全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 20卷 第 5期
2008年 10月
Vol. 20, No. 5
Oct., 2008
文章编号 ：1004-0374(2008)05-0702-05
细胞类型特异的遗传学操作：
揭开复杂神经环路的面纱
黄佐石
（美国纽约冷泉港实验室）
摘　要：现代神经科学的一个重要课题是阐明复杂神经环路及其细胞组成形成行为的机制。我们希望可
以通过对特定神经元群体的区分和操作在引发行为的神经计算和特定神经元群体活性之间建立一种因果联
系。运用 B A C 重组工程技术，我们建立了超过 2 0 个“敲入”驱动品系。在这些驱动品系中，C r e
或者是可诱导的 CreER能够在特定类型的 GABA能细胞中表达。另外，我们还建立了一些 Cre报告小
鼠品系和一个基于病毒转染的蛋白表达系统。这些病毒包含一个 Cre-激活的表达元件，可以将一些荧
光蛋白或分子开关在体内以很高的效率表达。这种基因操作的策略可以使我们进行如下的一些观察和操
作：(1)在突触水平观察中间神经元的形态和他们之间的联系；(2)观察中间神经元的活性及其过往的活
动；(3)在生理的时间分辨率上操纵特定细胞群的发放和突触传递。这将使我们对复杂神经环路功能和组
织的认识进入一个全新的领域。
关键词：基因学操作；细胞类型特异性启动子；Cre/loxP 重组调节的基因表达； GABA能系统
中图分类号：Q422; Q754　　文献标识码：A
A cell type-based genetic approach to complex neural circuits
HUANG Z Josh
(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA)
Abstract: A major challenge in modern neuroscience is to understand how behaviors emerge from the underlying
neural networks and their cellular constituents. To take on this challenge, a productive approach aims to
establish causal links between patterns of activity in specific groups of neurons and the computation of neural
circuits that guides behavior. Using BAC recombineering (bacterial artificial chromosome engineering) technology,
we are generating over 20 knockin “driver lines” expressing Cre or the inducible CreER in specific GABAergic cell
types. In addition, we are constructing a new generation of Cre-activated “reporter” mice and, in particular, Cre-
activated viruses to achieve high level expression of fluorescent proteins (FPs) and “molecular switches” (MSs,
such as ligand- or light- induced ion channels) in vivo. These genetic strategies will allow us to: 1) visualize the
morphology and connectivity of GABA interneurons with synapse resolution (genetic neuroanatomy); 2) visu-
