全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 18卷 第 4期
2006年 8月
Vol. 18, No. 4
Aug., 2006
体细胞核移植后核重编程的影响因素
李 雁， 冯 云*， 孙贻娟
（上海交通大学医学院附属瑞金医院生殖医学中心，上海 200025）
摘　要：近年来，人类核移植胚胎干细胞建系成为一项炙手可热的研究，用再生医学的理念治疗退行
性疾病及器官移植为这一研究带来无穷的魅力和生命力；但是核重编程仍是核移植技术的瓶颈，制约
了重构胚胎干细胞的研究。核重编程是指供体细胞核移入卵母细胞后必须停止本身的基因表达程序并恢
复为胚胎发育所必需的特定的胚胎表达程序。只有供核发生完全重编程，重构胚胎才能正常发育。核
重编程与供核者的年龄，供核细胞的组织来源、分化状态、细胞周期、传代次数，供核的表遗传标
记以及供卵者的年龄、卵子的成熟度等因素有关。一般来说，颗粒细胞作为核供体最易被核重编程。
供核者为胎体或新生体，供核细胞处于低分化状态或已传数代，供核细胞经过去表遗传标记处理，供
卵者性成熟且年龄轻、卵子核与胞浆都成熟等均为有利于核重编程的因素。重构胚胎的培养方法对核
重编程也至关重要，目前主张使用序贯培养及体细胞化培养。创造各种适于核重编程的条件有利于从
更高的起点开展核移植胚胎干细胞研究，提高重构胚胎干细胞建系效率。
关键词：核移植； 核重编程； 治疗性克隆； 表遗传标记
中图分类号：Q343.5; Q813　　文献标识码：A
Influencing factors of nuclear reprogramming after somatic cell nuclear transfer
LI Yan, FENG Yun*, SUN Yi-Juan
(Reproductive Center, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)
Abstract: In recent years, human somatic cell nuclear transfer-embryo stem (SCNT-ES) research has become more
and more influential and powerful. It is the regeneration medicine which gives the new idea to degenerative disease
and organ transplantation. However, nuclear reprogramming, which stands in the way of reconstructed embryo
stem cell research, is still a bottleneck in the procedure of nuclear transfer. Nuclear reprogramming means that
the donor nuclei must erase the previous memory of cell differentiation and go back to a totipotent status. It has
a pridominant effect on reconstructed embryo development. There are many influencing factors of nuclear
reprogramming, such as the age of somatic cell donor, the source of somatic cell and its differentiation,cycle stage,
passage number and epigenetic marks, the maturation of oocyte and its donor’s age, and so on. In general idea,
cumulus cell is the best nuclear donor cell for reprogramming. Nuclear donor is fetus or newborn, donor cell is
of later passages or in relatively undifferentiate status, modification of pre-epigenetic marks in donor cell,
oocyte donor is sex maturation and relative young, both of oocyte nuclear and cytoplasm is maturation. All
these above fators are benefit of nuclear reprogramming. Besides that, the culture condition is also very
important in nuclear reprogramming. Using sequence culture medium and cultrue medium which somatic cells
prefer is been recommended. Anyway, setting up a smart situation for nuclear reprogramming will improve the
efficience of producing SCNT-ES cell line and benefit the therapeutic cloing.
