii)等 [26]。杀虫真菌感染昆虫宿主时除了
分泌具有杀虫活性的次级代谢产物，如破坏素
(Destruxins)、白僵菌素 (Beauvericin)和被毛孢素
(Hisutatins)等 [27]，也分泌有大量的能够破坏昆虫组
织器官或具有直接杀虫活性的不同蛋白 [28]。虽然，
杀虫真菌分泌的蛋白酶、几丁质酶和脂酶等能够降
解害虫体壁，但这些蛋白酶的经口毒性没有得到很
好的验证。然而有实验室证明，将金龟子绿僵菌、
球孢白僵菌和布氏白僵菌液体培养基的上清液进行
蛋白浓缩后，侵沾、叶碟法 (leaf disc assay)饲喂海
灰翅夜蛾 (Spodoptera littoralis)幼虫，发现浓缩液
具有高效的杀虫及拒食活性；若将该浓缩液进行高
温或蛋白酶 K处理，样品的杀虫活性丧失，说明
是由真菌分泌蛋白所介导的杀虫活性 [29,30]。从球孢
白僵菌培养液中分离纯化一个蛋白，对东亚飞蝗
(Locusta migratoria)具有专化性的注射毒性，而对
于沙漠蝗虫 (Schistocerca gregaria)、摩洛哥戟纹蝗
(Dociostaurus maroccanus)、大蜡螟、黄粉虫 (Tenebrio
molitor)和斜纹夜蛾没有毒杀作用，因而被命名为
Bassiacridin[31]。从一株球孢白僵菌培养液中分离纯
化的壳聚糖酶类似蛋白 (Beauveria chitosanase-like
protein，BclP)注射大蜡螟能够引起细胞毒性及昆
虫黑化反应 (melanization)，从而导致昆虫死亡 [32]。
从金龟子绿僵菌培养液中纯化的四个蛋白对于地中
海实蝇 (Ceratitis capitata)具有经口慢性毒性 [33]。
随着绿僵菌及白僵菌基因组测序的完成 [34]，借助高
通量蛋白质组、转录组或酵母表达文库等技术，可
以促进从杀虫真菌中分离、鉴定具有高效杀虫活性
的蛋白基因，作为真核生物来源的基因，将更加便
于进行植物抗虫操作。
综上所述，微生物源新型抗虫基因的发掘除了
苏云金杆菌外，非 Bt杀虫细菌及杀虫真菌也具有
重要的筛选价值。当然，能够感染、致病及杀虫的
微生物还包括昆虫病毒、杀虫原生动物 (如微孢子
虫，microsporidia)及线虫等，随着对于这些昆虫病
原微生物致病机理的深入研究，从中发掘具有高效
杀虫活性的新型蛋白基因也将成为可能。另外，随
着环境微生物宏基因组研究的发展，从中发掘具有
杀虫活性的蛋白基因也具有可行性。
[参　考　文　献]
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