全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 17卷 第 4期
2005年 8月
Vol. 17, No. 4
Aug., 2005
RNA沉默在分析植物基因功能方面的研究
牛颜冰﹡，郭失迷，申林炎，雷万钧，雷霄飞
（山西农业大学，太谷 03 0 8 01）
摘　要：RNA沉默是真核生物的一种高度保守的和序列特异的RNA降解系统，它不但是基础生物学领
域的研究热点，同时在调节基因表达或研究基因功能方面也是非常有前景的。植物中的转录后基因沉
默(PTGS)是 RNA沉默的一种形式，通过 PTGS能对目标 RNA进行特异性降解。对双链RNA(dsRNA)在
RNA沉默启动中所起中心作用的认知，形成了几种 RNA沉默载体的构建方法，这些方法与基因组资
源相结合，通过转基因或非转基因的方法能够快速和高效研究植物的基因功能。
关键词：R N A 沉默；分析；基因功能
中图分类号：Q943.1　　文献标识码：A
The research on the analysis of gene function in plants
mediated by RNA silencing
NIU Yan-Bing*, GUO Shi-Mi, SHEN Lin-Yan, LEI Wan-Jun, LEI Xiao-Fei
(Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)
Abstract: Being a highly conserved and sequence-specific RNA degradation system in eukaryotic, RNA
silencing is both a fundamental biological issue and a highly promising application upon the control of gene
expression or the analysis of gene function. Posttranscriptional gene silencing (PTGS) in plants is a form of
RNA silencing by which target RNA is degraded in a sequence-specific manner. Realizing regarding the central
role that double-stranded RNA plays in triggering RNA silencing has prompted the development of several
vectors construction for RNA silencing. These methods, in combination with the genomic resources, by means
of transgenic and non-transgenic technology, have provided rapid and efficient means by which to investigate
gene function in a wide range of plant species.
Key words: RNA silencing ; analysis; gene function
文章编号 ：1004-0374(2005)04-0351-04
收稿日期：2005-01-04；修回日期：2005-02-03
基金项目：山西省自然科学项目资助（20051071）；山西农业大学科技创新基金项目资助
作者简介：牛颜冰( 1 9 6 8 —)，女，副教授，博士，* 通讯作者；郭失迷( 1 9 6 8 —)，男，硕士，助教；申林炎
( 1 9 8 1 —)，男，在读硕士；雷万钧( 1 9 7 9 —)，男，在读硕士；雷霄飞( 1 9 7 9 —)，男，在读硕士。
RNA沉默是真核生物的一种高度保守的和序列
特异的RNA降解系统，该系统包括植物中的转录后
基因沉默(PTGS)、动物中的 RNA干扰(RNAi)和真
菌中的消除作用(quelling)[1]。对 RNA沉默的遗传和
生化研究发现，不同生物体中存在着几个相同的
RNA沉默相关基因，如 RNA依赖的 RNA聚合酶
(RdRP)、RNA酶Ⅲ样的核酸酶(Dicer)和PAZ/Piwi区
的蛋白(ARGONAUTE)，这暗示着真核生物的RNA