Key words: nuclear transfer; nuclear reprogramming; therapeutic cloning; epigenetic modification
文章编号 ：1004-0374(2006)04-0355-06
收稿日期：2005-12-22；修回日期：2006-02-20
基金项目：上海市科委重大项目基金(03DJ14018)
作者简介：李 雁(19 80 －) , 女 , 硕士研究生 ; 冯 云(19 53 －) , 女 , 主任医师 , 教授，硕士生导师 , * 通讯作者;
孙贻娟(1976－), 女, 主治医师。
356 生命科学 第18卷
自克隆羊 Dol ly诞生以来，核移植(nuclea r
transfer，NT)技术先后经历了两个蓬勃发展的时
期：首先是以Dolly为代表的生殖性克隆(reprodu-
ctive cloing)[1]，先后有绵羊、牛、小鼠、猪、山
羊、猫、兔子等多种哺乳类克隆动物出生；其次
是以体细胞核移植胚胎干(somatic cell nuclear trans-
fer embryo stem, SCNT-ES)细胞建系为代表的治疗性
克隆，在牛核移植胚胎干(nuclear transfer embryo
stem，ntES)细胞系、鼠 ntES细胞系、人 -兔异种
ntES细胞系相继问世后，人类 ntES细胞系呼之欲
出。虽然它暂时未经得起真伪的考验，但鉴于 ntES
细胞技术上的可能性及其对退行性疾病治疗及器官
移植的重大意义，人类生命科学必将开始重构胚胎
干细胞研究的新纪元。无论是生殖性克隆还是治疗
性克隆都是以成功的核移植技术为基础的，都需要
将已分化的供体细胞核重编程( n uc l ea r r epr o-
gramming)为全能化的、胚胎化的状态。核不全重
编程是克隆动物妊娠高流产率及生后高死亡率的原
因，也可能是重构胚胎干细胞分离诱导效率低的原
因。因此，明确核重编程的影响因素，建立适合
核重编程的有利条件，才能获得高质量的克隆胚
胎，从根本上提高重构胚胎干细胞诱导效率。
1　核重编程的基本概念
核重编程是指核移植后供体核停止本身的基因
表达程序，恢复为胚胎发育所必需的胚胎化基因表
达程序状态。核移植完成后，核重编程立即开始进行
[2]，其过程包括染色体结构重建、DNA甲基化、组
蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复、X
染色体失活等[3~4]。经过核重编程供体核的基因重新
归零，由分化状态恢复为未分化的初始基因表达状
态 。
2　核移植的问题及与核重编程的关系
体细胞核移植最大的问题是克隆胚胎发育异常
多，发育为正常个体或提取多能干细胞的效率低。
据统计约有64%的克隆牛、40%的克隆羊和93%的
克隆小鼠存在各种各样的生理异常，这些异常包括
胎盘肥大、巨大胎儿、肺部高压、循环障碍、肝
纤维化等[5]。克隆动物的种种异常不会遗传给下一
代，其基因序列并未改变，而是基因组的修饰表达
发生变化，重构胚胎的体细胞核未能完成正常胚胎
的基因组后生修饰(epigenetic modification)，即发生
了不完全的核重编程[6]。这种核不全重编程的具体
内容包括：一些胚胎时期的关键基因没有被激活[7];
基因印记异常及相关基因的表达异常[8]; 整个囊胚基
因组的甲基化状态高[9]等。
SCNT-ES细胞建系效率还很低，首先是重构
胚胎发育为囊胚的比例低，与体外授精( in v it ro
fertilization, IVF)胚胎的囊胚形成率相比还有很大差
距[10]; 其次是重构胚干细胞提取效率低，在鼠胚的
研究中单个囊胚获得 ntES 细胞的效率仅有 4%~
10%[11~12]。这除了与目前的干细胞提取、培养技术
有待改进外，还与重构胚胎核不全重编程有关。因
为囊胚中并不是每个细胞都是多能干细胞，只有那
些核重编程完全的才具有多元分化的潜能。因此，
建立良好的核重编程条件对治疗性克隆也很关键。
核重编程是一个多基因多修饰的过程，因此，
没有一个明确的生化指标来衡量基因组重编程的程
度，目前一般是通过核移植的效率来评估的。这包
括克隆胚胎的囊胚形成率、干细胞的提取效率、克
隆动物的出生率及存活状态等。
3　影响核重编程的因素
