全 文 ：第 １４卷第 ４期
２０１６年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １４ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ． ２０１６
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００４
收稿日期：２０１６－０３－２４
基金项目：上海市大学生创新活动计划项目（Ａ ９１０３ １４ ０７１１８）
作者简介：王作铭（１９９５—），男，湖北荆州人，研究方向：微生物酶学；陈　 军（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｊ７２０６＠ ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
聚乙二醇共沉淀物复溶萃取辣根
过氧化物酶的条件优化
王作铭，李英东，高敏强，赵雪君，和文燕，明　 子，王文佳，陈　 军
（上海师范大学 生命与环境科学学院，上海 ２００２３４）
摘　 要：为了改进辣根过氧化物酶的提纯方法，在双水相萃取的基础上使用聚乙二醇（ ＰＥＧ６０００）在高饱和度
（ＮＨ４） ２ＳＯ４中沉淀辣根提取液中的过氧化物酶，利用磷酸盐溶液复溶解共沉淀物形成的双水相萃取体系能高效回
收高纯度酶蛋白。 研究了 ｐＨ、ＰＥＧ浓度和（ＮＨ４） ２ＳＯ４饱和度对酶活性的影响，并考察不同液固比、ｐＨ和 ＮａＣｌ浓度
对目标酶在双水相体系中的分配行为，并通过响应面法优化出最优萃取条件。 结果表明：在液固比 ０􀆰 ３ ｍＬ ／ ｇ、ｐＨ
７􀆰 ０２和 ＮａＣｌ ４２ ｇ ／ Ｌ的优化萃取条件下，辣根过氧化物酶回收率达 ８８􀆰 １％，酶纯度较优化前提高了 ２１􀆰 ７ 倍。 该方
法的建立对于微量蛋白质的高效率提纯具有重量的参考价值。
关键词：双水相萃取；辣根过氧化物酶；响应面法
中图分类号：ＴＱ９３； ＴＱ９２０􀆰 ６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１６）０４－００１７－０７
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ
ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｃｏ⁃ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＷＡＮＧ Ｚｕｏｍｉｎｇ，ＬＩ Ｙｉｎｇｄｏｎｇ，ＧＡＯ Ｍｉｎｑｉａｎｇ，ＺＨＡＯ Ｘｕｅｊｕｎ，ＨＥ Ｗｅｎｙａｎ，
ＭＩＮＧ Ｚｉ，ＷＡＮＧ Ｗｅｎｊｉａ，ＣＨＥＮ Ｊｕｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ） ｂｙ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ６０００） ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｗｉｔｈ ＨＲＰ ｉｎ ｔｈｅ
ｈｉｇｈ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ． Ｔｈｅｎ， ａｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＰＥＧ ／ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｗａｓ ｆｏｒｍｅｄ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏ⁃ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ＨＲＰ．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｐＨ，ＰＥＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｑｕｉｄ⁃
ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ，ＮａＣｌ ａｎｄ ｐＨ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ
ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ： ｌｉｑｕｉｄ⁃ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ０􀆰 ３ ｍＬ ／ ｇ， ｐＨ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ ７􀆰 ０２，ＮａＣｌ ４２ ｇ ／ Ｌ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ８８􀆰 １％，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ２１􀆰 ７ ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｏｆ
ｇｒｅａｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ
　 　 辣根（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）是一种多年生草本植物，在
世界温带地区广泛种植，根组织中含有很多的过氧
化物酶同工酶［１］。 辣根过氧化物酶 （ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＨＲＰ，ＥＣ １􀆰 １１􀆰 １􀆰 ７）含有血红素结构，能
利用 Ｈ２Ｏ２氧化许多有机及无机化合物［１
－２］。 目前，
辣根过氧化物酶 （ＨＲＰ）被广泛地应用在污水处
理［３－５］、食品工业［６－７］、有机合成［８－９］和分析检测［１０］
等领域。
虽然目前有不少关于过氧化物酶提纯的报道，
但是多数使用的是常规的酶盐析、交换和层析等提
取纯化方法，这些提取方法有程序较为复杂、提纯
费用贵、得率较低等特点［１１－１２］。 随着 ＨＲＰ 在临床
诊断和工业等方面的大量使用，发展一种简便、迅
速而且经济的提纯方法具有十分重要的意义［１３－１４］。
双水相萃取技术具有生物相容性高、分离条件
温和、分离步骤简单、易于等比例放大和不存在有
机溶剂残留等优点［１５－１６］，近年来得到广泛应用。 笔
者所在课题组［１７］前期利用亲水性聚乙二醇（ ＰＥＧ
６０００） 在高盐度溶液中沉淀夹带海洋微生物
Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｇｏ发酵液中的微量酶蛋白，之后
在磷酸盐溶液复溶解过程中形成双水相萃取体系
来回收高纯度氯过氧化物酶（ＣＰＯ），取得了较好的
效果。
本研究中，笔者在前期研究基础上对共沉复溶
体系进行精细化操作改进，尝试利用该方法提高用
于 ＨＲＰ 的提纯效率。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与仪器
新鲜辣根，山东日照华美有限公司；４ 氨基安
替比林、苯酚、牛血清蛋白、３０％过氧化氢（Ｈ２Ｏ２），
国药集团化学试剂有限公司；聚乙二醇 （ ＰＥＧ
