全 文 ：第 １３卷第 ２期
２０１５年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０２􀆰 ００６
收稿日期：２０１４－０３－０１
基金项目：国家自然科学基金（２１２０６１１３、２０９７６１２５）
作者简介：邢肖肖（１９８８—），女，河北沧州人，硕士研究生，研究方向：酶催化；齐　 崴（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｑｉｗｅｉ＠ ｔｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
β 半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖
合成中的应用
邢肖肖，齐　 崴，王梦凡，尤生萍，苏荣欣，何志敏
（天津大学 化工学院 化学工程研究所，天津 ３０００７２）
摘　 要：研究乳酸克鲁维酵母所产 β 半乳糖苷酶的酶学性质及低聚半乳糖（ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＧＯＳ）的酶法合
成条件。 利用高效液相色谱法进行检测，以 ＧＯＳ（聚合度 ｎ＞３）生成量为指标，考察温度、ｐＨ、金属离子种类和浓度
对酶活性的影响，以及 Ｋ＋存在时，底物浓度、反应时间、加酶量对乳糖转化率及 ＧＯＳ 生成浓度的影响。 结果表明：
一价离子对 β 半乳糖苷酶转糖苷活性具有促进作用，其中 Ｋ＋、ＮＨ＋４对水解活性同样起促进作用，而 Ｎａ
＋起抑制作
用；制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为 ３７ ℃、ｐＨ ８􀆰 ０、Ｋ＋ ０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ、初始乳糖质量浓度 ５００ ｇ ／ Ｌ、反应时间 ５ ｈ、加
酶量 １０ μＬ ／ ｇ乳糖，此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到 ９４􀆰 ７４ ｇ ／ Ｌ。
关键词：β 半乳糖苷酶；乳酸克鲁维酵母；低聚半乳糖
中图分类号：ＴＳ２４５􀆰 ６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０２－００３０－０５
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
ＸＩＮＧ Ｘｉａｏｘｉａｏ，ＱＩ Ｗｅｉ，ＷＡＮＧ Ｍｅｎｇｆａｎ，ＹＯＵ Ｓｈｅｎｇｐｉｎｇ，ＳＵ Ｒｏｎｇｘｉｎ，ＨＥ Ｚｈｉｍｉｎ
（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ （ＧＯＳ） ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． ＧＯＳ （ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｎ＞３） ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ
ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ ＨＰＬＣ） ａｎｄ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎｄｅｘ． Ｔｈｅ
ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ａｎｄ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｏｎ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ
ｆｏｒｍｅｄ ＧＯＳ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｋ＋ ． Ｋ＋ ａｎｄ ＮＨ＋４ ｃｏｕｌｄ ａｃｔｉｖａｔｅ
ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ． Ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｎａ＋ ｃｏｕｌｄ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＧＯＳ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ３７ ℃，ｐＨ
