全 文 ：第25卷 第6期
2013年6月
Vol. 25, No. 6
Jun., 2013
生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
文章编号：1004-0374(2013)06-0595-06
2型腺相关病毒作为基因治疗载体的研究进展
陈如意，陈素峰，周　丹，许　健*
(浙江中医药大学生命科学学院，杭州 310053)
摘　要：2型腺相关病毒 (adeno-associated virus, AAV-2)属于细小病毒科依赖病毒属，因具有无致病性、宿
主范围广、目的基因持久表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。然而，AAV-2载体
也存在着免疫原性弱、靶向性不强及转导效率不高等问题，但是随着 AAV在分子病毒学领域的不断研究，
其不足也找到了可能的解决思路和方案。综述了 AAV-2的生物学特点及作为基因治疗载体的优势，并着重
介绍了其在基因治疗应用中存在的不足及应对策略。
关键词：2型腺相关病毒；载体；基因治疗
中图分类号：Q789；R373 文献标志码：A
Advances on research of AAV-2 vector in gene therapy
CHEN Ru-Yi, CHEN Su-Feng, ZHOU Dan, XU Jian*
(College of Life Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)
Abstract: Adeno-associated virus type 2 (AAV-2) belongs to the family Parvoviridae of the genus Dependovirus.
AAV-2 is a potential delivery vehicle for gene therapy application, which possesses some features including the lack
of pathogenicity, wide range of host, and persistent target gene expression. However, its host immune response,
weak targeting property and low transduction efficiency also limit its application in gene therapy. Meanwhile, novel
approaches have been developed to mitigate the drawbacks with the further research progress on the AAV-2 in the
virology field. This article describes the biological characteristics and superiority of AAV-2, and highlights its
limitations and coping strategies as a carrier in gene therapy application.
Key words: AAV-2; vector; gene therapy
收稿日期：2012-11-30； 修回日期：2013-01-22
基金项目：浙江省自然科学基金项目(LY12H16007，
Y2080506)
*通信作者：E-mail: xujian832002@163.com；Tel:
0571-86633001
基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以
纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达
到治疗目的。在基因治疗的基本程序中，基因载体
的选择很关键。目前，基因载体大致可分为两大类：
非病毒型载体和病毒型载体。由于非病毒型载体转