alize the activity and activity-history of interneurons (genetic neurophysiology); 3) manipulate the firing and
synaptic transmission of defined classes of cells at physiological time scales (genetic manipulation).
Key words: genetic access; cell type specific promoters; Cre/loxP recombination-regulated gene expression;
GABAergic system
收稿日期：2008-07-21
通讯作者：E-mail: huangj@cshl.edu
703第5期 黄佐石：细胞类型特异的遗传学操作：揭开复杂神经环路的面纱
1　抑制性中间神经元系统简介
现代神经科学的一大挑战是理解大脑是如何执
行那么多的功能。主观推理与认知行动都来源并基
于内在的神经环路和细胞群体。在脊椎动物大脑的
很多区域，神经环路都是由兴奋性谷氨酸能神经元
和GABA能中间神经元组成。在皮层，谷氨酸能锥
体神经元占约 80%，它们有超过十万个的树突棘
突，赋予神经元强大的信息编码和储存能力以及可
塑性。这些锥体神经元的组合和放电被认为执行着
神经环路的输出计算。仅靠它们自己并不能执行有
用的计算。仅由锥体神经元组成的神经环路只能使
兴奋在所有方向上不断增加，这种结构本身是不稳
定的。所以，抑制性中间神经元不仅拮抗兴奋性，
它们还是神经环路结构复杂性和柔性的基础。有了
抑制，环路的活动模式就严重依赖连接细节的准确
性，即使这些锥体神经元发生微小的变化也会导致
神经网络活动的显著改变。
在正反馈抑制情况下，简单的兴奋和抑制配对
可以显著增加神经元放电的时间准确性。 负反馈抑
制可以避免兴奋后的持续放电，从而提供了稳定
性。通过旁路抑制，一个锥体神经元通过招募抑制
性中间神经元可以抑制旁边一些锥体神经元的活
动。这种“胜者通吃”的策略有效地提供了隔离
和选择机制的能力，这样的例子不胜枚举，在某种
意义上神经环路最神秘的功能就存在于抑制的细节
中，而且大脑似乎把这种策略发展到了极致。看起
来只用一种简单的氨基酸递质，但仅皮层就产生了
种类惊人的抑制性神经元。虽然在数量上是少数，
但它多样化程度是最大的。不同类的中间神经元有
不同的形态、生理学特性、连接模式和基因表达
谱。它们都释放GABA，但是在不同的时空环境这
些释放有不同的动力学特征。仅在突触后膜上基因
组就投入了 19个基因来编码GABAa受体。因为每
个有功能的受体都是一个五聚体，所以理论的组合
数量相当可观。尽管如此，实际的GABAa受体的
种类却要有限得多。进化出如此巨大的多样性，不
仅仅是为了简单的抑制,而是去调制出不同风格的抑
制，从而全面控制神经元网络的各个方面。例如，
中间神经元可以准确和动态地平衡兴奋性。仅这一
点就是了不起的才能，因为它是独立于输入模式的
强度和复杂性的。在这样一个总体平衡网络的背景
下，中间神经元可以控制突触整合的概率和动作电
位产生的时间。尤其在产生和维持网络振荡中，它
发挥了特别重要的作用，可能是它提供了时间结构
来调控神经元组合的活动。
为了获得如此非比寻常的本领，中间神经元至
少采用了两种策略。在生理水平，不同的GABA能
中间神经元被招募，从而产生特异的和多样的活动
模式。例如，某一类中间神经元容易被高频输入优
先招募，而其它种类容易被低频刺激优先招募，这
一模式就好比是种频率过滤器。这些中间神经元可
以快速发放动作电位，如自适应的，断续的，或
爆发式的。这些放电模式和锥体神经元的单调模式
有很大的区别。突触输出动力学也可以被加强，抑
制，可以被准确的同步化，持续化或异步化。此
外，在某种网络节律中，不同类中间神经元的放电
是被同步化的，或者说实际上是相位锁定的。例
如，海马中 theta振荡表明，它们对这些节律的产
生和维持都有贡献。换言之，中间神经元系统拥有
丰富的生理学词汇，不同种类中间神经元用独特的
声音来控制神经网络的活动模式。这些生理指示只
有分布整合到正确的神经元要素中才是有用的。为
了与这样的多的生理功能相匹配，中间神经元轴突