８，０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ ｏｆ Ｋ＋，ｉｎｔｉａｌ ｌａｃｔｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５００ ｇ ／ Ｌ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １０ μＬ ／ ｇ
ｌａｃｔｏｓｅ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ＧＯＳ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ ９４􀆰 ７４ ｇ ／ Ｌ ａｆｔｅｒ ５ ｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ；ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ
　 　 非消化性的低聚糖是一类重要的益生因子，具
有低甜度、低热能，促进双歧杆菌生长，促进维生素
合成，预防肠癌，防止便秘，降低胆固醇水平等多种
功效，受到越来越多的关注［１］。 其中，低聚半乳糖
（ＧＯＳ）是欧洲市场上最重要的低聚糖，它是母乳中
最重要的一种益生因子，工业上主要通过 β 半乳糖
苷酶催化高浓度乳糖来制备［２］。
β 半乳糖苷酶可以从动物、植物、微生物（细
菌、酵母或霉菌）中得到，能催化 β Ｄ 半乳糖苷
键的水解反应，也可催化半乳糖基转移生成低聚
半乳糖的转糖苷反应［３－４］ 。 β 半乳糖苷酶水解乳
糖中的 β １，４ 糖苷键，释放出葡萄糖及半乳糖
基，含有羟基的物质可以作为半乳糖基的受体，当
受体为水时生成半乳糖，表现水解活性；受体为葡
萄糖时生成转移二糖，受体为半乳糖时生成半乳
二糖，受体为乳糖时生成三糖，同样三糖也可作为
半乳糖基受体生成四糖，以此类推，生成聚合物更
高的低聚糖半乳糖，表现出转糖苷活性［５］ 。 同时，
生成的低聚半乳糖由于存在 β Ｄ 半乳糖苷键，
也会发生水解，其过程为动力学控制，优化可得最
大低聚半乳糖产量的生成时间。 根据来源不同，
β 半乳糖苷酶性质有所差异［６－７］ ，来源于乳酸克
鲁维酵母的 β 半乳糖苷酶最适催化 ｐＨ 为中
性［８］ ，适于生产低含量乳糖的乳制品及低聚半乳
糖，以治疗乳糖不耐受症和制备功能性食品［９］ 。
众所周知，金属离子对酶性质具有明显影响，
部分一价、二价金属离子对 β 半乳糖苷酶水解活性
及稳定性具有促进作用［９ １０］。 本文中，笔者研究不
同金属离子及其浓度对 β 半乳糖苷酶水解活性、转
糖苷活性的影响，选择能够激活 β 半乳糖苷酶转糖
苷活性的最佳离子及浓度，优化制备低聚半乳糖的
底物浓度、加酶量及反应时间等工艺条件，以期对
工业化制备低聚半乳糖提供借鉴。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 主要试剂
β 半乳糖苷酶 Ｌａｃｔｏｚｙｍ􀳏 Ｐｕｒｅ ２６００Ｌ （２ ６００
Ｕ ／ ｇ），液体酶制剂，提取于乳酸克鲁维酵母，诺维信
生物技术有限公司；乳糖、半乳糖、葡萄糖 （色谱
纯），美国 Ｆｌｕｋｅ公司；其他试剂均为分析纯，购于天
津光复精细化工有限公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 仪器
ＳＷ２２型水浴摇床，优莱博技术（北京）有限公
司；高效液相色谱仪（ＨＰＬＣ），大连依利特分析仪器
有限公司；ＲＩ ７１型示差检测器，日本 Ｓｈｏｄｅｘ公司；
Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ 型糖分析色谱柱（３００ ｍｍ×７􀆰 ８
ｍｍ），美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 低聚半乳糖的 ＨＰＬＣ检测
酶解混合物稀释 ４０ 倍，０􀆰 ４５ μｍ 滤膜过滤后进
色谱检测。 ＨＰＬＣ检测条件：Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ色谱
柱，流动相为 ０􀆰 ０５ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４，流速 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，柱
温 ６５ ℃，示差检测器，进样量 ２０ μＬ。 本文所检测的
低聚半乳糖聚合度 ｎ 大于 ３，其含量通过乳糖、葡萄
糖、半乳糖（色谱纯）的标准曲线计算得到［６］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 β 半乳糖苷酶的最适温度和最适 ｐＨ测定
用 ｐＨ ８ 的 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液配制
２００ ｇ ／ Ｌ乳糖溶液 ２０ ｍＬ置于 ５０ ｍＬ锥形瓶中，加入
