全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ００６
收稿日期：２０１３－０９－１１
基金项目：国家自然科学基金（２１３７６２５５）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）（ＳＳ２０１３ＡＡ０５０７０３⁃２）；青岛科技发展计划（１２⁃１⁃４⁃９⁃（３）⁃ｊｃｈ）
作者简介：冯红茹（１９８９—），女，河北衡水人，硕士研究生，研究方向：生物化工；杨建明（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｊｍｉｎｇ８８８＠ １２６．ｃｏｍ
β 蒎烯合成酶（ＱＨ６）在大肠杆菌中的
表达及其产 β 蒎烯的研究
冯红茹１，２，杨建明２，３，秦　 利１，咸　 漠２
（１􀆰 沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳 １１０８６６； ２􀆰 中国科学院 青岛生物能源与过程研究所
生物基材料重点实验室，山东 青岛 ２６６１０１；３􀆰 青岛农业大学 生命科学学院，山东 青岛 ２６６１０９）
摘　 要：蒎烯是一种重要的平台化合物，可以用来合成高密度燃料、精细化学品及材料。 将来源于黄花蒿的 β 蒎
烯合成酶基因与外源杂合甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径一起整合到 ＢＬ２１（ＤＥ３）中共表达，通过气相色谱 质谱（ＧＣ ＭＳ）
和气相色谱（ＧＣ）对发酵产物进行了定性及定量检测。 通过发酵条件优化，对影响发酵产 β 蒎烯的因素（诱导温
度、诱导剂浓度和 Ｎ源）进行了考察。 结果表明：来自黄花蒿的蒎烯合酶可以在宿主细胞内高效表达，且能高效催
化 β 蒎烯的合成。 通过对重组菌进行发酵条件优化得到最佳培养条件：诱导温度为 ２８ ℃，ＩＰＴＧ 浓度为 ０􀆰 １
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，最佳有机 Ｎ源为ＭＤ牛肉粉。 在此条件下，检测出 β 蒎烯产量达到 ２２􀆰 ８９ ｍｇ ／ Ｌ，比优化前（４􀆰 ６０ ｍｇ ／ Ｌ）提
高了 ３􀆰 ９８倍。
关键词：β 蒎烯合成酶；大肠杆菌；亲和层析；生物合成
中图分类号：Ｑ８５１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００２８－０７
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ β⁃ｐｉｎｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ （ＱＨ６） ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ β⁃ｐｉｎｅｎｅ
ＦＥＮＧ Ｈｏｎｇｒｕ１，２，ＹＡＮＧ Ｊｉａｎｍｉｎｇ２，３，ＱＩＮ Ｌｉ１，ＸＩＡＮ Ｍｏ２
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏ⁃ｂａｓｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０１，Ｃｈｉｎａ； ３􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｉｎｅｎｅ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｈａｔ ｉｓ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎ ｈｉｇｈ⁃ｄｅｎｓｉｔｙ ｒｅｎｅｗａｂｌｅ ｆｕｅｌｓ ａｎｄ
ｆｉｎｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ． Ｔｈｅ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ β⁃ｐｉｎｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ （ＱＨ６） ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ ＤＥ３） ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ （ ＭＶＡ） ｐａｔｈｗａｙ． Ｐｉｎｅｎｅ ｗａｓ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＣ） ａｎｄ ＧＣ⁃ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）．
Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｄｕｃｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｐｉｎｅｎｅ
ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ａｆｔｅｒ ｓｈａｋｅ⁃ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， β⁃ｐｉｎｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ４􀆰 ６０
ｍｇ ／ Ｌ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２８ ℃，ｉｎｄｕｃｅｒ （ＩＰＴＧ） ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ０􀆰 １
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ａｎｄ ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｐｏｗｄｅｒ（ＭＤｂｉｏ Ｉｎｃ􀆰 ），ｔｈｅ β⁃ｐｉｎｅｎｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ２２􀆰 ８９ ｍｇ ／ Ｌ，３􀆰 ９８ ｔｉｍｅｓ
ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｅｆｏｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：β⁃ｐｉｎｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ；ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
　 　 蒎烯是一种重要的萜类化合物，在自然界中主要
以 ２种形式存在：α 蒎烯和 β 蒎烯。 二者是一对同
分异构体，β 蒎烯有一双键在环外，比 α 蒎烯更易
形成二聚体结构，β 蒎烯二聚体的燃料性能略优于
α 蒎烯二聚体［１］。 由于蒎烯二聚体的高能量密度和
高燃烧净热值（能量密度 ０􀆰 ９３８ ｇ ／ ｃｍ３，燃烧净热值
３９􀆰 ５ ＭＪ ／ Ｌ），被广泛应用于高密度燃料的合成。 除此
之外，还广泛应用于药理活性物、农用及家用生物活
性物、功能材料、香料、松油醇、芳香醇、乙酸松油酯、
二氢松油醇和二氢月桂烯醇等的合成［２－３］。
目前，工业上获得蒎烯的主要来源是采用高效精
馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节油中进行分离提
取［４ ５］。 这种方法存在对设备要求高、操作困难、能耗
大和效率低等缺点，同时造成大量自然资源的浪费。
通过在工业微生物中构建合成代谢路径，以低成本的
可再生生物质为原料生产各种化学品，包括萜类化学
品，可以有效地解决化学品的原料瓶颈问题。
目前，只有 Ｙａｎｇ 等［６］对生物法合成 α 蒎烯进
行了研究，α 蒎烯的产量最高达到了 ０􀆰 ９７ ｇ ／ Ｌ。 而
Ｌｕ等［７］的研究检测了黄花蒿的蒎烯合成酶（ＱＨ６）
的体外酶反应，在添加底物牻牛儿焦磷酸（ＧＰＰ）的
条件下产生了质量比例为 ９４ ∶ ６的 β 蒎烯和 α 蒎
烯混合物。 但并未对其直接进行生物发酵获得目
的产物进行研究。
本研究在前人研究的基础上，将黄花蒿的蒎烯
合成酶基因与实验室构建的生物体外高效甲羟戊
酸（ＭＶＡ）途径共同整合到大肠杆菌中，通过生物发
酵得到了 β 蒎烯和 α 蒎烯的混合物，并通过气相
色谱 质谱（ＧＣ ＭＳ）及 ＧＣ对发酵产物进行了定性
及定量研究，以实现以葡萄糖为底物，经大肠杆菌
发酵获得目的产物 β 蒎烯。 以期为微生物法合成
蒎烯的工业化研究奠定一定的基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种及材料
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ ２１（ＤＥ３），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司；ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ
１质粒，Ｎｏｖａｇｅｎ公司；含有 β 蒎烯合成酶基因的质粒
ｐＧＨ ＱＨ６，上海捷瑞生物科技有限公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 工具酶和试剂
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰ、感受态细胞制备
试剂盒，ＴａＫａＲａ 公司；Ｎｉ ＳｅｐｈｒｏｓｅＴＭ６×ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司；限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶，