染效率低、缺乏靶向性等诸多缺点，使得人们将研
究热潮转向病毒类基因载体。病毒型载体系统包括
逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺相
关病毒载体等。目前用于基因治疗的病毒载体中，
逆转录病毒由于外源基因的插入有导致基因突变的
危险，且只能感染分裂增殖细胞，繁殖滴度低，不
能满足体内基因治疗的需要。而腺病毒载体虽滴度
和感染效率高，但其 DNA以附加体的形式存在于
染色体之外，在细胞的分裂增殖过程中易逐渐丢失，
因而目的基因的表达相对短暂，而且有免疫原性和
致病性等缺点。慢病毒则可能导致血清转换为
HIV-1阳性，其病毒调节蛋白可能导致细胞功能失
调。相对于这三种病毒，腺相关病毒 (adeno-associated
virus, AAV)作为一种活病毒载体，被视为最有前途
的基因转移载体之一。其中，2型腺相关病毒载体
(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因
长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的
病毒载体之一。本文综述了 2型腺相关病毒的生物
生命科学 第25卷596
学特点及作为基因治疗载体的优势，并着重介绍了
其在基因治疗应用中存在的不足及应对策略。
1　AAV-2的生物学特点
腺相关病毒 (AAV)最初是在纯化的腺病毒液
中发现的一种污染成分，故而得名。因为只有在腺
病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产
生具有感染性的 AAV，所以 AAV归属于细小病毒
科依赖病毒属。腺相关病毒核心为一条具有互补性
的单链 DNA，其衣壳蛋白呈 20面体立体对称。根
据衣壳的差异，目前 AAV可分为 12种血清型
(AAV-1~AAV-12)和 100多种变异体 [1]。其中，AAV-2
是最早得到感染性克隆的血清型，也是到目前为止
研究得最清楚的一种血清型。
1.1　AAV-2的基因组特点
AAV-2基因组是线性的，含 4 681个核苷酸的
单链 DNA，其正义链或反意义链由衣壳蛋白包
裹，两末端为 145 bp的反向末端重复序列 (inverted
terminal repeat sequences, ITRs)，ITR 序列之间为病
毒编码区，含有两个开放阅读框架 (open reading
frame sequences, ORFs)，与 Rep和 Cap蛋白的转录
和翻译有关。ITR是 AAV整合、复制、拯救和包
装所必须的顺式作用元件，具有转录启动子的活性。
ITR序列的前 125 bp能自身互补组成 T型回文发夹
结构，包括主干回文区 A-A、回文结构臂 B-B和
C-C，其中 B-B和 C-C可通过置换而形成两种不
同的构型，称为“flip”和“flop”。ITR序列的另外
20 bp组成单链的 D序列。在病毒复制过程中，位
于 ITR序列上的 Rep蛋白结合元件 RBEs (RBE和
RBE)和末端解析位点 TRS起着关键的作用。ITRs
序列基本上是转录中性的，会较少地干扰外源基因
的表达和调控。5端 rep ORF编码 4个重叠的具有
多种功能的蛋白 (Rep78、Rep68、Rep52和 Rep40)，
主要负责病毒颗粒的装配。P5启动子转录大分子蛋
白 Rep78和 Rep68，P19启动子转录小分子蛋白
Rep52和 Rep40，这四种蛋白都具有解旋酶和 ATP
酶活性，主要负责病毒的位点特异性整合、复制和
转录调控等。3端 cap ORF由 P40启动子转录编码
3个结构蛋白 VP1 (相对分子质量为 8.7×104)、VP2
(相对分子质量为 7.2 ×104)和 VP3 (相对分子质量
为 6.2 ×104)，AAV-2成熟病毒粒中 VP1:VP2:VP3
摩尔比大约为 1:1:10[1]。
1.2　AAV-2感染细胞途径
AAV-2感染细胞是个多步有序的过程：结合细
胞表面，内吞作用进入细胞，在细胞内运输，核定位，
脱壳，第二条 DNA链的合成。AAV-2病毒在主要