的形态与其细胞水平具有相同的多样性。例如，这
是Henry Markram实验室做的一系列重构(图 1)。蓝
色的是中间神经元的轴突，中间神经元轴突的几何
形状既可以是垂直的也可以是水平的或者形成层
状，它们可以控制皮层纵向柱内或横向一层的活
动。所有中间神经元都具有极茂盛的局域分支，这
使得它们可以控制一群特异的细胞。不同类的中间
神经元实际可以进一步投射到不同的亚细胞区域，
图1　神经元形态重构
蓝色线条为中间神经元轴突，他们都具有极其茂盛的分支，
这些分支可能垂直的也可以是水平的，或者形成层状控制皮
层纵向柱内或横向一层细胞的
704 生命科学 第20卷
例如胞体，近端树突或远端树突或轴丘，这些使得
它们可以控制输入整合和输出。最后，不同类中间
神经元终端会与特异类型的突触后受体相匹配，例
如，快速放电篮状细胞和CCK型篮状细胞都投射在
近端树突和胞体，但快速放电篮细胞利用的是快速
动力学的 α1受体，然而 CCK型更偏爱 α2型慢受
体。这些类型的GABA能轴突分布可以将输出传递
给固定的(stereotyped)和重要的(strategic)位置，如
此繁杂的多样性和异质性表明有更多种类可观的基
于细胞类型的固定性和基于连接类型的特异性。这
些新证据说明了两件事：第一是这些不同种类的
GABA能神经元是抑制环路中的功能单位，就像一
个个电子元件，每种类型可能执行特别的一组任
务；第二是，这些细胞类型很大程度上是由遗传编
码所决定的。例如，几年前 Sacha Nelson实验室
定义了皮层 GABA能中间神经元的不同基因表达
谱，并发现中间神经元之间的确存在高度特异的表
达谱。而且，John Rubenstein, Gord Fishell, Stewart
Anderson等人的研究也促进了人们对中间神经元分
化基因调控的理解。
2　基于已知基因表达谱的基因操作及其运用
在很长一段时间里，利用传统的电生理以及解
剖手段很难研究GABA能系统的复杂性。基于已知
基因表达谱的基因操作为揭开这种复杂性提供了希
望，因为正是由于基因表达从而形成或者维持了这
种复杂性。我们实验室采用了基因操作手段。我们
利用细胞类型特异性的启动子来构建相应的Cre 基因
敲入小鼠。这项工作由NIH Neuroscience Blueprint
Project的基金支持，对主要类型的中间神经元进行
基因打靶操作。在这种情况下，细胞类型是由基因
定义的。此外，将 Cre 基因敲入小鼠和报告小鼠
中交配通过Cre激活报告基因表达或者在这些Cre的
基因敲入小鼠中注射依赖Cre表达的条件性病毒来进
行基因打靶或者基因分析。通过这种方法，可以通
过荧光蛋白的表达来观察细胞形态和通过跨突触的
标记来追踪突触联系。对基因生理学来讲，意味着
定向的记录或表达基因编码的钙指示剂。而基因操
作既包括对特定基因进行改造，也包括通过光控或
者配体门控的通道来控制细胞功能。这种基于基因
表达谱的方法使我们能更进一步定义细胞类型，以
及细胞类型及其可塑性的分子基础。
我们实验室正在进行一系列目的基因的打靶，
这些基因既包括参与细胞的分化，特化以及稍后阶
段细胞类型维持的转录因子，也包括一些在相对更
为成熟的GABA能神经元亚型中表达的效应基因。
目前关于细胞类型的定义仍是一个有争议的话题，
但是简单的说，基因被认为与细胞的形态以及生理
特性有着密切的联系，我们的方法是正是基于这个
定义上，而且更为重要的是这种方法为人们分辨细
胞类型以及在细胞水平上的各种操作都提供了可行
性。我们选择基因敲入方法的主要原因是通常情况
下它能保持内源性基因的表达方式。目前有超过 15
个基因已经成功敲入ES细胞中，第一批得到的6个
生殖系小鼠已经和报告小鼠交配以验证其是否具有
正确的表达谱。
这种基因敲入小鼠的构建非常成功，在皮层中
它非常好的模拟了内源性 pa rva l b umi n 的表达。
Sacha Nelson实验室验证了在红色荧光蛋白(RFP)报
告小鼠中RFP与parvalbumin几乎是100%的共定位。
然而，这种实验系统还存在着一些局限性，特别是
在标记方面，因为任何单个基因都不能足以在脑内
任何区域或者发育的任何时期决定细胞种类。比如
parvalbumin是具有快速动作电位的中间神经元的一