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，
Ｏｍｅｇａ 公司；异丙基硫代 β Ｄ 半乳糖苷（ＩＰＴＧ），
Ｂｉｏｓｈａｒｐ 公司；胰蛋白胨和酵母抽提物，Ｏｘｏｉｄ 公司；
α 蒎烯、β 蒎烯标准品，Ｓｉｇｍａ 公司；牛肉粉，北京
奥博星生物技术有限责任公司；大豆蛋白胨，国药
集团化学试剂有限公司；蛋白胨，天津大茂化学试
剂厂；牛肉膏，Ｓｏｌａｒｂｉｏ 公司；牛肉浸膏，北京双旋微
生物培养基制品厂；牛肉浸粉，阿拉丁公司；牛肉
粉，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ公司。 所有试剂如无特殊说明
均为国产分析纯。
１􀆰 １􀆰 ３　 培养基
ＬＢ液体培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母提取物
５、ＮａＣｌ １０；ＬＢ液体培养基加入 ２０ ｇ ／ Ｌ 的琼脂粉即
为 ＬＢ固体培养基。
发酵培养基：Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ９􀆰 ８ ｇ、柠檬酸·Ｈ２Ｏ
２􀆰 １ ｇ、檬酸铁铵 ０􀆰 ３ ｇ、ＭＤ牛肉粉 ９ ｇ、葡萄糖 ２ ｇ、１
ｍＬ １ ０００×微量元素（（ＮＨ４） ６Ｍｏ７Ｏ２４·４Ｈ２Ｏ ０􀆰 ３７ ｇ、
ＺｎＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ２９ ｇ、Ｈ３ ＢＯ４ ２􀆰 ４７ ｇ、ＣｕＳＯ４·５Ｈ２ Ｏ
０􀆰 ２５ ｇ、ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ １􀆰 ５８ ｇ用蒸馏水定容至 １００ ｍＬ
过滤除菌）、１ ｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＳＯ４ ２ ｍＬ。 并根据情况添加
１００ μｇ ／ ｍＬ的氨苄青霉素或 ３４ μｇ ／ ｍＬ的氯霉素。
１􀆰 ２　 仪器与设备
７８９０Ａ ５９７５Ｃ型 气相色谱 质谱连用仪，Ａｇｉｌｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 公司；ＳＰ６８９０ 型气相色谱仪，山东鲁南
瑞宏有限公司；Ｍｙｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ仪、ＰｏｗｅｒＰａｃ Ｂａｓｉｃ 核酸
电泳仪、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ 凝胶成像系统，Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ 公司；
Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ ２２Ｒ型离心机，德国 Ｂｅｃｋｍａｎ 公司。
１􀆰 ３　 方法
１􀆰 ３􀆰 １　 外源基因的克隆
黄花蒿的 β 蒎烯合成酶基因 ＱＨ６（ＧｅｎＢａｎｋ登
录号 ＡＦ２７６０７２􀆰 １）通过化学合成法合成，合成的基
因片段被构建到了 ｐＧＨ 克隆载体上。 为了将 ＱＨ６
基因克隆到表达载体上，合成的 ｐＧＨ ＱＨ６ 带有限
制性内切酶位点 Ｂｇｌ Ⅱ 和 ＸｈｏⅠ。
设计合成如下 ＰＣＲ 引物进行扩增，正向引物：
ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣＴＡＡＣＴＡ， 反 向
引物： ＣＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＡＴＣＧＧＧＴＴＡＡＣＧＡＡＣＡ，
其中正向引物和反向引物分别引入 ＢａｍＨⅠ和 Ｓａｃ
Ⅰ酶切位点（下划线），引物由上海捷瑞生物工程有
限公司合成。 以大肠杆菌基因组为模板，ＰＣＲ 反应
条件：９４ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎ；９４ ℃ 变性 ３０ ｓ，５６ ℃ 退火
３０ ｓ，７２ ℃ 延伸 ２􀆰 ５ ｍｉｎ，循环 ３０ 次；７２ ℃ 延伸 １０
ｍｉｎ。 ＰＣＲ反应产物经 １％ 琼脂糖凝胶电泳检测。
９２　 第 １期 冯红茹等：β 蒎烯合成酶（ＱＨ６）在大肠杆菌中的表达及其产 β 蒎烯的研究
表 １　 本研究中所用的菌株和质粒
Ｔａｂｌｅ １　 Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
菌株和质粒 相关特性
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＹＪＭ１４ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＹＪＭ１４
ＹＪＭ２７ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＹＪＭ２７