受体硫酸肝素糖蛋白 (heparin sulphate protoglycans,
HSPG)和共受体整合素 αVβ5、α5β1、肝细胞生长
因子受体、成纤维生长因子受体 I 、层黏连蛋白受
体的作用下与细胞表面结合。接着，在发动蛋白
(dynamin)、Rac1和磷脂酰肌醇激酶 PI3K等信号
分子的作用下，经由网格蛋白包被凹陷介导快速内
化，并形成内含体。入胞后，内含体的低 pH值以
及 AAV-2 VP1 N末端的磷酸酯酶 A2序列 [2]促使
AAV-2从内含体释放入胞浆，并定位于核周。最后，
AAV缓慢地经由核孔复合体进入核，通过病毒脱壳，
释放单链 DNA，单链 DNA通过末端游离的 ITR作
为引物形成双链 DNA进行转录和基因表达 [3]。
2　AAV-2载体在基因治疗中的优势
AAV-2载体因无致病性、宿主范围广、目的基
因长期表达，快速、高效的大规模高滴度生产模式
已经日趋成熟等优点成为当前基因治疗中最有潜力
的病毒载体之一。
2.1　生物安全性
流行病学资料表明，世界各地大多数人感染过
野生型 AAV[4]，刚出生的婴儿体内就已存在 AAV-2
抗体，在随后的 3~7个月内降低，之后呈现不规则
波动变化 [5]。迄今尚无证据表明 AAV-2的感染与某
种疾病的发生有关，如男性精液和女性子宫内膜存
有的AAV DNA与临床相关不孕因素无显著性关系，
即 AAV DNA的存在不会影响可生育夫妇的生育能
力 [6]。相反，在某些情况下，AAV的感染对于人们
似乎是有益的，如 AAV-2感染引起人乳头状瘤病
毒阳性的宫颈癌细胞凋亡，对宫颈癌的发生有防护
作用 [7]；AAV-2能引起多发性乳腺癌细胞凋亡，但
对正常细胞没有影响 [8]。而且，野生型 AAV-2在
ITRs序列的作用下，特异性地整合到人基因组 19
号染色体 q臂的特定位置 AAVSl，这样可以避免像
其他病毒那样因随机整合而可能引起抑癌基因失活
和原癌基因激活的危险。目前，在基因治疗研究中
常用的 AAV-2载体去除了大部分野生型 AAV-2的
基因组，包括 AAV-2的 rep和 cap基因组，仅保留
了 ITRs，这进一步保证了载体的安全性。
2.2　应用可行性
基因治疗中，传统的 2型重组腺病毒载体
(rAAV-2)构建方法需要共转染一个载体质粒和一个
表达病毒复制与结构基因的包装质粒到腺病毒感染
陈如意，等：2型腺相关病毒作为基因治疗载体的研究进展第6期 597
的培养细胞 (如 293T细胞、HEK细胞 )中，但这
种方法有明显的局限性，如产量低、腺病毒辅助病
毒污染等。随着 AAV-2生产方法不断改进，出现了
无辅助病毒的瞬时转染模式，用腺病毒中分离出来
的编码 E1、E2A、E4及病毒相关 RNA的复制质粒
来代替腺病毒共转染宿主细胞，这种转染模式中载
体质粒构建简单，且能在没有腺病毒等辅助病毒下
产生高滴度的 AAV-2载体，但是这种模式缺乏稳定
的悬浮培养系统，不能用于规模化生产 [9]。为解决
这个瓶颈，出现了以杆状病毒为基础的 AAV-2生产
系统，它能将 rAAV基因组和辅助功能的反式作用
元件带入 SF9昆虫细胞中，杆状病毒因具有高度的
种属特异性，不感染脊椎动物，对人无害，而且该
系统能用于规模化生产。在纯化方法上，碘克沙醇
和氯化铯超速离心是 AAV-2最传统的纯化方式，操
作简单，能去除空载体，但是存在 AAV-2载体在氯
化铯梯度溶液中暴露时间长，影响其作用潜力和梯
度离心承载能力有限，无法满足扩大培养等缺点。
为克服这些缺点，随后出现了离子交换色谱法 [10]
和肝素亲和树脂柱技术，不仅缩减了纯化时间，也
大大提高了纯化效率。随着人们对重组 AAV生产
策略及纯化方法的不断深入研究，AAV载体快速、
高效、大规模、高滴度的生产模式已经日趋成熟，
为 AAV-2载体的临床应用奠定了基础。
AAV-2载体宿主范围广，不仅能转导分裂细胞
和非分裂细胞，还能转导未分化的细胞和分化成熟
的细胞 [11]；对超感染没有免疫性，可以向同一细胞
引入 2种不同的基因或对同一细胞反复感染 [12]；介
导外源基因的持续表达 [13-14]；具有口服给药的特点，
可以用于基因口服治疗 [15]。这些优点在临床中有着