沉默是高度保守的。现在公认的RNA沉默机制是双
链 RNA(dsRNA)高效启动 RNA沉默后，被Dicer切
割成 21~26 nt的小干扰型 RNA(siRNAs)，随后
siRNAs整合入 RNA诱导的沉默复合物(RISC)，并
引导 RISC 对与 siRNAs同源的目标 RNA进行降
解[2]。鉴于RNA沉默可以以序列特异性的行为抑制
352 生命科学 第17卷
基因表达，而植物中以基因为目标的同源重组又相
当困难，所以RNA沉默是一种极有前途的研究基因
功能的反向遗传学研究工具。RNA沉默作为反向遗
传学研究工具，在分析功能基因上，相对于传统正
向遗传学有许多优势，如传统的插入突变导致一个
家族的某一成员失活后，家族中的其他成员可弥补
其功能，从而造成无法研究其家族成员的功能；传
统的基因筛选对一些胚发育期必需的基因的插入突
变将导致致死型突变，从而得不到突变表型，而
RNA沉默中的病毒诱导的基因沉默(VIGS)是对成株
植物诱导产生表型突变，可以对胚发育期致死基因
的功能进行研究。RNA沉默通过同源性起作用，如
选取所有家族成员的高度保守区，就能沉默整个家
族成员。因此，用 RNA沉默分析功能基因就成了
分子生物学领域的研究热点。
1 　RNA沉默载体的构建方法
Waterhouse等[3]将马铃薯Y病毒(PVY)的辅助因
子蛋白(HC-Pro)基因分别正向或反向转入烟草，对
其后代杂交分析发现，含有正向或反向HC-Pro的
转基因植株中，仅有 15%的植株对 PVY具有抗性
或免疫作用；而同时含有正向和反向HC-Pro的转
基因植株中，对PVY有免疫作用的植株则占转基因
植株总数的 44%~54%。于是他们推断在同一植物
细胞中同时含有正义和反义RNA(即 dsRNA)是诱导
烟草植株发生RNA沉默或对PVY产生免疫作用的真
正原因。几乎与此同时，F i r e 等 [ 4 ]将小杆线虫
(Caenorhabditis elegans)内源mex-3的 dsRNA注入
C. elegans，导致 C. elegans内源的mex-3的转录产
物大幅度下降，甚至消失，首次证实 dsRNA的确
是 RNA沉默的诱导因子。随着对 dsRNA能高效启
动 RNA沉默认识的深入，现发展了几种诱导植物
RNA沉默的载体构建方法。
1.1　沉默效率高、强度大的载体的构建
Waterhouse等[3]发现在强结构型启动子下游插
入反向重复片段的重组双元载体是诱导RNA沉默的
最基本结构。在该载体中，目标基因的 cDNA片段
被克隆在间隔序列的两端，这些片段通过头头相连
或尾尾相连导致该转基因产生自我互补的 hpRNA
(分子内 dsRNA)结构。Wesley等[5]证实用反义抑制
和共抑制等传统方法介导的 PTGS 的沉默效率在
0%~30%，平均为 12%~13%，而 hpRNA结构则能
显著提高 RNA沉默的效率和强度。如空间序列是
cDNA片段或不能被剪切掉的内含子，其沉默效率
在 48%~69%，平均为 58%，若将有功能的内含子
(转录后能被剪切掉)替代该空间序列则可进一步将沉
默的效率提高至 66%~100%，平均为 90%。事实
上，利用hpRNA结构进行植物抗病毒和沉默内源基
因已有许多成功的报道。如牛颜冰等(待发表)将番
茄花叶病毒的移动蛋白基因(ToMV-MP)的反向重复
结构转化烟草，在所得的47株转基因烟草中就有23
株对 ToMV有免疫作用；将黄瓜花叶病毒的部分复
制酶基因(CMV-∆Rep)的反向重复结构转化烟草，
在所得的 40株转基因烟草中就有25株对CMV具有
免疫作用。
Kamath等[6]认为在全基因序列或表达序列标签
等的协助下，利用 hpRNA结构诱导 RNA沉默是一
种十分有效地研究植物基因功能的手段。但由于必
须将两个同源的DNA片段以相反的方向克隆进同一
载体才能形成 hpRNA结构，致使构建 hpRNA结构
的劳动量很大，加之大的双元载体也限制了克隆
DNA片段的酶切位点的利用，造成其转化效率低
下，故 hpRNA结构不适合大量分析基因的功能。
1.2 　高产量RNA沉默载体的构建
以重组为基本克隆方法的Gateway技术不需要
限制性酶切和连接的烦琐步骤，在Gateway双元载
体 pHELLSGATE中，cDNA片段能以反向重复的方
式一步克隆在内含子两端。它克服了hpRNA结构构
建的种种缺陷，借助于Gateway介导的策略，研究
者正在构建大约含有 25 000个特定基因标签的高产
量的RNA沉默载体。这一资源与接近饱和的插入突