个非常好的标志基因，但是parvalbumin从视网膜到
脊髓都有表达，这对基因功能的操作是非常不可取
的。另外，对于高分辨率图像来说，基于报告小
鼠的荧光蛋白表达是不足的。最后，非常重要的
是，这种方法耗时耗钱。因此，实验室采用了病
毒的方法。这种方法有几大好处：首先，它具有
高的表达，而且非常容易操作，特别是腺病毒。在
很长一段时间内，病毒的一大缺点就是缺乏细胞类
型的特异性。科研人员将 Cre的基因敲入小鼠和病
毒操作两方面结合起来，利用 Cre的基因敲入小鼠
来限制细胞类型，并且改造后的病毒是只有在 Cre
激活下才能表达，比如将传统的AAV-GFP病毒注
射到PV-Cre小鼠中，大部分被标记的神经元都是锥
体神经元。在白质处，投射的轴突被非常清晰的标
记。而当注射依赖于 Cre激活表达的病毒时，可以
确定的说，无论是绿色荧光蛋白(GFP)还是红色荧
光蛋白(RFP)阳性的细胞，超过 98%的细胞都是 PV
阳性的篮状中间神经元。通过双标的免疫组化可以
证明这一点。其次，当锥体神经元被标记后，围
绕锥体细胞的轴突显示出篮状中间神经元的特性。
另外一个这种方法具有高的分辨率。利用双光子成
像，篮状中间神经元的树突以及主要围绕着锥体细
胞的胞体及其树突的典型的篮状中间神经元的轴突
705第5期 黄佐石：细胞类型特异的遗传学操作：揭开复杂神经环路的面纱
能够在小鼠中被观察到。在远离注射点的地方，标
记的细胞非常稀少，可以观察单个的篮状中间神经
元，也可以观察到轴突分支和终扣以及典型的末端
分支。利用这个系统，Sandra Kuhlman追踪了篮
状中间神经元的轴突末端长达 10天，甚至两周，发
现在 3个月大小的成年小鼠中，这些轴突依然具有
显著的结构改变，也就是说轴突终扣不断的消失出
现，虽然整体数目并不改变。设想利用这种基因解
剖的单独标记方法可以用来标记细胞形态，而利用
这种方法共同标记或者结合传统的解剖学方法可以更
加特异详细的研究篮状中间神经元之间的联系，或
者通过同时标记其他类型神经元的轴突来研究皮层中
间神经元的输入，以及利用追踪突触的病毒的方法
来研究各类神经元之间的联系。
此外，通过这种方法，还可以对具有快速动作
电位的中间神经元进行记录。通过比较密集的标记神
经元的方法来研究中间神经元之间是怎样进行联系的,
从这里毕业的一个学生吕江腾就开展了一些这方面的
工作，他发现两个具有快速动作电位的中间神经元
是电偶联的。这说明篮状中间神经元不仅与锥体神
经元相联系，它们之间也是有着更为紧密的联系。
篮状中间神经元上 α-1受体的量是锥体神经元
上的 3 倍之多。基于很多在海马或者皮层上的工
作，现在普遍认为这种类型的篮状中间神经元网络
实际上能够通过精确的相互抑制和电突触产生 γ-震
荡。有人认为内源的输入可能是某种通过代谢型谷
氨酸受体或者海人藻酸受体投射到篮状细胞网络上
的谷氨酸能的兴奋性输入，至少在海马中是这样
的，但是实际上，篮状中间神经元上的GABAa受
体才是产生 γ-震荡所充分而必要的条件。这是因为
基于病毒的 shRNA敲减，实际上提供了一种合理的
轻微扰乱这种震荡的方法。这些是相对来说较长时间
的操作，所以这是一种更加接近生理状态的操作。
我们也尝试了使用光敏感通道 ChR2的方法。脑片
上的一些特定的细胞通过转染AAV病毒表达了光敏
感通道。实验显示这些细胞可以被短促的蓝光驱动
产生发放并且产生一个相对来说较快的发放模式。
这些发放的产生是在TTX存在的情况下出现的，表
明它并不是一个由突触传递引发的事件。在这个实
验中光刺激是特异地针对抑制性电流的。因此如果
在这个细胞上进行电生理的记录并进行电刺激，就
可以同时记录到抑制性和兴奋性的突触后电流。另
一方面，利用光刺激，可以只产生抑制性的突触后
电流，而其他兴奋性和抑制性的突触后电流都是自
发产生的。这个系统的主要优点在于，它给了我们
在体操作篮状中间神经元的希望或是可能性，更理
想的话可以在活体动物上进行操作。总体来说，这
些Cre激活的病毒为我们提供了一个在鼠脑环路中标
记和操作细胞类型的总体策略。
与此同时，我们也在研究别的细胞类型，例
如，投射到远端树突的 somatostatin阳性的细胞，被
认为投射到其他中间神经元的calretenin阳性的细胞，