６０００），上海展云化工有限公司；考马斯亮蓝 Ｇ ２５０，
上海润捷化学试剂有限公司；其余试剂均为市售分
析纯。
ＪＪ ２ Ｂ型电动高速捣碎机，江苏省金坛市荣华
仪器制造有限公司；ＪＹ８８ Ⅱ型超声波细胞粉碎机，
宁波新光生物科技股份有限公司；ＭＳ 系列磁力搅
拌器，上海般特仪器有限公司；ＴＧＬ ２０ Ｍ型台式高
速离心机，上海卢相仪离心机仪器有限公司；ＴＵ
１８１０型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有
限责任公司。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 粗酶液的提取
取 １００ ｇ新鲜辣根，蒸馏水冲洗捣碎后加入 １００
ｍＬ ４ ℃预冷的 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸缓冲液（ｐＨ ７􀆰 ５）匀
浆（１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ）５ 次，每次 １ ｍｉｎ，然后抽滤，滤液
中再添加上述磷酸缓冲液（ＰＢＳ）至 ２００ ｍＬ。 再在
冰水浴条件下，用超声波（４０ ｋＨｚ）振荡 ３ 次，每次
１５ ｍｉｎ。 经振荡后，提取液在 ４ ℃下 ７ ５００ ｒ ／ ｍｉｎ 离
心 ２０ ｍｉｎ，去沉淀得约 ２００ ｍＬ的粗酶液［１４］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 ＰＥＧ与 ＨＲＰ 的共沉淀
在 ４ ℃的环境下向粗酶液缓慢加入不同质量浓
度（２０、４０、６０、８０和 １００ ｇ ／ Ｌ）的 ＰＥＧ ６０００并不断搅
拌混合均匀，静置 ４ ｈ，待 ＰＥＧ 与杂质絮凝稳定后，
４ ℃下 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，收集呈浅黄色的
酶液。 然后将酶液在冰浴条件下缓慢加入固体
（ＮＨ４） ２ＳＯ４至不同的饱和度（５５％、６０％、６５％、７０％、
７５％和 ８０％），分别低温静置 ４～８ ｈ。 每段饱和液沉
淀分别在 ４ ℃下 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，得 ＰＥＧ
与蛋白质的盐析复合沉淀物。
１􀆰 ２􀆰 ３　 双水相体系的建立
准确称取 ０􀆰 ５ ｇ的复合沉淀物于带刻度的离心
管中，按一定液固比（０􀆰 ２０、０􀆰 ２５、０􀆰 ３０、０􀆰 ３５、０􀆰 ４０
和 ０􀆰 ４５ ｍＬ ／ ｇ ） 加 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液
（ＰＢＳ），在旋涡混匀器上混合 １０ ｍｉｎ 至沉淀充分溶
解后，在 ４ ℃条件下 ３ ５００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １５ ｍｉｎ。 分别
测出上下相的体积和酶浓度并计算分配系数 Ｋ，确
定最适萃取 ＨＲＰ 的 ＰＥＧ ／磷酸盐双水相萃取体系的
组成。
分配系数 Ｋ由式（１）计算。
Ｋ ＝ 上相总酶活力
下相总酶活力
（１）
下相酶的得率 Ｙ下相由式（２）计算。
Ｙ下相 ＝
下相总酶活力
两相总酶活力
× １００ ＝
ＣｂＶｂ × １００
ＣａＶａ ＋ ＣｂＶｂ
＝ １００
（１ ＋ ＫＲ）
（２）
式中：Ｃａ为上相液酶比活力，Ｖａ为上相液体积，Ｃｂ为
下相液酶比活力，Ｖｂ为下相液的体积，Ｒ 为上下相液
体体积的比值，Ｋ为分配系数。
１􀆰 ２􀆰 ４　 酶活力的检测方法
采用沃辛通法测定酶活力［１８］。 用紫外可见分
光光度计，在 ５１０ ｎｍ 测定 ５ ｍｉｎ 内吸光度变化值，