１００ μＬ β 半乳糖苷酶酶液，分别置于 ２０、３０、３７、４５
和 ５０ ℃，１６０ ｒ ／ ｍｉｎ水浴摇床中反应 ２ ｈ。 取 ２５０ μＬ
样品稀释 ４０ 倍，过 ０􀆰 ４５ μｍ 滤膜后进色谱检测，测
定不同温度下 β 半乳糖苷酶的转糖苷活性及水解
活性。
用不同 ｐＨ的 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液分别
配制 ２００ ｇ ／ Ｌ 乳糖溶液，各取 ２０ ｍＬ 置于 ５０ ｍＬ 锥
形瓶中，然后加入 １００ μＬ β 半乳糖苷酶酶液，置于
３７ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ水浴摇床中反应 ２ ｈ。 取 ２５０ μＬ样
品稀释 ４０ 倍，过 ０􀆰 ４５ μｍ 滤膜后进色谱检测，测定
不同 ｐＨ 条件下 β 半乳糖苷酶的转糖苷活性及水
解活性。
本文以乳糖的降解率表征 β 半乳糖苷酶的水
解活性，ＧＯＳ 的产量表征 β 半乳糖苷酶的转糖苷
活性。 设乳糖最大降解率时对应酶的最高水解活
力为 １００％；ＧＯＳ 最大产率时对应酶的最高转糖苷
活性，设为 １００％；各温度、ｐＨ 下的酶活与最高酶力
之比为相对酶活。
１􀆰 ２􀆰 ３　 添加不同金属离子考察其对 β 半乳糖苷酶
转糖苷活性及制备 ＧＯＳ的影响
在 ２ ｍＬ用 ｐＨ ８􀆰 ０、５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ配制
的 ２００ ｇ ／ Ｌ乳糖溶液中加入金属离子（Ｎａ＋、ＮＨ＋４、
Ｋ＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｐｂ２＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋和 Ｆｅ３＋ ），使其浓度
分别为 ０􀆰 ００１、０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ，然后加入 ４ μＬ 酶液，
置于 ３７ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ 的水浴摇床中反应 ２ ｈ。 取
２５０ μＬ样品稀释 ４０ 倍，过 ０􀆰 ４５ μｍ滤膜后进色谱
检测，测定金属离子对 β 半乳糖苷酶的转糖苷活
性的影响。
选择对 β 半乳糖苷酶起明显激活作用的离子，
测定其浓度对制备 ＧＯＳ 的影响。 取样过膜后进色
谱检测，测定乳糖降解率及 ＧＯＳ的含量。
１３　 第 ２期 邢肖肖等：β 半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用
１􀆰 ２􀆰 ４　 在 Ｋ＋最适浓度下 ＧＯＳ制备工艺条件优化
１）乳糖浓度及反应时间对 ＧＯＳ合成的影响。
由于底物乳糖浓度不同，达到最大乳糖降解率
和 ＧＯＳ生成量所需的时间不同，所以对不同底物浓
度的酶解反应进行时间动力学分析。 分别取 ２０ ｍＬ
不同质量浓度的乳糖溶液（１００、２００、３００、４００、５００
和 ６００ ｇ ／ Ｌ），分别加入 １００ μＬ β 半乳糖苷酶酶液
和终浓度为 ０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｋ＋，在 ３７ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ
的水浴摇床中反应，依次在反应 ０􀆰 ５、１、２、３、５、７、
１１、１３和 ２２ ｈ时，取 ２５０ μＬ样品稀释 ４０倍，过 ０􀆰 ４５
μｍ滤膜后进色谱检测，测定乳糖及 ＧＯＳ含量。
２）加酶量对 ＧＯＳ合成的影响。
分别取 ２０ ｍＬ 含有 ０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｋ＋的 ４００ ｇ ／ Ｌ
乳糖溶液，分别加入 ２５、５０、７５、１００、１２５ 和 １５０ μＬ
β 半乳糖苷酶酶液，在 ３７ ℃、１６０ ｒ ／ ｍｉｎ 的水浴摇
床中反应 ５ ｈ。 取样过膜后进色谱检测，测定乳糖及
ＧＯＳ含量。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 β 半乳糖苷酶的最适温度和最适 ｐＨ 的测定
结果
　 　 不同来源的 β 半乳糖苷酶酶学性质存在较大
差异［１１］。 因此有必要考察 β 半乳糖苷酶的转糖苷
及水解活性的最适温度和 ｐＨ，结果分别见图 １ 和
图 ２。
图 １　 温度对 β 半乳糖苷酶转糖苷及水解活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ
ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
ｆｒｏｍ Ｋ． ｌａｃｔｉｓ