ＦＨＲ １ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＦＨＲ１
ＦＨＲ ２ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＦＨＲ２ ／ ｐＹＪＭ１４
质粒
ｐＹＪＭ１４ ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＥＲＧ１２，ＥＲＧ８，ＥＲＧ１９ ａｎｄ ＩＤＩ１ ｆｒｏｍ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ｐＹＪＭ２７ ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ １ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｖａＥ ａｎｄ ｍｖａＳ ｆｒｏｍ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ，ＧＰＰＳ２ ｆｒｏｍ Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ， Ｐｔ３０ ｆｒｏｍＰｉｎｕｓ ｔａｅｄａ
ｐＦＨＲ １ ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ １ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＱＨ６ ｆｒｏｍ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ
ｐＦＨＲ ２ ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ １ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｖａＥ ａｎｄ ｍｖａＳ ｆｒｏｍ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ，ＧＰＰＳ２ ｆｒｏｍ Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ， ＱＨ６ ｆｒｏｍＡｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ
１􀆰 ３􀆰 ２　 表达载体的构建
以 ｐＧＨ ＱＨ６ 为模板，以上述引物扩增目的基
因ＱＨ６，得到带有特定酶切位点的基因片段。 ＰＣＲ产
物和 ｐＡＣＹＤｕｅｔ １质粒均采用 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｓａｃ Ｉ双酶
切，将纯化后的 ＤＮＡ 片段与线性化的 ｐＡＣＹＤｕｅｔ １
载体连接，转化大肠杆菌 ＢＬ２１ （ＤＥ３） 感受态细胞。
菌液 ＰＣＲ 筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定并测
序。 鉴定正确的重组质粒命名为 ｐＦＨＲ １（表 １）。
该载体用于单独分析该基因的可溶性表达情况。
将 ｐＧＨ ＱＨ６和 ｐＹＪＭ２７质粒均采用 Ｂｇｌ ＩＩ 和
Ｘｈｏ Ｉ双酶切，对酶切产物 ＱＨ６和 ｐＹＪＭ２７的大片段
进行胶回收，将纯化后的 ２个线性片段进行连接，转
化大肠杆菌 ＢＬ２１ （ＤＥ３） 感受态细胞。 菌液 ＰＣＲ
筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定并测序。 鉴定
正确的重组质粒命名为 ｐＦＨＲ ２。 由于 ｐＹＪＭ２７ 和
ｐＹＪＭ１４共同完成外源杂合甲羟戊酸（ＭＶＡ）途径的
构建，本文将 ｐＦＨＲ ２ 和 ｐＹＪＭ１４ 两种质粒共同转
化 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ，从而构建以葡萄糖为底物，经 ＭＶＡ 途径
合成 β 蒎烯的新方法。
１􀆰 ３􀆰 ３　 重组菌的蛋白表达及纯化
将 ｐＦＨＲ １转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）获得工
程菌株，命名为 ＦＨＲ １。 将 ＦＨＲ １接种于含有氯
霉素抗性的液体 ＬＢ 培养基，３７ ℃振荡培养过夜。
次日按 １％接种量（体积分数）转接至 １００ ｍＬ 新鲜
的含有氯霉素抗性的液体 ＬＢ 培养基，振荡培养至
对数生长期（ＯＤ６００约为 ０􀆰 ６），加入 ＩＰＴＧ 至终浓度
为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，３０ ℃诱导培养 ４ ｈ后收集菌体。 用
５ ｍＬ 磷酸缓冲液（ ＰＢＳ） （０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＨ２ ＰＯ４ １９
ｍＬ，０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ ＨＰＯ４ ８１ ｍＬ、 ＮａＣｌ ２􀆰 ９３ ｇ， ｐＨ
