全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 3期
2008年 6月
Vol. 20, No. 3
Jun., 2008
基于发光共轭聚合物的核酸生物传感器 *
唐艳丽，王 树**
（中国科学院化学研究所有机固体重点实验室，北京 100080）
摘　要：本文介绍了以发光共轭聚合物为基础，以荧光为检测手段，针对核酸进行特异性识别的一类
检测信号放大的生物传感器。主要介绍了 DNA和 RNA的几种检测方法，探讨了影响荧光传感信号的
因素。
关键词：发光聚合物；核酸(DN A 或 RNA)检测；荧光信号放大；生物传感器
中图分类号：Q631.11；TP212.3　　文献标识码：A
文章编号 ：1004-0374(2008)03-0383-07
近年来，共轭聚合物与生命科学的交叉学科吸
引了众多科研工作者的兴趣。基于共轭聚合物的新
型生物传感器在医疗诊断、基因突变观测、基因传
输监控、环境检测以及国家安全防御等方面具有广泛
的应用前景，是目前共轭聚合物研究的热点之一[1-9]。
在光化学传感器研究中，作为光学识别信号转换功
能的敏感材料是影响传感器性能的最重要因素之
一，它决定了传感器的检测灵敏度。因此，设计、
发展优良的敏感材料一直是传感器研究的热点。近
年来，发光聚合物(CPs)作为生物传感元件越来越
受到人们的关注。CPs具有强的吸光能力，并且分
子链具有“分子导线”功能，其共轭骨架允许电
子或能量在整条链上自由流动。当淬灭剂结合到链
上的任何一个位点时，就会阻碍整条链上的电子或
能量流动，从而改变其荧光特性，即一个淬灭剂可
能淬灭整条共轭聚合物链发出的荧光，这样就产生
了增强的电子传递淬灭效果(图 1)。CPs由于这些独
特的光电性质而成为一类新型的传感材料，可作为
化学和生物靶分子高度反应性的光学传导体，可用
来放大荧光传感信号，为生物传感器的发展提供了
新的传感模式[10-13]。
在CPs的主链上接上带电荷基团(如N(CH3)4+与
SO3--)的支链可使其具有水溶性，水溶性为 CPs与生
物基质，如蛋白质和DNA的相互作用提供了基本条
件[14]。常用的水溶性 CPs有聚噻吩、聚芴、聚苯
乙炔、聚苯乙烯以及它们的衍生物等，这些聚合物
的特点是主链上都有共轭的芳香环结构，侧链带有
阴离子或阳离子基团，能与带电荷的蛋白质或核酸
收稿日期：2008-02-25
基金项目：中国科学院“百人计划”项目
*原英文报告名：Flurometric assays for DNA and pro-
tein with conjugated polyelectrolytes
**通讯作者：E-mail: wangshu@iccas.ac.cn
形成复合物。在众多的 CPs中，阳离子发光聚合物
由于在DNA或RNA特异性识别生物传感器上的应用，
近几年来，成为相关研究者们广泛关注的热点[15-25]。
1　基于发光共轭聚合物的DNA生物传感器
1.1　无荧光标记探针的DNA检测　对于寡核苷酸的
快速检测、传染病和各种基因疾病的诊断需要有简
单而可靠的序列特异性识别检测方法。2002年，加
拿大Leclerc研究组[15]报道了一种新的电活性和光活
性的水溶性阳离子聚噻吩衍生物，用它和一条含特
定序列的捕获探针可以很容易地将寡聚核苷酸杂化
转化为清楚明显的荧光与紫外 - 可见光信号输出。
这种方法简单、快速，不需要探针和被分析物参与
任何的化学反应。该方法的理论基础是：由于单链
DNA(ssDNA)呈柔性结构，而双链DNA(dsDNA)由
于双螺旋的形成而呈刚性结构，所以它们通过静电
力与阳离子聚噻吩相互作用所诱导的聚噻吩的共轭
链的构型明显不同。聚噻吩在仅有探针 ssDNA(X1)
存在时，共轭链以平面构型存在，这种构型容易引
起分子间的聚集，使荧光发生淬灭；当目标检测
ssDNA(Y1)加入后，由于 Y1与探针 X1杂化形成