变体库的联合应用将能极大地促进基因功能的鉴定。
1.3　RNA沉默目标特定性载体的构建
除Gateway技术外，以 RdRP介导的、siRNA
扩增为基础的、借助于异源 3端非翻译区的沉默系
统（S H U TR），也适用于许多基因的功能分析。
在 SHUTR方法中，硝酸还原酶（NOS）的 3端
非翻译区反向重复排列用以产生初级 siRNAs，5端
单链区产生次级siRNAs来决定目标的特定性，这一
过程称为转移RNA沉默。在基因功能研究方面，转
移RNA沉默的优势是善于寻找几个具有重叠功能的
相关成员，不太适合于高度保守的基因家族的某一
特定基因的功能研究。事实上，Palatnik等[7]已用
拟南芥JAW的miRNA沉默了多TCP基因的mRNAs。
至于目标的特定性，Mette等[8]认为，相对于转录
区而言，某一基因家族高度类似的成员的启动子区
没有必要非有保守序列。
1.4　特定植物RNA沉默载体的构建
随着研究者试图对特定基因进行深入研究，以
组织特异性行为沉默基因表达愿望的加强，RNA沉
默载体的构建方法也得到了进一步发展。例如，
Guo等[9]为了控制 RNA沉默起始的时间，利用 17β
系统和 Cre/loxP介导的重组系统，构建了适用于必
353第4期 牛颜冰，等：R NA沉默在分析植物基因功能方面的研究
需基因或在植物的不同发育阶段起多重作用基因功
能分析的特定的载体系统。最近 Roignant等[10]发现
果蝇的某些细胞中没有发生系统性沉默，存在着特
定细胞的 RNAi。随后 Palauqui等[11]又证实，由于
RNA沉默信号的系统传导特性，植物局部的或限时
的 RNA沉默系统还没有变为现实。不过有趣的是，
有些病毒蛋白能抑制系统沉默，但不抑制局部沉
默。另外，有研究表明控制拟南芥叶片极性的基因
PHV，在体外miR165的指导下，能被Dicer切割，
认为PHV能依赖于miR165 RNA发生局部沉默。对
RNA沉默的系统特性和miRNA介导的基因表达的发
育控制的阐明，将有助于RNA沉默系统更加复杂化
和多样化。
1.5　新型的DNA卫星分子——DNA βRNA沉默载
体的构建
VIGS研究基因功能的方法是将携带植物功能基
因 cDNA的病毒侵染植物，通过诱导植物发生基因
沉默而使植物出现表型突变，从而借助于植物表型
或生理指标的变化来反映基因的功能。以往多是以
RNA病毒、DNA病毒以及极少的卫星病毒载体的
VIGS体系来研究基因的功能，最近 Tao和 Zhou[12]
建立了一种以新型的DNA卫星分子为载体的VIGS
体系。他们将中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow
leaf curl China virus, TYLCCNV)伴随的新型DNA卫
星分子(DNAβ)的βC1基因(βC1基因对于致病是必需
的，但对于DNAβ的复制却并非必需)进行缺失和引
入多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)，改造
成一种卫星 DNA载体，将外源片段引入多克隆位
点，利用 βC1的启动子和终止子进行转录和表达。
对DNAβ载体的测试表明，该载体既可以抑制转基
因 GFP的表达，也可以抑制内源基因，如八氢番
茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)和镁离子
螯合酶的关键基因 Su(Sulfur)的表达；虽然辅助病
毒 TYLCCNV并不侵染分生组织，但是它也同样可
以诱导分生组织特异性表达的增殖性细胞核抗原基
因(proliferating cell nuclear antigene，PCNA)发生沉
默；该卫星 DNA载体还可以同时抑制两个基因的
表达。改造的卫星DNA沉默载体本身在植物中并不
产生任何的症状，因此，在最大程度上减少了对
VIGS沉默表型的干扰效应。DNA卫星载体具有一
切卫星分子的特点，从诱导基因沉默的效果和持久
性来看，以DNA卫星分子诱导的基因沉默是一种非
常有前景的 VIGS体系。
1.6　RNA沉默载体中引起有效沉默的外源片段的长
度
Waterhouse等[3]认为 hpRNA结构中正义和反义
臂的长度为 98 bp~853 bp时，能引起植物发生RNA
沉默。Thomas等[13]发现对于转基因绿色荧光蛋白
(GFP)来说，诱导基因沉默的最小插入片段可小至
23bp，再小的片段就不能诱发 RNA沉默；但对于
植物内源功能基因来说，在 PVX载体上插入 33 bp