潜在的使用价值和实践推广意义，使 AAV-2作为基
因治疗载体具有可行性。根据 AAV-2的诸多优势，
本实验室也正以 AAV-2为基因治疗的载体，探讨
AAV-2及重组腺相关病毒 (rAAV)影响胰腺癌凋亡
的可能机制。
3　AAV-2在基因治疗中的不足及应对策略
2型腺相关病毒载体 (AAV-2)具有无致病性、
宿主范围广、目的基因持久表达等优点，但是其作
为基因载体也存在不足，如存在免疫反应、靶向性
和转导效率不高等问题，随着 AAV-2的研究不断加
深，这些不足也将可能得到解决。
3.1　AAV-2的免疫反应
近年来， AAV-2及 rAAV-2的大量动物模型和
人体基础免疫学实验表明，虽然 AAV-2免疫原性
低，但是其载体本身及转基因产物能诱导产生天然
免疫及获得性免疫反应 [16]，在一定程度上限制了
AAV-2作为载体在基因治疗中的应用。AVV-2介导
的免疫过程如下。抗原呈递细胞 (antigen-presenting
cell, APC)通过 TLR9等 [17]和 TLR2等 [18]模式识别
受体识别入侵的 AAV-2的病原体相关分子模式，如
AAV-2基因组的 CpG 基序和 AAV-2衣壳蛋白后，
天然免疫反应立即启动 [19]。APC通过有关信号转
导级联反应，激活 NF-κB[20]和干扰素调节因子 [21]
等转录因子，启动 IL-6、TNF-α和 IFN-I等炎性因
子的表达，刺激 APC的成熟，增强细胞的吞噬活性，
上调主要组织相容性复合体 (major histocompatibility
complex, MHC)分子、共刺激分子 CD80/86 等的表
达。当 APC迁移到淋巴结后，将病毒抗原以MHC
I或 MHC II复合物的形式递呈至天然淋巴细胞，分
别致敏抗原特异性 CTL和 CD4+ T细胞，随即激活
获得性免疫反应 [22]。针对 AAV-2载体在体内引起
免疫应答，现有几种策略来改善。
DNA家族改组 (DNA family shuffling)和病毒
肽展示库技术是强大又可兼容的方法，在新型 AAV
载体的分子进化上起着重要的作用。通过这两种技
术可以产生由不同血清型衣壳亚单位组成的混合型
衣壳载和一个 AAV基因组由另一个 AAV衣壳包装
的镶嵌型 AAV。由于不同血清型 AAV 的趋向性和
细胞运输通路不同，这些经过改造的病毒可以展现
出更广阔的组织嗜性和低免疫原性 [23]。除此之外，
一些化学制剂也能发挥作用。Finn等 [24]研究发现，
蛋白酶抑制剂硼替佐米能减少 AAV-2衣壳抗原呈递
给肝细胞，降低 T细胞活化和增殖。NF-κB抑制剂
Bay11能阻止NF-κB通路并消除促炎细胞因子表达，
导致持续的转基因表达 [20]。而且，在载体低剂量的
时候，使用霉酚酸酯和环孢霉素 A的免疫抑制策略
也能成功抑制 T细胞应答 [25]。
3.2　AAV-2的靶向性
载体准确地传递和释放外源基因是基因治疗
取得成功的关键因素。许多体内外实验均证明，不
同的 AAV血清型具有不同的组织或细胞特异性 [26]，
其中AAV-2感染宿主细胞或组织的范围较广泛 (如
中枢神经、肝、肌肉等 )，导致了其缺乏组织或细
胞特异性，不能按照人们的意志靶向病变的组织
或细胞，限制了 AAV-2载体在靶向基因治疗中的
应用。
目前，提高 AAV-2载体靶向性的主要策略是
生命科学 第25卷598
AAV-2外壳蛋白的修饰，包括以下几个方面。(1)
在 AAV-2的基因组内通过突变或插入突变的方式，
改变编码衣壳蛋白的基因，最终达到修饰外壳的目
的。Rabinowitz等 [27]通过在 AAV-2外壳结构基因
中插入突变，首次证明可以改变外壳蛋白而不影响
其感染性。随后，Girod等 [28]预测在 AAV-2衣壳
蛋白的基因组中有 6个位点 (氨基酸位置 261、
381、447、534、573、587)可以引入靶向配体。Wu
等 [29]用随机定点突变的方法选出有效突变体，并
在 VP2 N末端插入丝氨酸蛋白酶抑制剂的配体后发
现，rAAV-2载体的靶向性发生了改变。(2)在外壳
蛋白中插入一个已知肽段来靶向单个受体来提高
AAV-2载体的靶向性。例如，在 AAV-2载体中插入