dsDNA, CD谱表明阳离子聚噻吩共轭链以双螺旋构
型存在，最大程度的避免了平面化，聚噻吩发出荧
384 生命科学 第20卷
光。当加入相对于探针X1具有两个碱基错配的目
标 ssDNA (Y2)时，由于杂化形成 dsDNA 受到限
制，导致聚噻吩的荧光被淬灭。利用这个方法还可
以区别一个碱基不配对(Y3)的情况。这种方法的检
测限为 2×10-14 mol/L。
2003年，Nilsson和 Inganäs[26]报道了一种具有
高度序列特异选择性的荧光DNA杂化检测方法。该
方法中的光传感元素是一种水溶性的具有电活性和
光活性的聚噻吩(POWT：poly-｛3-[(s)-5-amino-5-
c a r b o x y - 3 - o x a p e n t y l ] - 2 , 5 - t h i o p h e n y l e n e
hydrochloride｝）。POWT侧链为氨基酸基团，随
着 pH值的变化，侧链所带电荷也发生变化。具有
非平面化螺旋结构的POWT在室温保温5min后，荧
光发射光谱在 540nm处呈现最大发射峰，另外由于
聚合物链间的聚集，光谱在较长波长(595 nm)处出
现肩峰，使得荧光量子产率从单链状态的 26％下降
到 4％。当加入一个具有 20个碱基长度的 ssDNA
时，POWT在碱性溶液保温下，540nm处的荧光
发射峰强度会下降， 而 595nm处的发射峰强度增
强，但荧光量子产率却没有提高。这表明 POWT
由于与寡核苷酸发生了相互作用，从而使得 POWT
分子链间的聚集进一步增强。他们认为 ssDNA带负
电荷的磷酸骨架与聚合物侧链带有正电荷的氨基发
生了静电相互作用，POWT分子内氨基与羧基间的
相互作用被破坏，这些因素导致了聚合物构型的平
面化，结果使DNA链的碱基与邻近聚合物链的羧基
形成氢键，这样就产生了聚合物链的聚集。在这个
体系中再加入一条20个碱基长度的配对DNA单链，
由于发生DNA杂化，POWT的最大发射波长移至
约 585nm处，且荧光强度增强。该发射峰的产生
可能是由于 POWT分子链内相互作用的原因。因为
互补碱基之间形成了氢键，聚合物链与 ssDNA链之
间的氢键遭到破坏，导致了聚合物链与链之间分
开，荧光量子产率大大提高。该方法能在室温下检
测单碱基不配对 ssDNA而不需要杂化升温步骤，检
测限是 10-11 mol/L。当聚合物沉积到玻璃表面上，
DNA与聚合物间的相互作用同样能被检测，为基于
生物芯片的DNA检测提供了新方法。
1.2　荧光素标记 PNA作探针的 DNA检测　近年
来，肽核酸(PNA)的研究在基因研究方面开辟了一
个新的方向[27,28]。在 PNA中，DNA带负电荷的磷
酸链被中性的多肽链所取代，从而缺少了DNA负电
荷间的库仑斥力，使得 PNA/DNA的结合比DNA/
DNA更快、更稳定且更具特异识别性[29]。与dsDNA
相比，PNA/DNA结合物更具热稳定性，不易被核
酸酶、蛋白酶和肽酶等生物降解[30,31]。另外，溶
液离子强度和pH值对PNA/DNA的杂化影响较小，因
而提供了一个更宽的DNA检测平台。Gaylord等[16]提
出了一个以荧光素标记的 PNA(PNA-Fl)为探针检测
DNA的方法。阳离子聚芴(CCP)和荧光素的选择符
合Förster荧光共振能量转移(FRET)的光学要求，即
CCP的发射光谱与荧光素的吸收光谱有较好的重
叠。在溶液中加入CCP和 PNA-Fl探针，由于PNA-
Fl不带电荷，所以不存在 CCP与 PNA-Fl之间的静
电相互作用，CCP与荧光素距离较远，而不能产生
有效的 FRET。向上述溶液中加入 ssDNA，有以下
图1　共轭聚合物荧光超淬灭示意图
385第3期 唐艳丽，等：基于发光共轭聚合物的核酸生物传感器
两种情况发生：情况 A 对应于加入完全配对的
ssDNA，它随即与探针PNA杂化得到双螺旋ssDNA/