并以蒸馏水为参比。 在 ２５ ℃、ｐＨ ７􀆰 ０ 条件下，每分
８１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
钟分解１ μｍｏｌ Ｈ２Ｏ２所需的酶量为 １ 个过氧化物酶
活力单位。
反应体系：４ 氨基安替比林溶液 １􀆰 ４ ｍＬ＋过氧
化氢溶液 １􀆰 ５ ｍＬ＋酶溶液 ０􀆰 １ ｍＬ， 形成混合体系。
１􀆰 ２􀆰 ５　 蛋白含量测定方法
蛋白含量测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法。
１􀆰 ２􀆰 ６　 粗提取过程中各因素对 ＨＲＰ 酶活的影响
分别考察 ＰＥＧ６０００ 浓度、（ＮＨ４）２ ＳＯ４饱和度及
ｐＨ对 ＨＲＰ 在盐析剂（ＮＨ４）２ＳＯ４作用下对 ＰＥＧ共沉
淀物夹带析出效果的影响，以活力保存率和沉淀酶得
率为指标，其计算方法分别见式（３） ～（４）。
活力保存率 ＝ 加试剂后 ＨＲＰ 活力
空白试剂 ＨＲＰ 活力
× １００％
（３）
沉淀酶得率 ＝ 沉淀中 ＨＲＰ 活力
总酶活力
× １００％ （４）
１􀆰 ２􀆰 ７　 双水相萃取条件的优化
分别考察液固比（ｍＬ ／ ｇ）、体系 ｐＨ 和 ＮａＣｌ 浓
度 ３个因素对 ＨＲＰ 双水相萃取的影响，以 ＨＲＰ 的
总蛋白的分配系数、得率为指标，各水平重复 ３次。
在单因素实验的基础上，利用 Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ 试
验设计对各因素进行优化，以得率为响应值。 利用
Ｄｅｓｉｇｎ⁃Ｅｘｐｅｒｔ Ｖ８􀆰 ０􀆰 ６􀆰 １ 软件设计响应面实验，从而
得出各因素之间的最佳组合。 每个实验 ３ 组平行，
取其平均值。
１􀆰 ２􀆰 ８　 数据统计分析
利用 Ｄｅｓｉｇｎ⁃Ｅｘｐｅｒｔ Ｖ８􀆰 ０􀆰 ６􀆰 １ 软件对响应面优
化结果进行二次多项式逐步回归拟合，由 Ｂｏｘ⁃
Ｂｅｎｈｎｋｅｎ 程序计算得到回归方程并绘制 ３Ｄ 曲
面图。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 粗提取过程中各因素对 ＨＲＰ酶活的影响
２􀆰 １􀆰 １　 ｐＨ对 ＰＥＧ共沉淀后 ＨＲＰ 得率的影响
聚乙二醇在（ＮＨ４）２ＳＯ４高饱和度下沉淀会夹带
蛋白质，考察沉淀物中的 ＨＲＰ 分配情况，以活力保存
率和沉淀酶得率为指标。 过氧化物酶的最适 ｐＨ 大
多在 ４􀆰 ５～７􀆰 ５［１９］，因此，在（ＮＨ４）２ＳＯ４饱和度为 ７０％、
ＰＥＧ质量浓度为 ４０ ｇ ／ Ｌ 的条件下，调整溶液的 ｐＨ，
结果如图 １所示。
由图 １可知：ｐＨ在 ６􀆰 ０ ～ ７􀆰 ５ 时酶活保存较好，
均在 ８０％以上，超过或低于这个范围都对粗酶液的
酶活影响较大。 而且在此范围内，在沉淀中分配的
酶活较高，而当 ｐＨ 为 ７􀆰 ０ 时，酶活达到最高，可达
到 ９７％。
图 １　 ｐＨ对 ＰＥＧ共沉淀后 ＨＲＰ得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ＨＲＰ ｙｉｅｌｄ ａｆｔｅｒ
ｃｏ⁃ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰＥＧ
２􀆰 １􀆰 ２　 （ＮＨ４） ２ ＳＯ４饱和度对 ＰＥＧ 共沉淀后 ＨＲＰ
得率的影响
在 ｐＨ ７􀆰 ０的条件下，加入 ４０ ｇ ／ Ｌ 的 ＰＥＧ ６０００
后的粗酶液液中，残留的 ＰＥＧ 在不同饱和度的
（ＮＨ４） ２ＳＯ４溶液中分别沉淀，考察沉淀物中的 ＨＲＰ
分配情况，以活力保存率和沉淀酶得率为指标，结
果如图 ２所示。
图 ２　 （ＮＨ４） ２ＳＯ４的饱和度对 ＰＥＧ共沉淀后