由图 １和图 ２可知：β 半乳糖苷酶的转糖苷活
性和水解活性的最适温度均为 ３７ ℃，最适反应 ｐＨ
均为 ８􀆰 ０，且温度、ｐＨ变化对酶活影响显著，是影响
β 半乳糖苷酶酶活的主要因素。 这主要是因为此
酶为弱碱性酶，可用于乳糖的降解及低聚半乳糖的
图 ２　 ｐＨ对 β 半乳糖苷酶转糖苷及水解活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋ． ｌａｃｔｉｓ
制备，若要发挥 β 半乳糖苷酶的最大活性，需严格
控制反应的温度和 ｐＨ。
２􀆰 ２　 金属离子对 β 半乳糖苷酶转糖苷活性的
影响
　 　 金属离子能够影响酶活性，可以激活或抑制酶
的活性位点，考察不同金属离子对 β 半乳糖苷酶转
糖苷活性的影响，结果见图 ３。 由图 ３ 可知：浓度为
０􀆰 ０００ １ ｍｏｌ ／ Ｌ时，所考察的金属离子（除 Ｚｎ２＋外）对
β 半乳糖苷酶的转糖苷活性均无明显影响，原因可
能是离子浓度太低，没有达到激活或抑制酶活的浓
度阈值，而 Ｚｎ２＋抑制明显，是因为微量 Ｚｎ２＋即能破坏
酶蛋白的构象；当浓度为 ０􀆰 ０１ ｍｏｌ ／ Ｌ 时，一价离子
（Ｎａ＋、Ｋ＋和 ＮＨ＋４）对转糖苷酶活性起到激活作用，而
其他离子对酶活均为抑制作用。
图 ３　 金属离子对 β 半乳糖苷酶转糖苷活性的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋ． ｌａｃｔｉｓ
研究 ３种一价离子浓度对 β 半乳糖苷酶酶活性
质的影响，结果见图 ４。 由图 ４ 可知：随 ＮＨ＋４、Ｋ
＋和
Ｎａ＋浓度增大，β 半乳糖苷酶转糖苷活性（即 ＧＯＳ 浓
度）呈抛物线形，与温度和 ｐＨ 对酶活影响的钟罩型
一致，并且 ＮＨ＋４、Ｋ
＋和 Ｎａ＋均在 ０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ 时具有最
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
大转糖苷活性的激活能力，超过 ０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ 时激活
作用降低，甚至对酶活表现出抑制作用，可能是高浓
度离子影响了酶活中心必需基团的解离状态，从而影
响了酶活；但 ＮＨ＋４、Ｋ
＋和 Ｎａ＋对 β 半乳糖苷酶的水解
活性表现不一致，随 ＮＨ＋４和 Ｋ
＋浓度增大，水解活性同
样先增大后减小，与转糖苷活性一致，在 ０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ
浓度时达到最大，而随 Ｎａ＋浓度增大，乳糖的转化率
逐渐下降，即 Ｎａ＋对乳糖降解表现出抑制作用，这与
文献［１０］报道的 Ｎａ＋可以抑制酶向水解方向进行一
致。 在相同条件下，Ｋ＋表现出更优越的乳糖水解活性
及转糖苷活性，低聚半乳糖含量提高了 １倍。
图 ４　 一价离子浓度对 β 半乳糖苷酶合成
ＧＯＳ及乳糖转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ
ｌａｃｔｏｓｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ＧＯＳ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
ｆｒｏｍ Ｋ． ｌａｃｔｉｓ
２􀆰 ３　 Ｋ＋存在时 ＧＯＳ制备工艺条件的优化结果
进一步考察 Ｋ＋存在时，底物乳糖浓度对 β 半
乳糖苷酶合成 ＧＯＳ 及乳糖转化率的影响，结果见图
５。 由图 ５ 可知：随着反应时间的延长，同一底物
（乳糖）浓度下，ＧＯＳ的生成浓度呈先上升后下降的
变化趋势，而乳糖转化率则呈上升趋势，说明 ＧＯＳ
的合成存在最适酶反应时间，反应时间太短和太长
都不利于 ＧＯＳ的生成。 这是由于 β 半乳糖苷酶存
在水解和转糖苷双重活性，ＧＯＳ 的分解与合成同时
进行，反应前 ５ ｈ，ＧＯＳ 合成速率高于分解速率，之
后分解速率高于合成速率。 因此，选择最适反应时
间为 ５ ｈ。
图 ５　 Ｋ＋存在时底物乳糖浓度对 β 半乳糖苷酶
合成 ＧＯＳ及乳糖转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ＧＯＳ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｃｔｏｓｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｂｙ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋ． ｌａｃｔｉｓ
底物乳糖浓度是影响 ＧＯＳ 合成的显著条件
之一。 由图 ５ 还可知：在不同底物浓度下，ＧＯＳ