７􀆰 ４）重悬菌体后，置于冰上超声破碎，４ ℃、１２ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ 取部分上清进行 ＳＤＳ ＰＡＧＥ 检
测，剩余部分用 Ｎｉ ＳｅｐｈｒｏｓｅＴＭ６×ｆａｓｔ ｆｌｏｗ纯化系统纯
化 Ｈｉｓ ｔａｇ融合蛋白。
１􀆰 ３􀆰 ４　 发酵产物定性检测
ｐＹＪＭ１４和 ｐＦＨＲ ２转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）
获得工程菌株，命名为 ＦＨＲ ２。 挑取单克隆到含有
氯霉素和氨苄霉素的 ＬＢ 培养基中，３７ ℃活化过夜。
按 １％接种量转接至 ５００ ｍＬ厌氧瓶中（含 １００ ｍＬ发
酵培养基），３０ ℃ 下诱导培养，培养 ４８ ｈ后对产物进
行检测。 分别用气相色谱 质谱联用（ＧＣ ＭＳ）及气
相色谱（ＧＣ）方法对产物进行了定性和定量。
（１）ＧＣ ＭＳ定性检测发酵产物。
ＧＣ ＭＳ检测同样采用顶空气相色谱法测定。
利用 Ａｉｌｇｅｎｔ气相色谱 四极杆质谱联用仪，色谱条
件：色谱柱为 ＨＰ ＩＮＮＯＷＡＸ毛细管柱（３０ ｍ×０􀆰 ２５
ｍｍ×０􀆰 ２５ μｍ）；升温程序为 ４０ ℃保持 ５ ｍｉｎ，以 ２０
℃ ／ ｍｉｎ 升至 ７５ ℃，保持 １ ｍｉｎ；以 ２０ ℃ ／ ｍｉｎ 升至
２４５ ℃，保持 ５ ｍｉｎ。 质谱条件：电子轰击（ＥＩ）离子
源；电子能量 ７０ ｅＶ；传输线温度 ２７５ ℃；离子源温
度 ２００ ℃；母离子 ｍ ／ ｚ ２８５；激活电压 １􀆰 ５ Ｖ ；全扫描
模式；质量扫描范围 ｍ ／ ｚ １０～６００。 样品通过与蒎烯
标准品色谱图直接比对，进行定性分析。
０３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
ＨＭＧ⁃ＣｏＡ—ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ⁃ＣｏＡ；ＭＶＡ—ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ；ＩＰＰ—ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ；
ＤＭＡＰＰ— ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＧＰＰ—ｇｅｒａｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＭｖａＥ—ａｃｅｔｙｌ⁃ＣｏＡ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ／ ＨＭＧ⁃ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；
ＭｖａＳ—ＨＭＧ⁃ＣｏＡ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＥＲＧ１２—ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｋｉｎａｓｅ；ＥＲＧ８—ｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｋｉｎａｓｅ；ＥＲＧ１９—ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＩＤＩ１—ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ＧＰＰＳ２—Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ ｇｅｒａｎｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ
ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ；ＱＨ６—Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ ｂｅｔａ⁃ｐｉｎｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ．
图 １　 重组菌 ＦＨＲ ２中引入的用于合成蒎烯的ＭＶＡ代谢途径
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＭＶＡ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｐｉｎｅｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｓｔｒａｉｎ ＦＨＲ⁃２
　 　 （２）气相色谱（ＧＣ）定量检测发酵产物。
ＧＣ检测采用顶空气相色谱法测定［８］。 收集１ ｍＬ
密闭培养基顶部空间的气体样品，采用山东鲁南瑞虹
ＳＰ ６８９０ 型气相色谱仪，色谱柱为 ＨＰ ＩＮＮＯＷＡＸ