PNA-Fl，CCP通过静电相互作用与之形成复合物
CCP/ssDNA/PNA-Fl，CCP与荧光素之间距离缩
短，发生有效的 FRET，荧光素发射强的荧光；当
加入不配对的 ssDNA(情况B)时，ssDNA与 PNA不
能杂化，仅在 CCP和 ssDNA之间存在静电相互作
用，因此 CCP与荧光素之间 FRET距离仍会较长，
而不能有效地传递能量，荧光素不发射荧光。
PNA/DNA 间的杂化因此可用增强的荧光素荧光发射
强度来测量。在完全配对的 ssDNA目标分子存在
下，荧光素的荧光发射强度是直接激发荧光素产生
的荧光强度的 25倍，这表明荧光素发射的增强是
CCP的光学信号放大效应引起的，该方法的检测限
为 10pmol/L。Gaylord等还对能量转移效率进行了
优化选择，实验表明，当[CCP]/[PNA- Fl]=1:1(电
荷比)时，FRET效率最高；当[CCP]/[PNA- Fl]<1
时，不是所有的 ssDNA/PNA-荧光素杂化链都能有
效的与 CCP链结合；当[CCP]/[PNAs-Fl]>1时，不
是所有的 CCP发射的光子能传递到 ssDNA/PNA-Fl
杂化链上，因而都降低了 FRET效率。这种方法可
用于 PCR分析。另外，由于 PNA可与 dsDNA结
合形成三螺旋结构，因此 PNA-Fl/CCP这一传感器
平台能用于 dsDNA的直接检测。
对Gaylord等提出的这个DNA特异检测方法，
Xu等[32]用超快速光谱技术(pump-dump-emission
spectroscopy，PDEs)对 FRET过程进行了时间分辨
研究。该技术已被用来研究发光高分子材料激发态
的淬灭动力学和电荷产生的机制[33-35]。PDEs技术提
供了飞秒级的时间分辨，提高了信噪比，且不受溶
液的干扰，因此在极稀溶液中，PDEs对时间分辨
能量传递动力学的检测设计是一个理想的选择，远
优于传统的 pump/probe实验。实验表明，在中等
浓度的水溶液中，从聚合物CCP到荧光素的能量传
递动力学指数是二级。同时发现不完全配对的
PNA/DNA也存在有效的 FRET；改用水和NMP有
机溶剂混合液，可提高选择性，但能量传递效率降
低。在水溶液中，静电和疏水的协同相互作用使得
CCP与荧光素的距离较近；在水和NMP混合溶剂
中，CCP主链与DNA碱基之间的疏水相互作用被
大大削弱，使得 CCP与荧光素的距离变远。这些
结果表明，静电和疏水性相互作用共同影响着CCP/
PNA-Fl/DNA复合物的结构。
1.3　荧光素标记 DNA作探针的DNA检测　虽然
PNA得到广泛应用，用 PNA作探针也有许多优点，
但是DNA的合成、纯化和标记更简单可行，DNA/
DNA杂化作用在生物体内更普遍，因而能更好的被
人们理解。Gaylord等[17]在原来实验方案的基础上
用荧光素标记的DNA(DNA-Fl)代替 PNA- Fl作探
针，来研究 DNA序列的特异识别。实验表明，当
阳离子聚芴(CCP)与 dsDNA的电荷浓度比为 1:1时，
FRET效率最高，并且加入完全配对的目标DNA 能
量传递效率是不完全配对目标DNA的3倍；缓冲液
离子浓度越高，FRET效率越低，表明了静电相互
作用在控制发光聚合物和DNA之间的距离上起着决
定作用。对 CCP结构和光学特性进一步优化、更
好的理解控制发光聚合物和DNA结合的作用力，将
有望获得实际意义上的 DNA检测。
1.4　基于DNA嵌入剂的DNA检测　用上述1.3段中
的方法来检测DNA的特异性识别，尽管操作简单可
行，但由于不完全配对的DNA与 CCP也会发生作
用，产生较弱的 FRET，因而该方法的缺点是背景
噪音信号较高。为提高该DNA检测方法的选择性，
2004年Wang等[18]提出在CCPs/DNA-Fl/ssDNA这个
体系中加入dsDNA嵌入剂溴乙锭(EB)，文献[36-38]
