全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 19卷 第 4期
2007年 8月
Vol. 19, No. 4
Aug., 2007
酵母三杂交系统的原理和应用
彭丹妮，黄　静*，吴自荣
(华东师范大学生命科学学院，上海 200062)
摘　要：酵母双杂交系统自出现以来，广泛用于研究蛋白质之间的相互作用，它是一种具有高灵敏度
的研究蛋白质之间关系的技术。在酵母双杂交系统基础上发展的酵母三杂交系统将应用范围扩展到蛋白
质 -蛋白质、蛋白质 -RNA、蛋白质 -小分子化合物等更广阔的研究领域。本文着重介绍酵母三杂交系
统的原理、应用及局限性。
关键词：酵母三杂交系统；蛋白质 -蛋白质相互作用；蛋白质 -RNA相互作用；蛋白质 -小分子化合物
相互作用
中图分类号：Q 81 2　　文献标识码：A
Principle and application of the yeast three-hybrid system
PENG Danni, HUANG Jing*, WU Zirong
(School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200062, China)
Abstract: The yeast two-hybrid system is widely employed in genetic screening and detecting protein–protein
interactions. The yeast three-hybrid system, based on the yeast two-hybrid system, can be applied to much
broader areas for detection of interactions between protein-protein、protein-RNA and protein-small ligand.
This minireview deals with the principle, application, and shortcoming of the yeast three-hybrid system.
Key words: yeast three-hybrid system；protein-protein interactions；protein-RNA interactions；protein-
small ligand interactions
收稿日期：2007-01-29；修回日期：2007-04-18
基金项目：上海市科委 2004年重大计划项目(04DZ19207-1)
作者简介：彭丹妮(1982—)，女，硕士研究生；黄　静(1973—)，女，副教授，通讯作者：E-mail：jhuang@bio.
ecnu.edu.cn
文章编号 ：1004-0374(2007)04-0461-04
在生物体内，蛋白质不是单独行使功能的，而
是通过与其他蛋白质、核酸或小分子化合物进行相
互作用来执行各种生物功能的。Fields等[1]发展了酵
母双杂交系统，一种在酵母细胞中用于研究蛋白
质 -蛋白质相互作用的技术，它能快速、直接分析
已知蛋白质之间的相互作用。但是对于生物体中更
加复杂的三个，甚至三个以上的蛋白质之间相互作
用，蛋白质与 RNA，蛋白质与小分子化合物之间
的相互作用，酵母双杂交系统就略显不足。于是，
Sengupta等[2]在酵母双杂交基础上，发展出了酵母
三杂交系统，将其应用范围扩展到更大的领域。
1　酵母三杂交系统的原理
酵母杂交系统的建立得益于对真核生物调控转
录起始过程的认识：真核生物基因的转录由转录调
控因子和启动子共同调节，转录调控因子由两个结
构域组成：DNA结合域(BD)和转录激活域(AD)，转
录调控因子依靠DNA结合域结合到基因的上游激活
序列(UAS)，其转录激活域则激活下游基因的表
达，这两个结构域分开后仍各具功能，但不具有转
录调控作用，只有两者通过适当途径在空间上较为
462 生命科学 第 19卷
接近时，才能恢复转录调控作用。酵母双杂交系统
将蛋白X、Y分别与特定转录调控因子的DNA结合
域、转录激活域杂合形成两个融合蛋白(X-BD，Y-
AD)，当X与Y相互作用时，与X、Y融合的 BD，
AD在空间上接近，从而恢复该特定转录调控因子
的转录激活作用。被激活表达的基因称为报告基