的片段，才可以诱发八氢番茄红素脱氢酶基因
(PDS)发生沉默，并且具有区域与位置效应，同样
是 33 bp，在基因的中心区可以沉默，在其他区则
不能，有些甚至插入 52 bp也不能诱发基因沉默。
插入片段的方向对沉默也有影响，对于转基因和内
源基因，反向插入比正向插入更容易引起基因沉默。
2 　RNA沉默分析基因功能的方法
迄今为止，RNA沉默分析基因功能的方法主要
有转基因的方法和非转基因的方法。
2.1　 RNA沉默介导的转基因分析基因功能
沉默效率高、强度大的载体，高产量 RNA沉
默载体，RNA沉默目标特定性载体和特定植物RNA
沉默载体均可通过转基因的方法来分析能进行遗传
转化植物中的基因的功能，如最近Rohr等[14]将两个
基因融合后构建成反向重复导入植物后同时沉默了
两个内源基因，产生了两个基因的突变表型。
2.2　RNA沉默介导的非转基因分析基因功能
转基因的方法不适于分析许多不能或很难进行
遗传转化的植物，如小麦、大豆等中的基因的功
能。而病毒介导的 RNA沉默和瞬时 RNA沉默则能
克服 RNA沉默应用的这一局限，拓宽了 RNA沉默
分析基因功能的应用范围。
2.2.1　病毒介导的RNA沉默分析基因功能　许多植
物病毒，如马铃薯 X 病毒(PVX)、烟草脆裂病毒
(TRV)和大麦条纹花叶病毒(BSMV)等均已被改造成
VIGS载体，在建立起寄主和病毒相互作用的条件
后，VIGS有用于包括难于转化的植物中基因功能
研究的潜能。然而，有些情况下，植物与病毒的
相互作用造成了沉默状态和沉默强度的差异，如植
物分生组织中不存在沉默信号[15]、病毒通常含有沉
默抑制蛋白等 [16]，这些给VIGS分析基因的功能带
来了困难。不过幸运的是 Ratcliff等[17]发现 TRV载
体尽管不使分生组织发病，但却能在植物的分生组
织中诱发基因沉默，Tao和 Zhou等[12]也发现辅助病
毒 TYLCCNV虽然不侵染分生组织，但它也同样可
以诱导分生组织特异性表达的 PCNA发生沉默。因
此，只要选择好合适的病毒(如 TRV、DNA卫星)，
VIGS就可成功应用于基因功能的分析。
2.2.2　瞬时 RNA沉默分析基因功能　Azevedo等[18]
将hpRNA结构在大麦中瞬时表达，研究了来源于病
源的抗性。牛颜冰等[19] 也发现，瞬时表达 CMV-
354 生命科学 第17卷
∆Rep病毒和ToMV-mp dsRNA的烟草能阻止相关病
毒的侵染。Bezanilla等[20]则进一步证实，瞬时沉默
一般可持续 8天时间，这一时间足以用来观察生态
学的发展过程。基于农杆菌或病毒介导的对RNA沉
默的瞬时诱导依赖于核苷酸的侵染性，所以丢失功
能的表型如果能仅仅发生在单细胞水平上，那么对
RNA沉默的瞬时诱导将不失为一个快速分析基因功
能的方法。同时瞬时RNA沉默也可用于难以遗传转
化植物(如蕨类)等中的基因功能的研究，具体方法
是将含有dsRNA的萌芽培养基与蕨类温育造成蕨类
待试基因的胚芽发生 RNA沉默[21]。
由于 siRNAs决定着 RISC作用目标的特定性，
所以直接投递siRNAs也是一强有力和直接研究基因
功能的方法。在哺乳动物体系中，长于 3 0 n t 的
dsRNA将可诱导干扰反应，从而导致哺乳动物全身
蛋白合成反应关闭，所以，这一方法倍受青睐。现
在已有研究者将报告基因及其相应的 siRNA同时引
入烟草BY2，成功地诱导了报告基因的RNA沉默[22]。
3　前景和展望
Szittya等[23]发现低温可通过抑制烟草和拟南芥
siRNAs的生成来抑制RNA沉默介导的防御反应。尽
管RNA沉默的这一低温敏感特性限制了它在低温条
件下的应用，然而，它却提出了或许温度是控制
RNA沉默诱导与否开关这一设想，同时也暗示RNA
沉默机制还有待进一步研究。
随着克隆在VIGS或hpRNA结构中基因的收集
和近 200种植物表达序列标签(ESTs)在DNA数据库
中的贮存，RNA沉默将有可能应用于更多植物功能
基因研究中。基于 RNA沉默依赖于细胞生物学反
应，故核苷酸序列的转变、点突变不能造成有价值
的变异，从这一点来看，RNA沉默不能完全替代
传统的突变方法。在后基因组时代，对模式植物中
RNA沉默机制的深入研究，RNA沉默机制向绝大多
数非模式植物延伸都将成为一个大的挑战。从基础
生物学和商业的观点，尤其是从植物的进化和多样
性方面来看，在分析基因功能方面，RNA沉默必
将显示出巨大的潜力。
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