报道 EB嵌入到 dsDNA碱基对的内部，可使荧光量
子产率增加，通过 FRET将 CCP激发能传递到 EB
上，EB只有在加入特定序列的DNA发生DNA/DNA
杂化形成 dsDNA时，才能发出荧光。该法极大地
提高了DNA 检测的选择性。Wang等[18]设计的第一
种方案是：在 CCP、无标记的 ssDNA探针和 EB混
合液中加入未知目标 ssDNA，如果两条 ssDNA是
完全配对的，则会形成DNA的双螺旋结构，EB嵌
入到 dsDNA中，静电作用拉近了 CCPs与 dsDNA/
EB大分子间的距离，激发 CCP后，通过 FRET能
量传递到 EB，EB发射出荧光；如果加入的是不完
全配对的目标 ssDNA，则不能形成双螺旋结构，EB
不能插入到DNA中，因 EB为阳离子，与 CCPs有
静电排斥作用，给体和受体距离较远而不发生
FRET，因而检测不到 EB的荧光。
从溶液中获得的荧光光谱图可看出，FRET的
效率并不高，作为一个传感器系统，以荧光为基础
的检测能区分 ssDNA和 dsDNA，但不灵敏。从
Förster能量转移方程可以看出 EB与 CCP之间低效
的 FRET是由于CCP与EB间不匹配的方位因子(k2)
造成的[39,40]。为提高 FRET效率，Wang等在探针
386 生命科学 第20卷
ssDNA的 5末端引入了荧光素作标记，由于荧光素
可围绕DNA的 5末端自由旋转，这样 CCP与荧光
素之间，荧光素与 EB之间的方位因子匹配均得到
了优化，实际上荧光素起到了CCP与EB 之间FRET
桥的作用，体系A：加入完全配对的目标 ssDNA，
它能与探针 ssDNA-C* 形成双螺旋结构，EB嵌入到
dsDNA-Fl中，激发CCP时能量首先传递到 dsDNA-
Fl(ET-1)，再从dsDNA-Fl传递到EB(ET-2)， EB发出
荧光；体系 B：加入了不完全配对的目标 ssDNA，
它不能与探针 ssDNA-Fl杂化形成双螺旋结构，则
EB不能嵌入到DNA中因而不会激发出荧光。荧光
素的引入改善了从CCP到EB的整个能量传递过程，
有效放大了 CCP到 EB 的 FRET信号, EB发出增幅
8 倍的荧光。
1.5　固相介质上的DNA检测　前面几种针对DNA
的检测都是在溶液中进行的，所用的发光聚合物、
生物分子探针和目的检测物都能溶解在水溶液中，
荧光能量传递在溶液中进行。2002年，Kushon等[41]
提出了一种新的检测体系，将发光聚合物材料固定
在微球表面，实现了对炭疽热病毒相关序列的检
测。所用的发光聚合物是聚苯乙炔(PPE)和生物素
衍生化的聚苯乙炔(PPE-B)。PPE是典型的导电高分
子材料，同时也是良好的荧光材料。PPE可通过自
组装或共价键合的方式连接到聚苯乙烯微球表面，
同时仍保持了荧光特性和超淬灭能力。实验所选用
的聚苯乙烯微球，表面用抗生蛋白链菌素预先处理
过之后，再将生物素衍生化的生物分子探针 ALF-
Capture和聚合物连接在微球表面，当加入带有淬灭
剂的靶基因DNA-QTL，就产生了超淬灭现象；当
加入目的检测物 ALF-Target之后，再加入 DNA-
QTL，由于ALF-Target和DNA-QTL与生物分子探
针的结合存在竞争，荧光淬灭程度减弱，并且减弱
的程度是与加入的ALF-Target量有关，因此可定量
的检测ALF-Target；类似的，先在溶液中加入ALF-
Target、ALF-Capture和固定量的DNA-QTL，使两
种含ALF的靶基因与ALF-Capture竞争结合，再加
入聚苯乙烯微球，淬灭的程度仍依赖于ALF-Target
加入的量。实验表明，该方法可简捷、快速、灵
敏地检测DNA，利用该方法还实现了对单碱基错配
的检测 [ 42 ]。
2　基于发光共轭聚合物的RNA生物传感器
2.1　以多肽为探针的RNA检测　RNA-蛋白质之间
的相互作用调节着细胞内转录、转录后修饰、RNA