因，常为 lacZ(β-半乳糖苷酶基因)和His3(组氨酸基
因)。常用的DNA结合域有Gal4DB(酵母Gal4的DNA
结合域)、LexA DB(大肠杆菌LexA的DNA结合域)，
转录激活域有 Gal4AD(酵母 Gal4的转录激活域)、
B42AD(大肠杆菌酸性激活域)、VP16(单纯疱疹病毒
的转录激活域)，酵母三杂交系统中，BD 与AD的
相互靠近由组分Z桥联X和Y来完成(图 1)。组分Z
可为蛋白、RNA或小分子化合物，根据组分 Z不
同，酵母三杂交系统有不同的功能。
2　酵母三杂交系统的应用
2.1　分析蛋白质 -蛋白质间的相互作用
蛋白质之间的相互作用调控大多数细胞功能。
蛋白复合体的组装能启动 DNA复制、转录、蛋白
合成、基因重排、细胞生长及分化等，阐明蛋白
间的相互作用也有助于破译信号转导机制。在酵母
三杂交系统中，Z为一个蛋白，与融合蛋白X-BD、
Y-AD在酵母细胞核中共表达。当 Z 同时与X、Y
有相互作用时，BD与 AD空间上靠近，报告基因
被激活。酵母三杂交系统主要应用在以下方面：
2.1.1　分析三个蛋白质之间的关系　Zhang等[3]首次
用酵母三杂交系统分析了 EGFR/Grb2/Sos（表皮生
长因子受体 /衔接蛋白 /鸟嘌呤核苷酸交换因子）复
合体中三个蛋白的关系。构建的 2 个融合蛋白
EGFR-Gal4BD和Sos-Gal4AD在有Grb2表达质粒存
在时，能成功地激活报告基因的表达，验证了该系
统用于发现三蛋白复合体的可能性。用该法还可从
cDNA文库克隆桥联蛋白，也可直接从化学文库中
筛选影响三蛋白复合体形成的药物，阻断引发疾病
的蛋白相互作用，从而达到治疗的目的。
组分 Z也可以是不直接与X、Y结合，而是通
过改变 X 或 Y 的构象，从而激活相互作用的酶。
Osborne等[4]用 IgE(免疫球蛋白 E)受体的 γ亚基，分
离得到了一个新蛋白，而两者只有在酪氨酸激酶
Lck存在时才相互作用。应用该法能方便地研究需
要转录后修饰的蛋白之间的相互作用。
2.1.2　分析配体与受体的关系　在信号通路研究中，
跨膜受体的细胞外结构域分别与BD、AD形成两个
融合蛋白，配体表达使受体二聚化，从而激活报告
基因的表达。Ozenberger等[5]用此法检测了生长激
素受体和血管内皮生长因子受体与天然肽配体的结
合。
2.2　分析蛋白质 - RNA间的相互作用
蛋白质 -RNA之间的相互作用是许多细胞过程
的基础，如转录、转录后修饰、核小体超分子结
构的组装、RNA的稳定性、病毒 RNA包装，RNA
运输和定位等，都涉及到两者之间的反应。酵母三
杂交系统在活体细胞中检测相互作用，不需要纯化
RNA结合蛋白，已广泛应用于蛋白质 -RNA相互作
用的研究。RNA三杂交系统中，AD与 BD的靠近
是依赖于蛋白质 -RNA间的相互作用，组分 Z是一
个杂合 RNA(a-b)。当杂合 RNA的 a、b序列能分别
与蛋白 X、Y相互作用时，融合的 AD与 BD在空
间上相互靠近，报告基因被激活。X-a一般为已知
有相互作用的蛋白质和RNA，常为噬菌体MS2衣壳
蛋白与MS2衣壳蛋白结合位点、铁调节蛋白(IRP1)
与铁效应元件(IRE)、HIV-1 Rev蛋白(病毒体蛋白表
达调节因子)与 Rev效应元件(RRE)。而Y、b为待
研究的蛋白质与 RNA序列。该系统应用如下：
2.2.1　克隆 RNA结合蛋白　以 RNA作为诱饵筛选
cDNA表达文库，克隆特征未知的RNA结合蛋白基
因。利用这一系统已经成功地确定了 20多种 RNA
结合蛋白。Poleev等[6]用APP基因剪切增强子序列
作诱饵，得到了NAPOR-3(Homo sapiens apoptosis-
related RNA binding protein)和 Siah-BP (Siah binding
protein)2个RNA结合蛋白，它们影响APP小基因的
差异剪接。Le等[7]用人的 hTR(端粒酶 RNA)筛选到
蛋白 hStau(一种双链 RNA结合蛋白)和核糖体蛋白
L22，可能与 hTR的加工、定位或端粒酶 RNP的
组装有关。Steiner-Mosonyi等[8]用 tRNA基因作诱
饵，筛选得到核仁蛋白 Utp8p，它是核 tRNA运出
机制的重要核内组分。
2.2.2　寻找已知蛋白质的RNA目标　用Y-AD作诱
图1　酵母三杂交系统原理图
463第 4期 彭丹妮，等：酵母三杂交系统的原理和应用
饵，从RNA文库中筛选蛋白Y的RNA目标。Sengupta