ＨＲＰ得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ （ＮＨ４） ２ＳＯ４ ｏｎ ＨＲＰ
ｙｉｅｌｄ ａｆｔｅｒ ｃｏ⁃ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＧ
从图 ２可以看出：当（ＮＨ４） ２ＳＯ４饱和度在 ６５％
以上时，沉淀酶得率很高，同时饱和度在 ７０％以上
时，酶活力保存率骤降。 这是因为随着（ＮＨ４） ２ＳＯ４
饱和度增加，盐析逐渐增强，ＨＲＰ 更趋向随 ＰＥＧ 共
沉淀出来。 当（ＮＨ４） ２ＳＯ４饱和度过大时，盐析作用
过强，虽然酶将大部分甚至全部析出，却使得沉淀
出来的 ＰＥＧ体积减小，加上盐析作用的酶损失，导
致酶的得率下降，达不到提纯的目的，且造成原料
浪费［１５］。 综合这些因素，７０％的（ＮＨ４） ２ＳＯ４饱和度
是非常合适的。
９１　 第 ４期 王作铭等：聚乙二醇共沉淀物复溶萃取辣根过氧化物酶的条件优化
２􀆰 １􀆰 ３　 ＰＥＧ６０００ 用量对 ＰＥＧ 共沉淀后 ＨＲＰ 得率
的影响
取一定量的 ＰＥＧ６０００固体加入粗酶液中，静置
２ ｈ后，加入饱和度 ７０％的（ＮＨ４） ２ＳＯ４固体，同时调
整 ｐＨ至 ７􀆰 ０，考察活力保存率和沉淀酶得率，结果
如图 ３所示。
图 ３　 ＰＥＧ６０００用量对 ＰＥＧ共沉淀后 ＨＲＰ得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＰＥＧ６０００ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ＨＲＰ
ｙｉｅｌｄ ａｆｔｅｒ ｃｏ⁃ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＧ
由图 ３ 可知：ＰＥＧ６０００ 的质量浓度在 ２０ ～ １００
ｇ ／ Ｌ 时，酶活力保存较好，均在 ８０％ 以上。 当
ＰＥＧ６０００在 ８０ ｇ ／ Ｌ以上时，酶活保存率接近甚至超
过 １００％，可能是 ＰＥＧ 对 ＨＲＰ 产生一定的修饰作
用［２０］，另外也保护了大部分 ＨＲＰ 的活力避免其盐
析失活。 随着 ＰＥＧ 的浓度不断提高，沉淀 ＰＥＧ
ＨＲＰ 更完全，其原因可能是通过 ＰＥＧ 挤占水分子，
使蛋白质局部浓度提高，从而易被（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀
出来［２１］。
２􀆰 ２　 单因素实验结果
２􀆰 ２􀆰 １　 液固比对双水相萃取效果的影响
以不同的液固比将 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ６􀆰 ０ ＰＢＳ 与
共沉淀物混合，使共沉淀物复溶解形成不同浓度的
溶液体系，４ ℃静置 ４ ｈ 待体系分层形成稳定的双
水相，测定两相中的 ＨＲＰ 分配系数，结果如图 ４ 所
示。 由图 ４ 可知：随着 ＰＢＳ 的添加比例增加，共沉
淀物开始溶解形成双水相体系，其中，下相磷酸盐
相为 ＨＲＰ 易分配相，当液固比为 ０􀆰 ３０ （ｍＬ ／ ｇ）时，
双水相体系的分配系数为 ０􀆰 ２６４，下相中的得率为
７９􀆰 ２％。 说明在该液固比下，有利于 ＨＲＰ 的溶解释
放且 ＨＲＰ 在下相中的分配比例最高。
２􀆰 ２􀆰 ２　 ｐＨ对双水相萃取效果的影响
调整复溶缓冲液 ＰＢＳ的 ｐＨ，在 ｐＨ ４～９范围内
分别考察 ＰＥＧ 磷酸盐双水相系统中 ＨＲＰ 的分配
情况，结果如图 ５所示。 由图 ５可知：分配系数与得
图 ４　 液固比对双水相萃取效果的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ⁃ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｎ ａｑｕｅｏｕｓ
ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ
率随 ｐＨ变化规律明显，当 ｐＨ 为 ７􀆰 ０ 时，分离的效
果最好。 这可能是带负电荷的蛋白质更倾向于选
择上相，而带正电荷的蛋白质通常分配到下相［２２］，
而 ＨＲＰ 为偏碱性酶，等电点在 ８􀆰 ０ 左右［２３］，当双水
相体系 ｐＨ 大于 ＨＲＰ 等电点时，ＨＲＰ 易富集于上
相；当双水相体系 ｐＨ 小于 ＨＲＰ 等电点时，ＨＲＰ 易
于向下相富集。 ｐＨ 的改变也会影响双水相系统中
无机离子的分配情况及两相之间的电位差，从而影
响 ＨＲＰ 的分配系数和萃取率。 在 ｐＨ ７􀆰 ０ 时 ＨＲＰ
萃取率及分配系数均达到最大值，故体系的 ｐＨ 在
７􀆰 ０左右为最佳。
图 ５　 ｐＨ对双水相萃取效果的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ
２􀆰 ２􀆰 ３　 ＮａＣｌ对双水相萃取效果的影响
中性无机盐常常被应用到双水相体系中来调
节目标物质在两相间的分配，ＮａＣｌ 是其中最常用的
中性盐，目前已有大量通过加入 ＮａＣｌ改善双水相系
统萃取效果的报道［２４－２５］。 本实验在液固比 ０􀆰 ３
（ｍＬ ／ ｇ）的共沉淀物复溶解液中按照 ＰＢＳ 的体积
（Ｌ）与 ＮａＣｌ 的质量（ｇ）外加入 ＮａＣｌ，考察在此双水
相体系中盐浓度对 ＨＲＰ 的分配率的影响，结果见
图 ６。
０２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
图 ６　 ＮａＣｌ对双水相萃取效果的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮａＣｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ａｑｕｅｏｕｓ
ｔｗｏ⁃ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ
从图 ６可以看出：加入 ＮａＣｌ后萃取的得率有所
增加，其中 ４０ ｇ ／ Ｌ的 ＮａＣｌ加入体系时，分配系数达
到最小值，得率达到最大值。 改变无机盐的浓度通
常能改变两相间的电荷差，这是由于无机盐离子优
先分配于一相所引起的［２６］。
２􀆰 ３　 响应面优化实验结果
根据单因素实验结果，采用响应面方法进一步优
化实验条件。 根据 Ｂｏｘ⁃Ｂｅｎｈｎｋｅｎ 中心组合设计原
理，以双水相体系中 Ａ 液固比（ｍＬ ／ ｇ）、Ｂ 体系 ｐＨ、Ｃ
ＮａＣｌ质量浓度为优化因素，以得率 Ｙ 为响应值设计
响应面实验，实验设计及结果如表 １所示。
表 １　 Ｂｏｘ Ｂｅｎｈｎｋｅｎ 实验设计及结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｂｏｘ⁃Ｂｅｎｈｎｋｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ
实验号 Ａ液固比 ／（ｍＬ·ｇ－１）
Ｂ
体系 ｐＨ
Ｃ ρ（ＮａＣｌ） ／
（ｇ·Ｌ－１） Ｙ ／ ％
１ ０􀆰 ３ ６􀆰 ５ ６０ ９０􀆰 １５
２ ０􀆰 ３５ ７􀆰 ０ ２０ ８８􀆰 ５９
３ ０􀆰 ３ ７􀆰 ５ ２ ９０􀆰 ２０
４ ０􀆰 ３ ７􀆰 ０ ４ ９２􀆰 ８９
５ ０􀆰 ３５ ７􀆰 ０ ６ ９０􀆰 ０１
６ ０􀆰 ３ ７􀆰 ０ ４ ９２􀆰 ６３
７ ０􀆰 ３ ６􀆰 ５ ２ ８９􀆰 ３６
８ ０􀆰 ３ ７􀆰 ０ ４ ９３􀆰 ０８
９ ０􀆰 ２５ ７􀆰 ０ ２ ８９􀆰 ００
１０ ０􀆰 ２５ ７􀆰 ０ ６ ８８􀆰 ６８