分裂和复制过程[43-46]。许多致病病毒像艾滋病病毒
类型 1(HIV-1)[47]、picornaviruses[48]和肺炎病毒[49]的
复制循环依赖于RNA和蛋白质之间高度的特异性相
互作用。Wang等[19]提出了一种基于发光共轭聚合
物的荧光信号高倍增幅的RNA检测方法。此方法检
测包括三个要素：CCP、荧光素标记的多肽探针
(protein-Fl)和待检测的靶基因 RNA。
在 CCP与探针 protein-Fl溶液中加入 RNA，情
况A：加入了与protein-Fl特异性识别的RNA，RNA
与 protein-Fl发生结合，由于 RNA本身带负电荷的
缘故，CCP与 protein-Fl/RNA通过静电相互作用形
成三元复合物 CCP/protein-Fl/RNA，拉近了 CCP与
荧光素之间的距离，能够发生有效的 FRET；情况
B：加入了非特异性识别的 RNA，它与 protein-Fl
不能结合， CCP与RNA通过静电相互吸引结合在一
起并远离 protein-Fl，因而不能发生有效的 FRET。
为了证实这一原理，文献[50,51]选用HIV-1的信使
RNA部分 TAR RNA作为靶基因，以荧光素标记的
与艾滋病相关的多肽 Tat-Fl为探针[50,51]，在 CCP、
Tat-Fl混合液中加入 TAR RNA，Tat-Fl特异性识别
TAR RNA，由于 CCP与 TAR RNA的静电相互吸
引，激发 CCP时能量转移到荧光素，荧光素发出
增幅 40倍的荧光；反之，在 CCP、Tat-Fl混合液
中加入非特异性识别 dTAR RNA, 在 CCP、非特异
性识别SH3-C 混合液中加入TAR RNA, 则没有FRET
发生，荧光素不发出荧光。该方法具有灵敏性高和
选择性好的特点，为人类艾滋病毒的诊断检测开启
了一个新的突破口。
2.2　荧光素标记的 RNA为探针的 RNA检测　对
RNA的检测方法常用的有凝胶分析法[52,53]、表面等
离子体共振技术[54-56]和 UV熔解曲线分析[57]。但这
些方法费时，且RNA样品量消耗大。2004年Liu等[21]
报道了一种用荧光素标记的 RNA(RNA-Fl)作探针，
依靠CCP与RNA静电相互作用的区别来检测靶基因
RNA的新方法。检测的目标靶基因 RNAT与 RNA-
Fl通过 tetraloop/receptor interaction(TRIs)[53,58]形成复
合物，增加了负电荷数，阳离子聚芴衍生物 CCP
与RNAT/RNA- Fl间静电作用相比于RNA-Fl单独存
在时增强，从而缩短了CCP与荧光素间的距离，提
高了FRET效率，增强了荧光素的荧光强度。RNA1
带有GAAA四级环，5末端用荧光素标记(RNA1-
Fl)，用它作为探针，非特异性的 RNA2-4作为靶基
因。RNA1与RNAT形成二聚体的水平反映在FRET
387第3期 唐艳丽，等：基于发光共轭聚合物的核酸生物传感器
的效率光学信号的放大上。在 3 8 0 n m 处激发，
[RNA1-Fl]=100 nmol/L，[CCP]=4×10-6 mol/L时，
RNA1-Fl与 RNA2-4的二聚化依次降低，荧光素的
荧光强度依次减少，这样就可以有效地对目标RNA
进行检测。进一步了解控制 CCP和 RNA相互作用
的机制，进一步优化 CCP的性质，在 RNA库中对
RNA-RNA之间的三级相互作用可望获得实际意义上
的检测。
3　影响 FRET效率的一些因素
根据 Förster能量传递方程[59]，FRET的效率与
以下几个方面有关：(1) 给体的发射光谱与受体的吸
收光谱的重叠积分；(2)给体和受体激发态偶极间的
相对取向；(3)给体和受体分子间的距离。研究者
们对基于荧光的核酸检测实验，发光聚合物与受体
分子间的FRET效率作了详细的研究。影响FRET效
率的因素主要有：荧光能量受体的选择、CCP的