影响核重编程的因素贯穿于核移植的各个参与
元素及其技术过程本身，目前研究较多的因素主要
有供核因素、受卵因素、重构胚的培养因素及核移
植的技术因素等。关于核重编程的认识大多来自于
克隆动物的研究结果，这些研究虽无法克服克隆动
物高死亡率的难题，却推动了人类治疗性克隆的发
展，认识和利用这些因素可以从更高的起点开展
SCNT-ES研究工作。
3.1　供核因素
3.1.1　供核者的年龄　体细胞供核者的年龄与SCNT
胚胎的发育有密切的关系。来源于胎体或新生动物
的体细胞往往具有更高的克隆效率。Tian 等[13]成纤维
细胞克隆牛的实验表明，供核者为胎牛和新生牛所
形成的重构胚比供核者为 2岁以上牛的囊胚形成率
高(p<0.05)，而 2岁、10~12岁及 16岁三组间囊胚
形成率则无明显差别。Kato等[14]的实验也表明，将
克隆胚行子宫腔移植后，来源于胎牛及新生牛的克
隆比来源于成年牛的克隆具有更高的妊娠率和产后
存活率。这可能是由于来源于胎体及新生体的体细
胞基因突变少，具有更低的分化状态，因此，核
移植后具有更高的核重编程效率。
由于种种原因，目前使用胎儿或新生儿的体细
胞作为核供体的研究不多。在儿童期及以上各年龄
段中，供核者的年龄对ntES细胞形成效率影响不明
显。在 Chen等[15]的实验中选择了 5岁、42岁、52
357第4期 李 雁，等：体细胞核移植后核重编程的影响因素
岁、60岁的四人作为核供者，将其体细胞核移入
兔的卵母细胞中，结果表明囊胚形成率无差异。关
于人类 SCNT的研究尚不多，获得囊胚的则更少，
因此，就目前研究的样本数来看还不能完全判定人
类供核者年龄与核重编程的关系。
3.1.2　供核细胞的分化状态　除成体细胞外，胚胎
细胞、ES 细胞、成体干细胞均可作为供核细胞。
总的来说，供核细胞分化程度越低，核重编程的效
率越高。胚胎细胞、ES细胞核移植的成功率分别
是体细胞核移植的 30~60倍和 3~10倍[16~17]。低分化
的细胞中重要的早期发育基因处于激活状态且表遗
传标记改变较少，缩小了核重编程的范围；另外已
分化的细胞发生了染色体的异染色质化，由于卵子
胞浆中缺乏纠正这种异染色质化的因子，核重编程
的难度加大[18]。
由于利用体细胞作为核供体可获得与供核者免
疫源性相同的重构胚，由此提取的干细胞移入供核
者体内不发免疫排斥，因此，SCNT是胚胎细胞、
ES细胞所无法代替的。有人也提议提取成体干细胞
作为核供体来提高核移植的效率，但由于成体干细
胞的提取过程复杂、低效，目前对治疗性克隆而
言，仍主张用成体细胞作为核供体。
3.1.3　供核细胞的来源　颗粒细胞、成纤维细胞、
睾丸支持细胞、已分化的造血细胞、上皮细胞等都
可作为核供体，也都曾有成功的克隆，但它们的克
隆效率并不相同。目前认为颗粒细胞和成纤维细胞
最适合作核供体。颗粒细胞在获卵的同时即可获
得，它体积小，注核技术难度低，而且颗粒细胞
在组织学上与卵子具有同源性，被认为是最易被核
重编程的体细胞。Tian等[13]总结了多个实验室的数
据后认为，无论是从重构胚的体外发育情况还是从
克隆动物的长期存活率来看，颗粒细胞都是最有效
的克隆核供体细胞。成纤维细胞虽然注核难度大，
核移植效率逊于颗粒细胞，但其最大的优点是便于
获得(皮肤活检)、没有性别年龄限制，在核移植的
临床应用方面更具实际价值；再者成纤维细胞易于
体外培养、传代、孵育，在实验设计和改变其表
遗传标记方面更具可操作性。
3.1.4　供核细胞的周期和核质同步性　早期提出供
核细胞和受卵在细胞周期上应具有同步性，提倡将
供核细胞诱导为G0期再进行核移植。Dolly的成功
曾很大程度上被归功于用血清饥饿法将供核细胞诱
导到G0期[1]。后来更多的实验表明，使供核细胞处
于 G0期是没有必要的。首先，处于各期(M期[19]、
G2／M期[20]、G1期[21]等)的供核细胞都有成功的克
隆报道；其次，在很多实验中，让体细胞处于 G0
期并不增加克隆效率[22]; 再次，让细胞停滞于某一
周期的方法可能会影响克隆胚胎发育[23 ]。
3.1.5　供核细胞的传代　对供核细胞先进行体外培
养，传代数次后再行核移植也会提高克隆的效率。
Kubota 等[24]将牛的成纤维细胞体外传代，发现传10
代、15代的体细胞作为核供体比传 5代的重构胚的