生成浓度和乳糖转化率随时间延长呈现相同的
变化趋势：底物浓度增大，乳糖转化率减小，而
ＧＯＳ 生成浓度增加至 ９４􀆰 ７４ ｇ ／ Ｌ。 乳糖分子在
β 半乳糖苷酶作用下生成半乳糖基，水和糖类分
子均可作为半乳糖基的受体分别生成半乳糖和
低聚半乳糖，两者作为受体的几率基本相同；乳
糖浓度增大，可增加乳糖作为受体的几率，这是
乳糖浓度对 ＧＯＳ 合成的影响原因。 底物乳糖浓
度增大，虽然使乳糖转化率降低，但 ＧＯＳ 生成量
增大且乳糖价格低廉，综合分析，选择 ５００ ｇ ／ Ｌ 乳
糖为最佳条件。
考察加酶量对 β 半乳糖苷酶合成 ＧＯＳ 及乳糖
转化率的影响，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：加酶量越
大，乳糖的转化率越高；当加酶量达到 Ｖ（酶） ／ ｍ（乳
３３　 第 ２期 邢肖肖等：β 半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用
糖）＝ １０ μＬ ／ ｇ时，ＧＯＳ的生成质量浓度达到最大值
９４􀆰 ７４ ｇ ／ Ｌ；当加酶量不足或超过 １０ μＬ ／ ｇ 乳糖时，
ＧＯＳ产率均降低。 这是因为当加酶量较小时，酶催
化能力不足，反应速率较低，难以获得较高的 ＧＯＳ
生成浓度；当加酶量较大时，ＧＯＳ 的分解速率高于
合成速率，使 ＧＯＳ生成浓度降低；因此选用 １０ μＬ ／ ｇ
乳糖作为最适加酶量。
图 ６　 Ｋ＋存在时加酶量对 β 半乳糖苷酶合成
ＧＯＳ及乳糖转化率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ＧＯＳ ｆｏｒｍａ⁃
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｃｔｏｓｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｂｙ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋ． ｌａｃｔｉｓ
３　 结论
以商业乳酸克鲁维酵母所产 β 半乳糖苷酶为
研究对象，考察了酶学性质（温度、ｐＨ、金属离子种
类和浓度对酶活的影响）及其催化乳糖的反应过程
中各条件（底物浓度、反应时间和加酶量）对 ＧＯＳ生
成及乳糖转化率的影响；确定一价离子（Ｋ＋、ＮＨ＋４和
Ｎａ＋）对 β 半乳糖苷酶转糖苷活性具有激活作用，
其中 Ｋ＋、ＮＨ＋４对 β 半乳糖苷酶水解活性有激活作
用，而 Ｎａ＋具有抑制作用；优化了酶法制备 ＧＯＳ 的
最佳条件：３７ ℃、ｐＨ 为 ８􀆰 ０ 的 Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液、
０􀆰 ０８ ｍｏｌ ／ Ｌ ＫＣｌ，起始乳糖浓度 ５００ ｇ ／ Ｌ，加酶量 １０
μＬ ／ ｇ乳糖，反应 ５ ｈ，ＧＯＳ 质量浓度可达到 ９４􀆰 ７４
ｇ ／ Ｌ。
参考文献：
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ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ β⁃Ｄ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｏｒ ｌａｃｔｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ
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中国食品添加剂，２０１１（１）：２０５⁃２０９．
［ ３ ］ 　 Ｇａｒｍａｎ Ｊ， Ｃｏｏｌｂｅａｒ Ｔ， Ｓｍａｒｔ Ｊ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌａｃｔｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｂｙ β⁃
ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｓｉｘ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６，４６：２２⁃２７．
［ ４ ］ 　 Ｍａｋｓｉｍａｉｎｅｎ Ｍ， Ｐａａｖｉｌａｉｎｅｎ Ｓ， Ｈａｋｕｌｉｎｅｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ
β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ｓｐ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ［ Ｊ］ ． ＦＥＢＳ
Ｊ，２０１２，２７９（１０）：１７８８⁃１７９８．