重复单元数、CC P 侧链的长度、溶剂的极性等。
3.1　CCP的重复单元数对FRET的影响　CCP作为
荧光化学和生物学传感器平台[5,10,11]，优点在于：相
对于小分子而言，可通过分子内和链内的能量传递
将信号放大[12,13]。因此，CCP的重复单元数(RU)对
FRET效率有较大的影响。Wang等[23]研究了 RU和
FRET效率之间的关系，发现随着 RU值的增大，
FRET效率也随着增加。另据文献[60]报道，对于
分子内的能量传递，共轭聚合物的有效共轭单元数
为6－8个。
3.2　CCP侧链的长度对FRET的影响　Liu等[22]通过
实验发现，在水溶液中，带较长侧链的寡聚物有较
好的能量传递效率和较高的 Stern-Volmer淬灭常数
(K sv) ；在甲醇中，能量传递效率差别不大，但带
较短侧链的寡聚物有较高的Ksv。可能的解释是CCP
侧链随着链长的增加则疏水性增加，在水溶液中，
CCP与ssDNA-Fl由于疏水相互作用而更加接近，Ksv
增大，能量传递效率也增加；在甲醇中，疏水性
作用减小，侧链较短，则给体 CCPs与受体荧光素
之间的距离缩短，FRET效率较高，Ksv也随着增加。
3.3　溶剂对 FRET的影响　发光聚合物的光、电性
质受分子结构和超分子组装的控制[61]。研究者们为
探索在光电器件使用中怎样优化分子链间的排列，
深入研究了发光聚合物在有机溶剂中的聚集行为[62-65]。
了解 CCP在溶液中的聚集行为，可以阐明 CCP传
递光电信号的原理。2004年，Wang和 Bazan[66]报
道了在水溶液中，随着加入的有机溶剂四氢呋喃
(THF)量的不同，水溶性发光聚合物 CCP呈现不同
的聚集倾向，以及这些不同聚集倾向对 FRET的影
响。实验表明，当 THF/H2O=60:40(v:v)时，CCP
荧光强度最大；当 TH F%> 80 %，强度下降；当
THF在 30％— 80％间，CCP最大发射波长蓝移到
414 nm，当 THF/H2O=90:10时, 最大发射波长红移
到 423 nm。这些结果表明 CCP存在两种不同的聚
集态。在水溶液中，类似于胶束的结构，CCP的
聚集受分子链间的疏水性相互作用主导，侧链中的
正电荷朝向外部水溶液，由于 π−π相互作用导致自
淬灭而降低了发射强度，当加入 Tex Red标记的
DNA时，虽然发生能量转移，但 FRET效率不高；
加入THF则破坏了这种聚集态，分子链间的堆积减
少则自淬灭减少，荧光量子产率增强，当加入 Tex
Red标记的 DNA时，发生能量转移，且 FRET效
率较高；当 THF含量超过 80％时，由于静电相互
作用占主导，类似于反向胶束的结构，CCP形成了
一种新的聚集态，正电荷朝向内部，主链朝向外部
溶液，由于 π−π相互作用导致自淬灭而降低了发射
强度，当加入 Tex Red标记的DNA时，由于 CCP
与DNA之间的静电作用非常弱，几乎不发生能量转
移。这些结果表明溶剂的极性影响发光聚合物的聚
集态，进一步影响 FR ET 效率。
4　总结
本文对近几年来基于发光共轭聚合物的核酸检
测方面的一些重要研究工作了简要概述。共轭聚合
物具有强的光捕获能力，具有倍增光学响应性，可
用来放大荧光传感信号，为生物传感器的发展提供
了新的传感模式。最近我们以水溶性共轭聚合物作
为新型荧光探针，设计了系列基于共轭聚合物的核
酸传感体系，成功实现了对 DNA构象转化、甲基
化以及单核苷酸多态性(SNP)的灵敏检测[67-69]。进
一步研究聚合物生物传感的机理、寻找高效的荧光
能量转移体系，利用共轭聚合物为探针从多角度深
入研究基因水平上的生命反应过程，必将为基因组
学研究、疾病诊断、基因突变的检测等创造一个更
为便利的研究平台。
[参　考　文　献]
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