囊胚形成率高。Arat等[25]在颗粒细胞转基因牛的研
究中也发现传 15代的供核比传 10、11、13代的更
易发生核重编程，有更高的囊胚获得率。体细胞经
体外培养，在分子遗传学方面发生一定变化，Baker
等[26]研究认为细胞传代可使某些基因表达；Enright
等[27]研究表明，细胞经过传代后，其表遗传学改变
减少，组蛋白乙酰化程度增高，即分化程度降低。
这些都可能使传代后的细胞更易接受核重编程。
3.2　受卵因素
3.2.1　供卵者的年龄　各种实验表明，使用性成熟
供卵者的卵子更有利于核重编程。与年幼者相比，
性成熟者的卵子 IVF中更具发育潜能[28]，其卵浆中
也含有更充分的减数分裂促进因子(mitosis-promoting
factor, MPF)和有丝分裂原蛋白激活激酶(mitogen-
activated protein kinase, MAPK)[29]，这两种因子是促
进核重编程进行的有效因子。
对人类而言，获得年龄相对较轻、性成熟女
性的卵对提高核重编程更具意义。虽然人类 SCNT-
ES研究还缺乏真实有效的数据，但就卵子发育潜能
来看，大于 35 岁女性的卵子质量明显下降，卵子
非整倍体比例增高。高龄女性卵巢周围血供不足，
卵泡液中呈现缺氧状态[30]，线粒体等细胞器发生发
育受损，纺锤体合成障碍，致使细胞分裂无法正常
进行[31]。因此，使用高龄女性的卵子会影响核重编
程的效率，发生重构胚胎染色体不能正确分离的现
象 。
3.2.2　卵母细胞的成熟度　目前已公认中期Ⅱ(MⅡ)
的卵母细胞是最适合的核移植受体，此时的卵子核
与胞浆都发育成熟，含有足够量的核重编程因子来
促使供核的胚胎化。此外，刚排出第一极体的卵母
细胞核与极体的位置靠近，便于提高去核效率。
长期以来选择成熟卵往往只注重核成熟(排出第
一极体)，而忽略胞质成熟。这一问题在体外成熟
(in vitro maturation，IVM)技术发展后更为明显。
358 生命科学 第18卷
核成熟与胞质成熟并不完全同步，IVM的卵子更易
出现胞质成熟滞后[32]。成熟卵子的胞质内各细胞器
发生一定变化：大部分皮质区不含细胞器；皮层
颗粒在质膜下单层分布；线粒体呈帽状分布于卵质
中央区。胞质不成熟的卵母细胞除没有上述细胞器
变化外，还因其 GSH 数目不足使氧自由基对细胞
骨架破坏加大，微管蛋白聚合障碍，从而影响到染
色体的规律排列和细胞器的正确分布[33]。因此，胞
质不成熟的卵子发育潜能低下，行 IVF后囊胚获得
率低、胚胎种植率差，在核移植过程中势必也会影
响到重构胚胎的发育力。由于胞浆成熟从宏观形态
上难以把握，因此，其对核重编程的影响更应被重
视 。
3.2.3　卵母细胞的体外成熟　IVM可提高卵母细胞
的获得数量、降低获卵成本，曾在家畜克隆研究中
功不可没。早期各项研究表明，体内成熟优于
IVM，用体内成熟的卵子作为核移植的受体有更高
的核移植效率[34] ；后来 Lee等[35]研究认为，在孤
雌发育上体内成熟较 IVM囊胚获得率高，而在核移
植方面两者没有差别。近年来，由于 IVM培养液
不断改进，IVM的培养条件和技术方法不断更新，
更多实验表明，两者在核移植方面几乎无差别[36~37]。
在人类SCNT研究中 IVM更具重大意义。这一
技术不但可提高获卵数目，还可避免促排卵对捐卵
者的不利影响，使卵子捐赠更为合理。虽然 IVM
在人类核移植研究中暂无贡献，但在辅助生育技术
(assisted reproductive technology, ART)中已迅猛发
展，成为多囊卵巢综合征患者获卵及避免卵巢过度
刺激的常规手段。在ART领域已有成熟的 IVM促
排卵方案及卵子培养条件，关于 IVM卵子 IVF的临
床妊娠率报道不一，约 30%~40%[38]，比常规 IVF
低约 10%，因此，人类 IVM获得的卵子可能尚存
在发育潜能上的不足。
3.3　培养环境
3.3.1　供核细胞的去表遗传信号培养　组蛋白乙酰
化和DNA甲基化是两种可遗传的非基因序列变化的
染色体改变，即表遗传学改变，这种改变与细胞分
化有关。在正常受精过程中，配子处于低甲基化水
平，在胚胎发育早期这些甲基化被擦除而形成胚胎
基因的原始化、全能化[39]。同样在核移植过程中，
供核的表遗传学改变也需要在胚胎中得到恢复才能