１１ ０􀆰 ３ ７􀆰 ５ ６ ８９􀆰 ９６
１２ ０􀆰 ３５ ７􀆰 ５ ４ ８９􀆰 ０３
１３ ０􀆰 ３ ７􀆰 ０ ４ ９２􀆰 ６８
１４ ０􀆰 ２５ ７􀆰 ５ ４ ８８􀆰 ５９
１５ ０􀆰 ２５ ６􀆰 ５ ４ ８８􀆰 ２９
１６ ０􀆰 ３ ７􀆰 ０ ４ ９２􀆰 ９３
１７ ０􀆰 ３５ ６􀆰 ５ ４ ８８􀆰 ９０
　 　 双水相萃取的回归方程为：
得率 Ｙ （％） ＝ － ３３３􀆰 ３６ ＋ ５９７􀆰 ２２Ａ ＋ ９３􀆰 ８３Ｂ ＋
３􀆰 １６Ｃ － １􀆰 ６１ＡＢ ＋ ４􀆰 ３３ＡＣ － ０􀆰 ２６ＢＣ － ９９７􀆰 １５Ａ２－
６􀆰 ５８Ｂ２－０􀆰 ３２Ｃ２
双水相萃 ＨＲＰ 的响应面见图 ７， 结合表 ２ 可
知，模型的 Ｆ＝ ２１８􀆰 ５５、Ｐ＜０􀆰 ００１、Ｒ２ａｄｊ ＝ ０􀆰 ９９６ ５ 说明
选用的二次多项式模型具有高度的显著性。 另外，
一次项 Ａ和 Ｃ显著；交互项 ＡＣ 极显著，ＢＣ 显著；平
方项 Ａ２、Ｂ２、Ｃ２均极显著，因此，该模型能够很好地
描述各因素与响应值之间的真实关系。
图 ７　 各因素交互作用对 ＨＲＰ得率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＨＲＰ
根据分析结果可得最佳萃取条件：液固比 ０􀆰 ３
ｍＬ ／ ｇ，ｐＨ ７􀆰 ０２，ＮａＣｌ ４１􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ，双水相萃取 ＨＲＰ 的
１２　 第 ４期 王作铭等：聚乙二醇共沉淀物复溶萃取辣根过氧化物酶的条件优化
得率为 ９２􀆰 ８６％。 结合实际情况考虑，在液固比 ０􀆰 ３
ｍＬ ／ ｇ，ｐＨ ７􀆰 ０，ＮａＣｌ质量浓度 ４２ ｇ ／ Ｌ的条件下进行
３次平行实验，得到 ＨＲＰ 的萃取率为 ９２􀆰 ９８％，与预
测值相对误差 ０􀆰 １３％，与理论值差别较小，说明利
用响应面优化到的实验参数比较可靠。
２􀆰 ４　 ＨＲＰ在不同阶段的提取效果
１００ ｇ 新鲜辣根材料经过超声波降解处理、
（ＮＨ４） ２ＳＯ４盐析、双水相萃取后，其相关数据如表
３ 所示，其中，蛋白质含量测定的标准曲线见图 ８
（ｙ＝ ４􀆰 ９２０ｘ＋０􀆰 ０２６ ２，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９３ ２）。 从表 ３ 可以
看出，过氧化物酶的最终得率达 ８８􀆰 １％，提纯倍数
达 ２１􀆰 ７，而在（ＮＨ４） ２ＳＯ４盐析阶段得率为 ９４􀆰 ７％，
提纯倍数仅为 ４􀆰 ６。 这说明双水相萃取法相比
（ＮＨ４） ２ＳＯ４盐析法易将目标蛋白与杂蛋白分离从
而提 高 酶 的 纯 度［２７］ 。 相 比 之 下， 传 统 的
（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀来提取 ＨＲＰ 的得率一般仅在
７５％ ～８５％ ［１４］ ，该法避免了因（ＮＨ４） ２ＳＯ４盐析导致
酶的较多的失活。
表 ２　 回归模型的方差分析及显著性检验
Ｔａｂｌｅ ２　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ
误差来源 平方和 ｄｆ 均方 Ｆ值 Ｐ值Ｐｒ＞Ｆ 显著性
Ｍｏｄｅｌ ５１􀆰 １２ ９ ５􀆰 ６８ ２１８􀆰 ５５ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
Ｘ１ ０􀆰 ４９ １ ０􀆰 ４９ １８􀆰 ７４ ０􀆰 ００３ ４ ∗
Ｘ２ ０􀆰 １５ １ ０􀆰 １５ ５􀆰 ５９ ０􀆰 ０５０ １
Ｘ３ ０􀆰 ３４ １ ０􀆰 ３４ １３􀆰 １５ ０􀆰 ００８ ４ ∗
Ｘ１ Ｘ２ ０􀆰 ０１ １ ０􀆰 ０１ ０􀆰 ２５ ０􀆰 ６３１ ８