以及虽被称为篮状中间神经元但和快速发放的篮状
中间神经元有许多不同特性的 CCK细胞，等等。
3　中间神经元活性成像
很多中间神经元都能释放 GABA，也有很多
GABA受体，但是它们只有一种产生GABA的途径，
就是利用从谷氨酸单脱酰基的反应。G AD 6 5 和
GAD67是两种产生GABA的酶，其中GAD67是限
速酶。GAD67是脑中决定性的酶具有至少两个证
据。在 GAD67 敲除小鼠中，GABA 的量减少了
90%。在杂和体中，GABA的量减少了 40%，只
有很少的代偿。另外，GAD67的调控主要发生在
基因转录水平。如果刺激或是拔去鼠须，这种酶的
水平会相应地上升或者下降。这种变化实际上发生
在一些早期基因的调节之前。同时，它也被一系列
其他基因突变和基因座差异所影响。这些调节改变
了细胞和囊泡水平GABA的量，直接影响到抑制性
的传递，它也能够影响抑制性突触的形成。另外，
一些证据也表明，GAD67的转录调节在不同类型的
GABA能神经元中也不尽相同。因此能够在细胞水
平和细胞类型的精度上观察到GAD67的转录非常重
要。它可能体现了一种亚型的GABA能神经元最近
的活动和功能状态的变化，而这些会改变突触传递
和突触联系。我们利用了一种表达短半衰期的绿色
荧光蛋白(GFP)的基因敲入(knock in)小鼠。这种 2 h
半衰期的绿色荧光蛋白整合在GAD67的位点。在我
们实验室Wu Xiaoyu的实验老鼠中所有GABA能中
间神经元中表达这种绿色荧光蛋白。而它的表达水
平是变化很大的，实际上在 Pv和 somatostatin阳性
的中间神经元中表达量相对较低。这将会提供一种
可以在体的细胞水平分辨率的检测GAD67转录水平
的方法。Wu Xiaoyu尝试去观察这种报告基因是否
能够被神经元电活动和传统的实验方法所调节，虽
然采用的在齿状回诱导癫痫的方法不大生理。齿状
回通常被认为是GAD67和GABA产生量比较低的区
706 生命科学 第20卷
域，海人藻酸处理 6 h可以导致GAD67转录水平提
高 5倍。实验中，绿色荧光蛋白的荧光强度也神奇
地增加了 5倍左右。这种方法可以让我们找到更加
生理的实验范式，例如在桶状皮层或者视皮层去观
察神经元点活动或者经验怎样影响特定细胞类型中
的GAD67的产生和转录。
4　基于基因的细胞分类和功能
这方面的工作可以通过与视网膜的对比来说
明。视网膜能够检测到并且传递视觉信号，将它们
传入到中枢视觉通路。正因为这样，解剖学和生理
学的分析可能已经拥了很多关于视网膜细胞类型环
路和功能的广泛的知识。大约在 8年前，Richard
Masland总结了在视网膜中的细胞类型，他发现大
约存在着55种细胞，并且没有任何主要细胞类型的
缺失。在这篇篇来自 Josh Sanes实验室的文章中，
他们报告了一种新型的细胞类型——JamB关闭型视
网膜神经节细胞。这种类型的细胞特异地检测物体
向上方向的移动。有意思的是这种细胞是在筛选细
胞黏附分子 Jam-b的表达时偶然被发现的。这也使
得这种基因操作的方法可以被用来标记细胞类型。
非常令人惊奇的是，这些细胞均具有由背侧指向腹
侧的树突形态。它们将它们的轴突投射到全部负责
探测向上运动的上丘(colliculus)的特定区域。这些
来自视网膜的信息表明，在神经元环路中有很多特
殊类型的细胞，其中的每一种都执行着很不相同的
功能。这种工作方式很可能也延伸到了皮层，只是
皮层中有更多类型的神经元而已。另一方面，因为
距离传入和输出还很遥远，了解皮层中的GABA能
神经元的功能对我们来说还是一个巨大的挑战。但
是，越来越多的证据表明中间神经元在精确时间调
控中具有极其重要的地位，包括各种震荡的产生，
例如，Somogvi和 Thomas Klausberger的一些非常
漂亮的工作。我们已经知道了越来越多关于这些震
荡产生的细胞机制，例如 α-1 GABAA受体参与震
荡的维持以及谷氨酸受体参与震荡的产生。我们在
基因水平上标定这些神经元的能力也在逐步增强。
如果可能去轻微地扰动这些传统上认为的认知和生
理功能，是相当令人兴奋的。例如，可能我们可
以从基因水平特异地标记这些决定细胞类型的细胞
组分，然后研究它们在环路活动和行为中的功能。
邵　炜　李叶飞　宋宁宁　李小泉　整理