ｃｏｌｕｍｎ（２５ ｍ×２５０ μｍ×０􀆰 ２ μｍ），检测器为ＦＩＤ检测器；
气化室温度 ２００ ℃，柱室温度升温程序 ５０ ℃ 保温 ０􀆰 ５
ｍｉｎ，４ ℃ ／ ｍｉｎ 升至 ７０ ℃，２０ ℃ ／ ｍｉｎ 升至 ２５０ ℃，检测
器温度 ２００ ℃，载气流速 １ ｍＬ ／ ｍｉｎ。 用已知浓度的蒎
烯绘制蒎烯标准曲线［６］，通过将检测得到的峰面积引
入标准曲线，对发酵产物进行定量。
１􀆰 ３􀆰 ５　 发酵条件优化
为进一步提高目的产物的产量，本研究对发酵
１３　 第 １期 冯红茹等：β 蒎烯合成酶（ＱＨ６）在大肠杆菌中的表达及其产 β 蒎烯的研究
过程进行了单因素水平的筛选［９－１０］。 主要考察了 ４
种因素（诱导温度、诱导剂浓度、Ｎ 源组成和转速）
对生物发酵产 β 蒎烯的影响规律。
（１）诱导温度。
挑取单克隆于 ５ ｍＬ ＬＢ小瓶中培养活化过夜，按
１％量接种于 １００ ｍＬ 含有氯霉素和氨苄霉素的液体
发酵培养基中，３７ ℃振荡培养 ４ ｈ，当 ＯＤ６００ ＝ ０􀆰 ６ ～
０􀆰 ９，加入终浓度为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ 分别于不同温
度下（２５、２８、３０、３４和 ３７ ℃）进行诱导培养，在不同时
间点取 １ ｍＬ顶空气体进行 ＧＣ测定。
（２）诱导剂（ＩＰＴＧ）浓度。
挑取单克隆于 ５ ｍＬ ＬＢ 小瓶中培养活化过夜，
按 １％量接种于 １００ ｍＬ 含有氯霉素和氨苄霉素的
液体发酵培养基中，３７ ℃振荡培养 ４ ｈ，当 ＯＤ６００ ＝
０􀆰 ６～ ０􀆰 ９，加入不同浓度的 ＩＰＴＧ（０􀆰 １、０􀆰 ２５、０􀆰 ５ 和
１ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）于 ２８ ℃下进行诱导培养，在不同时间点
取 １ ｍＬ顶空气体进行 ＧＣ测定。
（３）Ｎ源。
考察 ７种不同厂家来源的有机氮对生物催化合
成 β 蒎烯产量的影响规律。 取单克隆于 ５ ｍＬ ＬＢ
小瓶中培养活化过夜，按 １％量接种于 １００ ｍＬ 含有
氯霉素和氨苄霉素及不同 Ｎ 源的液体发酵培养基
中，３７ ℃振荡培养 ４ ｈ，当 ＯＤ６００ ＝ ０􀆰 ６～０􀆰 ９，加入 ０􀆰 ５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ于 ３０ ℃下进行诱导培养，在不同时间
点取 １ ｍＬ顶空气体进行 ＧＣ测定。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 β 蒎烯合成酶表达质粒的构建
为验证外源基因是否在重组菌中正确且有效
的表达，本研究将构建两个表达载体 ｐＦＨＲ １ 和
ｐＦＨＲ ２。 这 ２个质粒都利用载体 ｐＡＣＹＤｕｅｔ １本
身的启动子进行高拷贝的表达。
对构建完成的含有质粒 ｐＦＨＲ １ 和 ｐＦＨＲ ２
的重组大肠杆菌进行菌液 ＰＣＲ扩增，产物经琼脂糖
凝胶电泳鉴定，均获得了约 ８００ ｂｐ 的与预期大小相
符的电泳条带（图 ２），纯化后的重组质粒分别经过
ＢａｍＨ Ｉ ／ Ｓａｃ Ｉ和 Ｂｇｌ ＩＩ ／ Ｘｈｏ Ｉ双酶切后也得到大约
为 １􀆰 ６ ｋｂ左右的片段，与预期相符。 ＤＮＡ测序分析
显示 插 入 的 ＱＨ６ 基 因 （ ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号
ＡＦ２７６０７２􀆰 １）和已报道的序列一致，二者的基因的
同源性为 １００％，说明质粒构建成功。
２􀆰 ２　 ＱＨ６蛋白的表达与验证
构建成功的表达载体 ｐＦＨＲ １经转化到感受态
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１—ＦＨＲ １；２—ＦＨＲ ２
图 ２　 ＰＣＲ鉴定重组菌株中的 β 蒎烯合成酶基因
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＱＨ６
细胞 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，得到重组菌 ＦＨＲ １。 由于载体
ｐＦＨＲ １含有 Ｈｉｓ ｔａｇ，可以对表达蛋白进行镍柱纯
化，检测其是否以可溶的形式在重组细胞中得到表
达。 虽然 Ｌｕ等［７］也研究了该蛋白在大肠杆菌 ＢＬ２１
（ＤＥ３）中的蛋白表达情况，但基于本次研究使用了不
同的表达载体，且该基因还要与体外构建的杂合
ＭＶＡ途径共同构建到宿主细胞中进行生物发酵，仍
需要检测该蛋白是否在宿主细胞中得以正确表达。
Ｍ—标准蛋白；１—ＩＰＴＧ诱导后的蛋白；２—ＱＨ６ 流穿液；
３—ＱＨ６洗脱液；４—纯化后的蛋白
图 ３　 β 蒎烯合成酶（ＱＨ６）的表达与纯化
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ β⁃ｐｉｎｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ
ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
重组菌 ＦＨＲ １ 经 ＩＰＴＧ 诱导 ４ ｈ，菌体超声破
碎后，离心去除细胞碎片，上层裂解液进行 ＳＤＳ
ＰＡＧＥ检测，结果如图 ３所示。 由图 ３ 可知：蛋白经
Ｎｉ柱纯化之后，ＳＤＳ ＰＡＧＥ 检测结果在相对分子
质量约为 ６􀆰 ０ × １０４处出现 １ 条特异带，与预期的
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
Ｈｉｓ ｔａｇ融合蛋白理论大小数值相符。 说明 β 蒎烯
合成酶基因 ＱＨ６在大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中以可溶
性的形式得到了正确表达。
２􀆰 ３　 发酵产物定性检测
２􀆰 ３􀆰 １　 ＧＣ ＭＳ定性检测发酵产物
将构建好的质粒 ｐＦＨＲ ２ 和 ＹＪＭ１４ 共转到感
受态细胞 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，得到重组菌 ＦＨＲ ２。 经
ＬＢ培养基活化后，接种到发酵培养基中，当 ＯＤ６００ ＝
０􀆰 ４～０􀆰 ６时，０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ诱导，３０ ℃培养 ２４ ｈ
后，抽取 １ｍＬ 顶空气体进行 ＧＣ ＭＳ 检测。 ＧＣ 检
测结果表明：混合气体中同时含有 α 蒎烯和 β 蒎
烯。 通过质谱分析进一步确定了产物是 α 蒎烯和
β 蒎烯的混合物。
２􀆰 ３􀆰 ２　 ＧＣ定量检测发酵产物
将构建好的质粒 ｐＦＨＲ ２ 和 ＹＪＭ１４ 共转到感
受态细胞 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，得到重组菌 ＦＨＲ ２。 经
ＬＢ培养基活化后，接种到发酵培养基中，当 ＯＤ６００ ＝
０􀆰 ４～０􀆰 ６时，０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＩＰＴＧ诱导，３０ ℃培养 ２４ ｈ
后，抽取 １ ｍＬ顶空气体测定 β 蒎烯的产量，结果如
图 ４所示。 由图 ４可知： β 蒎烯合成酶既可以催化
产生 β 蒎烯还可以催化产生一定量的 α 蒎烯，产
物 α 蒎烯和 β 蒎烯的质量浓度分别为 ０􀆰 ３２、４􀆰 ６０
ｍｇ ／ Ｌ；其质量比为 ６􀆰 ５ ∶ ９３􀆰 ５，与 Ｌｕ 等［７］的研究结
果 ６ ∶ ９４存在略微差异。 分析原因可能是发酵过程
及细胞内环境的复杂性影响产物的合成，也有可能
是检测过程中出现的误差所致。
图 ４　 样品 ＧＣ检测结果
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＧＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ
２􀆰 ４　 发酵条件优化
２􀆰 ４􀆰 １　 诱导温度对 β 蒎烯产量的影响
低的诱导温度可以增加重组酶的可溶性表达，进
而增加其在工程菌细胞体内的活性［１１－１２］。 然而低的
诱导温度势必会影响菌体的正常生长，从而影响目的
产物的产量。 因此，最佳诱导温度的控制是酶的表
达、细胞生长和产物形成的最佳平衡［１０］。 为提高目
的产物 β 蒎烯的产量，考察不同的诱导温度（２５、２８、
３０、３４和 ３７ ℃）对产物的影响，结果见图 ５。
图 ５　 诱导温度对工程菌 ＦＨＲ ２产 β 蒎烯的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ β⁃ｐｉｎｅｎｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＦＨＲ⁃２
由图 ５可知：随着诱导时间的延长，不同诱导温
度下的 β 蒎烯产量都有一个逐渐上升后又有所下
降的趋势。 而随着诱导温度的升高，β 蒎烯的产量
逐渐升高，在 ２８ ℃时达到一个峰值，然后逐渐降低。
这可能是由于摇瓶的气密性不好和中间取样造成
胶塞漏气等原因造成。 在 ２８ ℃诱导温度下，β 蒎
烯的产物质量浓度最高可达 ５􀆰 ０１ ｍｇ ／ Ｌ，是 ３０ ℃ 时
最高产量（４􀆰 １２ ｍｇ ／ Ｌ）的 １􀆰 ２２ 倍。 由此可知发酵
最适诱导温度为 ２８ ℃。
２􀆰 ４􀆰 ２　 诱导剂（ＩＰＴＧ）浓度对 β 蒎烯产量的影响
外源基因的过量表达通常会增加工程菌的代
谢负担，从而影响细胞的生长速率、细胞浓度、产物
水平及质粒的稳定性［１３－１４］。 通过调节诱导剂 ＩＰＴＧ
的浓度可以改善外源基因的表达对细胞代谢的影
响。 考察不同诱导剂 ＩＰＴＧ 浓度（０􀆰 ０５、０􀆰 １、０􀆰 ２５、
０􀆰 ５和 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）对工程菌 β 蒎烯产量的影响，结
果见图 ６。 由图 ６可知：随着诱导剂浓度的升高，β
蒎烯产量有一个先上升后下降的趋势。 诱导剂浓