Ｘ１Ｘ３ ０􀆰 ７５ １ ０􀆰 ７５ ２８􀆰 ８２ ０􀆰 ００１ ∗∗
Ｘ２Ｘ３ ０􀆰 ２６ １ ０􀆰 ２６ １０􀆰 ０８ ０􀆰 ０１５ ６ ∗
Ｘ２１ ２６􀆰 １７ １ ２６􀆰 １７ １ ００６􀆰 ８５ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
Ｘ２２ １１􀆰 ３８ １ １１􀆰 ３８ ４３７􀆰 ８３ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
Ｘ２３ ６􀆰 ９０ １ ６􀆰 ９０ ２６５􀆰 ４６ ＜０􀆰 ０００ １ ∗∗
残差 ０􀆰 １８ ７ ０􀆰 ０３
失拟项 ０􀆰 ０４ ３ ０􀆰 ０１ ０􀆰 ４３ ０􀆰 ７４１ ５
纯误差 ０􀆰 １４ ４ ０􀆰 ０３
总和 ５１􀆰 ３０ １６
　 　 　 　 　 　 　 　 　 注：∗∗表示极显著水平（Ｐ＜０􀆰 ００１）；∗表示显著水平（Ｐ＜０􀆰 ０５）。
表 ３　 ＨＲＰ的分离纯化
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｒｏｏｔｓ
纯化步骤 总活力 ／Ｕ
ｍ（总蛋
白质） ／ ｍｇ
比活力 ／
（Ｕ·ｍｇ－１）
得率 ／
％
纯化
倍数
超声浸提液 ９ ４５７ ４９５ １９􀆰 １２ １００􀆰 ０ １􀆰 ０
盐析沉淀 ８ ９５７ １０３ ８７􀆰 ３１ ９４􀆰 ７ ４􀆰 ６
双水相提取 ８ ３３０ ２０ ４１４􀆰 ３０ ８８􀆰 １ ２１􀆰 ７
ＰＥＧ共沉淀物复溶萃取辣根过氧化物酶试样 Ａ
和采用 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ １００层析后的试样 Ｂ，经垂直板
聚丙烯酰胺电泳分离后鉴定的电泳纯度电泳图谱
如图 ８所示。
由图 ８可知：试样 Ａ和试样 Ｂ 通过电泳分离后
形成的后均呈现单一条相同迁移率的图谱带，谱带
无明显的拖尾现象，说明两种样品都具有较高纯
度。 Ａ、Ｂ两种样品的图谱中的条带都介于 Ｍａｒｋｅｒ
图 ８　 辣根过氧化物酶纯化样品的电泳结果
Ｆｉｇ􀆰 ８　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｓｓａｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓａｍｐｌｅ
条带的（４􀆰 ５ ～ ６􀆰 ２） ×１０４之间，折算出的样品中的辣
根过氧化物酶蛋白质相对分子质量应在 ４􀆰 ８×１０４左
２２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １４卷　
右。 试样 Ａ纯度的酶 ＲＺ值在 ２􀆰 ３左右，而试样 Ｂ的
ＲＺ值在 ２􀆰 ４左右。
３　 结论
通过改进的双水相萃取方法得到 ＰＥＧ ＨＲＰ
共沉淀物后，用 ＰＢＳ溶解形成的双水相体系进行萃
取，在单因素的基础上采用 Ｂｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎ 试验设计
以及响应面分析，确定双水相萃取的最优条件为液
固比为 ０􀆰 ３ ｍＬ ／ ｇ、ｐＨ为 ７􀆰 ０２，ＮａＣｌ ４２ ｇ ／ Ｌ。 实验结
果得率达 ８８􀆰 １％，纯化倍数可达 ２１􀆰 ７，试样纯度 ＲＺ
值在 ２􀆰 ３左右。 本实验在（ＮＨ４） ２ＳＯ４沉淀的基础上
结合双水相萃取，很好地对 ＨＲＰ 进行了提取，并且
确立了双水相萃取 ＨＲＰ 的最优条件。
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（责任编辑　 荀志金）
３２　 第 ４期 王作铭等：聚乙二醇共沉淀物复溶萃取辣根过氧化物酶的条件优化