等[9]用该法寻找 Snp1蛋白的 RNA靶序列，得到了
含SNR19 RNA(U1 RNA) loop1序列的1个RNA片断
和 4个亲和性较弱的 RNA。Ostrowski等[10]用鼠的
hnRNP K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K)
从人的RNA文库中筛选到一个由线粒体基因组编码
的RNA(mtRNA)，表明 hnRNP K可能与线粒体基因
的表达有关。
2.2.3　分析蛋白质 -RNA反应的关键区域 Guerra-
Peraza等[11]用一系列CaMV衣壳蛋白N-和C-末端缺
失突变体与Gal4AD融合，发现锌指结构域和部分
碱性结构框是CaMV衣壳蛋白与CaMV pgRNA结合
必需的。Jaeger等[12]检测了HBP(histone hairpin bind-
ing protein)与组蛋白mRNA 3 UTR发夹结构(HP)的
相互作用，在随机突变的AD-HBP文库中，发现影
响结合的突变都位于 HBP的 RBD(RNA binding
domain)中，而回复突变大多都位于 RBD区域外。
Lee和Linial[13]随机诱变白血病肉瘤病毒的最小包装
序列Mψ，明确了对结合(即 RNA衣壳包装)重要的
RNA二级结构。
2.2.4　鉴定RNP复合体的组分　Rho和Martinis[14]将
亮氨酰 tRNA合成酶与 bI4成熟酶分别与 LexABD，
B42AD构建成两个融合蛋白，它们与 bI4内含子
RNA的结合直观地证实了 bI4内含子剪接复合物的
组装。也有应用 R N A 与蛋白共同作为诱饵，从
cDNA文库中筛选蛋白。成功的例子有用Ro60-Hyrna
复合体得到 RoBP蛋白[15]。Sonoda和Wharton[16]用
Pumilio-hunchback mRNA复合体得到结合蛋白
nanos，再用 Pumilio-hunchback mRNA-nanos作诱
饵，得到一个能形成四杂交复合体的蛋白 Brat。
2.3　分析蛋白质 -小分子化合物间的相互作用
小分子化合物与其蛋白质受体发生相互作用
后，会引发一系列生物学或药理学效应，但这些小
分子化合物的蛋白质受体还未被人们清楚地了解。
酵母三杂交系统的应用则让人们能通过大规模的筛
选寻找答案，其在药物发现中的重要意义在于：明
确小分子药物的作用靶点，阐明药物作用机制。
Licitra和Liu[17]将DEX(地塞米松)、FK506(他克莫司)
共价连接形成杂合小分子化合物，rGRHBD(rGR
hormone-binding domain)与 BD形成融合蛋白 1，
FKBP12(FK506-binding protein，Mr=12 000)与AD形
成融合蛋白 2，当表达这两个融合蛋白的酵母菌在
含有DEX-FK506的培养基上生长，能成功地检测到
报告基因的表达。而当引入单体 FK506分子时，由
于其竞争性结合 FKBP12，使三元复合体无法形
成，几乎完全抑制了报告基因的表达。这进一步证
实了报告基因的激活确实是由蛋白质受体-小分子化
合物相互作用引起的。
Baker等[18]提出了另一种应用，用酶的作用底
物代替杂合小分子化合物中的碳连接链，将酶的催
化作用(键的断裂和形成)与报告基因的转录相关联。
此法可在大量突变型中筛选对酶活性关键的氨基
酸，或从大量底物中确定酶的特异性，同样也可用
于药物开发，通过筛选小分子化合物文库，从细胞
表现型来确定其对酶的抑制或激活作用。
3　酵母三杂交系统的局限性及展望
酵母三杂交系统在研究蛋白质 -蛋白质、蛋白
质-RNA和蛋白质-小分子化合物相互作用等诸多领
域有巨大的应用潜力，但仍有许多实际问题需要解
决。由于三杂交筛选是在细胞核中进行，而细胞核
并非许多反应发生的最佳场所，如有些蛋白质需要
胞质酶的修饰，或在其定位到核时的错误折叠及不
稳定性，常不能检测到相互作用。有些哺乳动物蛋
白在酵母菌中不能正确折叠表达，以细菌、哺乳动
物细胞为宿主的杂交系统现已建立，能更真实的模
拟相互作用发生的自然细胞环境。对不能被转运到
细胞核的蛋白质，如跨膜蛋白和分泌型蛋白，酵母
三杂交系统则不能应用。目前，酵母三杂交系统仍
是研究蛋白质与配体相互作用的有力手段，以后还
可能发展出研究 RNA-RNA，多蛋白相互作用及功
能更加强大的杂交系统。
[参　考　文　献]
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