［ ５ ］ 　 Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ⁃Ｃｏｌｉｎａｓ Ｂ， Ａｂｒｅｕ Ｍ Ａ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ⁃Ａｒｒｏｊｏ Ｌ， ｅｔ ａｌ．
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏ⁃ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｅｔａ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
ｆｒｏｍ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ
ｃｅｌｌｓ ｖｅｒｓｕｓ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０１１，５９
（１９）：１０４７７⁃１０４８４．
［ ６ ］ 　 Ｇｏｓｌｉｎｇ Ａ，Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｇ Ｗ，Ｂａｒｂｅｒ Ａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ［Ｊ］ ．
Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０１１，５９（７）：３３６６⁃３３７２．
［ ７ ］ 　 Ｖｅｒａ Ｃ， Ｇｕｅｒｒｅｒｏ Ｃ， Ｃｏｎｅｊｅｒｏｓ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏ⁃
ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ ｂｅｔａ⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ｕｓｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｓａｔｕｒａｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｏｓｅ
［Ｊ］ ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，５０（３）：１８８⁃１９４．
［ ８ ］ 　 Ｍａｒｔíｎｅｚ⁃Ｖｉｌｌａｌｕｅｎｇａ Ｃ， Ｃａｒｄｅｌｌｅ⁃Ｃｏｂａｓ Ａ， Ｃｏｒｚｏ Ｎ， ｅｔ ａｌ．
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｄｕｒｉｎｇ ｌａｃｔｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｂｙ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｌａｃｔｉｓ （Ｌａｃｔｏｚｙｍ ３０００ Ｌ ＨＰ Ｇ）［Ｊ］ ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００８，１０７（１）：
２５８⁃２６４．
［ ９ ］ 　 Ｄｅｍｉｒｈａｎ Ｅ，Ａｐａｒ Ｄ Ｋ，Öｚｂｅｋ Ｂ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ
Ｍｇ２＋，Ｍｎ２＋ ａｎｄ Ｃａ２＋ ｉｏｎｓ ｏｎ ｗｈｅｙ ｌａｃｔｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ β⁃
ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，８３
（５）：６２５⁃６３６．
［１０］ 　 Ｆｌｏｒｅｓ Ｍ Ｖ，Ｅｒｔｏｌａ Ｒ Ｊ，Ｖｏｇｅｔ Ｃ Ｅ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ
ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ β⁃ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ
［Ｊ］ ．ＬＷＴ：Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９６，２９：５０３⁃５０６．
［１１］ 　 陈真真，张涛，江波，等．低聚半乳糖酶法合成条件的研究［ Ｊ］ ．
食品与发酵工业，２０１２，３８（１０）：３５⁃３９．
（责任编辑　 荀志金）
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