形成成功的克隆，因此，人为的减少供核的表遗传
标记可能更有利于核重编程。曲古抑菌素
(Trichostatin A，TSA)和 5-氮脱氧胞苷酸(5-aza-
deoxycytidine，5-aza-dc)分别具有增加组蛋白乙酰
化和去甲基化作用，是两种可去除表遗传标记的化
学物质，与体细胞孵育后可使供核细胞基因组在表
基因特征上与配子及胚胎更接近，有利于完整核重
编程的发生。Enright等[40]对克隆牛胚胎的研究中发
现低浓度(0.08 µM)的TSA有效地提高了克隆胚的囊
胚形成率；5-aza-dc虽明显造成供核的低甲基化水
平，但它反而降低了克隆胚胎的囊胚形成率，原因
是 5-aza-dc浓度过高引起细胞凋亡，浓度低延长孵
育时间，破坏发育相关的重要基因、抑制胚胎发
育。因此，对 5-aza-dc的浓度及孵育时间的关系还
需进一步研究[40]。
3.3.2　克隆胚胎的序贯培养　在人类ART中早就提
出，胚胎和囊胚所需的营养因子不同而需要使用序
贯培养法，即先用卵裂期培养液将胚胎培养至 7~8
细胞，再使用囊胚培养液[41]。重构胚胎也面临着同
样的问题，在胚胎融合前使用适合囊胚生长的培养
液可提高囊胚形成率。Chung等[42]在颗粒细胞克隆
鼠的实验中发现，用Whitens培养液将重构胚培养
至 4~8细胞再更换KSOM培养液更有利于重构胚胎
发育，使用这种序贯培养法比单用CZB-G培养液囊
胚形成率高，比单用Whitens培养液囊胚所含细胞
数目多。此外，在人类 SCNT-ES的研究中由于共
培养法易造成胚胎污染，使用序贯培养意义更为重
大 。
3.3.3　克隆胚胎的体细胞化培养　Gao等[43]在成纤
维细胞克隆小鼠的实验中发现，重构胚在适合于成
纤维细胞生长的体细胞培养液中发育较在胚胎培养
液中良好。前者中囊胚形成率高、胚胎形态良好、
ICM(内细胞团)／ TE(滋养层)比例恰当。他们认为
在胚胎发育早期核重编程是不完全的也是在不断进
行中的，在此期间胚胎仍表达某些供核细胞所特有
的蛋白，因此在生物学性状上也向供核偏斜。过早
使用标准的胚胎培养液会扰乱重构胚的内环境而抑
制核重编程，甚至威胁重构胚的存活。因此，重
构胚发育早期，在培养液中加入适当的适于供核细
胞生长的营养元素往往更有利于胚胎的发育及重编
程 。
3.4　其他技术因素
核移植技术的完善对提高克隆动物的妊娠率及
SCNT-ES细胞建系效率功不可没；但是由于各种核
移植操作的实验目的、动物模型、细胞选择等各不
359第4期 李 雁，等：体细胞核移植后核重编程的影响因素
相同，因此，在技术方面没有一个共性的结论，需
要根据实验的具体条件加以参考、摸索。以下几方
面是核移植技术应特别注意的环节，往往决定了核
移植的命运。去核方式：动物克隆先后经历了半卵
法、盲吸法、纺锤体观测仪辅助去核等去核方法，
去核效率不断提高。在灵长类主张用挤压去核法[44]。
注核方式：根据供核的大小一般选择直接注入法
(如颗粒细胞)或透明带下注核合并电融合法(如成纤
维细胞)，再根据具体的动物模型选择，如注射针
口径、电融合脉冲频率等要素。重组时间：是指
核移植后细胞融合至卵子激活之间的一段时间，在
这段时间内供核基因组开始重编程，消除原有表遗
传标记重新回到胚胎化状态。摸索合适的重组时间
往往是核移植过程的关键。激活方式：激活的目的
是代替精子引发卵子一过性的Ca 2+振荡，促使重构
卵分裂为 2细胞胚胎。各组实验都需要根据实验模
型选择最恰当的激活剂及其浓度。
4　结语
近年来核移植技术发展迅速，核移植与干细胞
结合而成的治疗性克隆更是人类科学领域的制高
点，具有无穷的魅力和生命力。目前 SCNT-ES研
究主要面临三大难题：供卵缺乏、伦理限制、干
细胞提取效率低。由干细胞诱导出卵子的技术有可
能成为无穷无尽的卵子来源[45] ；我国《人胚胎干
细胞研究伦理指导与原则》及在联合国同意治疗性
克隆的投票为干细胞的研究提供了伦理依据；而干
细胞的低提取效率则需要从核重编程的完整性及核
移植技术的完善性考虑。找出各种影响核重编程的
因素，建立最为有利的核重编程条件，才能打破治
疗性克隆干细胞提取效率的瓶颈，使这一技术在人
类疾病的治疗中真正发挥作用。
[参　考　文　献]
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