度低于 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，β 蒎烯的产量随诱导时间
３３　 第 １期 冯红茹等：β 蒎烯合成酶（ＱＨ６）在大肠杆菌中的表达及其产 β 蒎烯的研究
的延长逐渐升高，最后又有所降低。 在诱导剂浓度
为 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，蒎烯产量极低而且没有明显升高的
趋势，可能是因为：高浓度诱导剂对于载体中重组
酶的过表达导致了代谢负担，使得代谢流不利于目
标产物的合成；同时高表达量载体对蛋白表达有
利，却不一定有利于终产物 β 蒎烯的合成。 在 ２８
℃诱导温度下，ＩＰＴＧ 浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 时，β 蒎
烯的产物质量浓度最高可达到 １８􀆰 ９３３ ｍｇ ／ Ｌ。 而
０􀆰 ０５、０􀆰 ２５、０􀆰 ５ 和 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的最高产物质量浓度
分别为 １３􀆰 ９５３、５􀆰 ７８、４􀆰 １２ 和 １􀆰 １８４ ｍｇ ／ Ｌ。 由此可
知，ＩＰＴＧ最适诱导浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
图 ６　 ＩＰＴＧ浓度对工程菌 ＦＨＲ ２产 β 蒎烯的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ β⁃ｐｉｎｅｎｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＦＨＲ⁃２
１—大豆蛋白胨；２—蛋白胨；３—索莱宝牛肉粉；４—双旋牛肉粉；
５—阿拉丁牛肉粉；６—奥博星牛肉粉；７—ＭＤ牛肉粉
图 ７　 不同 Ｎ源对工程菌 ＦＨＲ ２产 β 蒎烯的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｃ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ
ｏｎ β⁃ｐｉｎｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＦＨＲ⁃２
２􀆰 ４􀆰 ３　 Ｎ源对 β 蒎烯产量的影响
培养基的 Ｎ 源种类在提高微生物发酵目标产
物的产率方面发挥重要的作用［１５］。 考察 ７ 种不同
厂家来源的有机 Ｎ源对生物催化合成 β 蒎烯产量
的影响，结果见图 ７。 除培养基中 Ｎ源不同外，其他
组分与前文一致。 由图 ７ 可知：在 ２８ ℃诱导温度
下，ＩＰＴＧ浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ时，来自于 ＭＤ 公司的
牛肉粉效果最好，β 蒎烯产量为 ２２􀆰 ８９ ｍｇ ／ Ｌ。 该结
果比 Ｂｏｋｉｎｓｋｙ 等［１６］得到的蒎烯产量 （ １􀆰 ７ ± ０􀆰 ６）
ｍｇ ／ Ｌ提高了 １２􀆰 ４６倍。
根据以上发酵条件优化获得的数据，不难看出
微生物发酵生产 β 蒎烯的最适培养条件是：诱导温
度为 ２８ ℃，ＩＰＴＧ 浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，最佳有机 Ｎ
源为 ＭＤ牛肉粉。
３　 结论
将 β 蒎烯合成酶与外源杂合的甲羟戊酸
（ＭＶＡ）一起整合到大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，通过
对重组菌进行发酵条件优化得到最佳培养条件：诱
导温度为 ２８ ℃，ＩＰＴＧ浓度为 ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，最佳有机
Ｎ源为 ＭＤ牛肉粉，在此条件下，检测出 β 蒎烯产
量达到 ２２􀆰 ８９ ｍｇ ／ Ｌ，比优化前（４􀆰 ６０ ｍｇ ／ Ｌ）提高了
３􀆰 ９８倍。 从合成生物学的角度来分析本研究的实
验现象和数据可知：对于构建多酶催化的复杂代谢
途径而言，有必要通过发酵条件优化等手段来调整
各种酶的表达量与活力，使得代谢流更有利于目标
产物合成。 此外，本研究利用代谢工程的手段改造
大肠杆菌，成功地在大肠杆菌体内构建了一条 β 蒎
烯合成途径，为利用 ＭＶＡ 途径生产生物基化学品
的研究奠定了一定的基础。
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（下转第 ４６页）
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􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌
（上接第 ３４页）
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６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