新生血管靶向序列 NGR，能使其重新靶向 CD13阳
性的新生血管和许多肿瘤细胞 [30]。Work等 [31]证明，
趋向肺和脑的多肽插入能使 AAV载体靶向预想的
器官，而没有趋向肌肉、心脏和骨骼等部位。(3)
HSPG分子是 AAV-2病毒的主要细胞受体，其在很
多组织和细胞膜上都存在表达，限制了其体内靶向
转染的应用。通过肝素结合点修饰，改变外壳蛋白
有着重要的意义。Yu等 [32]在 AAV-2外壳蛋白 587
和 588残基之间插入 7个氨基酸的肌肉瞄准肽
(muscle targeting peptide, MTP)，破坏了 AAV-2 上
HSPG的结合序列，产生了 AAV587 MTP和 AAV588
MTP病毒，这两种重组病毒都减少了非肌肉细胞和
未分化成成肌细胞的感染，且 AAV587 MTP增加
了各种肌肉细胞和心脏的取向性。之后，Lee等 [33]
将 6个天冬氨酸 (D6)酸性寡肽插入到 AAV2 Cap
587和 588氨基酸残基之间，研究 D6-AAV2的靶
向性，结果证明 D6-AAV2能提高肌肉靶向性，降
低肝靶向性。
3.3　AAV-2的转导率
AAV-2转导是指用已知的外源基因通过 AAV-2
载体转移到真核细胞，并进行稳定表达的过程。
AAV-2的转导与细胞表面受体、内吞作用、核转运
和第二条 DNA链的合成等入胞途径有关。提高
AAV-2的靶向性，内吞作用相关途径的调控蛋白活
性，如 Rac1蛋白 [34]，以及 rAAV-2 DNA第二条链
的合成效率都可以增加 AAV-2的转导率。目前，有
很多材料和方法用于提高 AAV-2的转导率，其中具
有潜力价值的是与磁性纳米颗粒和 DNA损伤因素
联用。
磁性纳米颗粒由于其特有的磁性能、靶向性以
及生物相容性等特点，在临床上应用广泛。磁性纳
米颗粒也可以作为一种基因载体，在外加磁场作用
下高效转染到细胞内。Yiu等 [35]以二氧化硅MCM-
48为模板，包覆聚乙烯亚胺 (polyethyleneimine, PEI)
转染人肺黏表皮癌细胞，结果显示转导效率比脂质
体 PL2000等载体提高了 400%。之后，Wang等 [36]
将超顺磁纳米颗粒与阳离子脂质体结合偶联表达胰
岛素样生长因子 1受体 (insulin-like growth factor 1
receptor, IGF-1R)特异核酸 shRNA，进行基因转染
研究，结果显示磁转染效率达到 85.1%±3%。鉴于
磁性纳米颗粒的特性，Kim等 [37]将 6个组氨酸修
饰 (6 × His)的 AAV-2病毒与氨三乙酸 -生物素螯合
镍离子融合链霉亲和素涂布超顺磁性氧化铁纳米颗
粒 (nickel ions chelated on NTA-biotin conjugated to
streptavidin-coated superparamagnetic iron oxide
nanoparticles, NiStNPs)相互作用，在磁场作用下，
将 NiStNP-6 × His AAV-2转染细胞，显著增加了非
许可细胞 (如神经干细胞 )的转染率。Hwang等 [38]
利用肝素包被超顺磁纳米颗粒磁引导编码神经生
长因子 (nerve growth factor, NGF)的 rAAV-2，发现
靶向细胞的转导率增加，证明了磁性纳米颗粒具有
协同 AAV-2载体在基因传递过程中加强基因治疗效
果的潜力。
DNA损伤因素包括物理因素和化学因素。研
究发现，AAV-2载体联合 DNA损伤因素不仅可以
减少 DNA损伤因素引起的 DNA损伤，还可以增
加各种细胞包括非分裂细胞、肿瘤细胞、气管内皮
细胞等的转导率，从而加强 AAV-2介导的基因治疗
的作用。物理因素，如 γ辐射、紫外线和化学因素
包括顺铂、氚化胸苷等与 AAV-2载体联用可以显
著提高非分裂细胞，如原代人纤维母细胞的转导率 [39]。
研究表明，γ辐射与 AAV-2载体联用，不仅减弱了
γ辐射对人体造成的伤害，还通过 AAV载体转导
细胞后基因组第二条链的合成，增加人类上颌窦癌
细胞转导率，从而增强杀瘤作用 [40]。顺铂是一种
细胞周期非特异性药物，作为一种烷化剂它抑制
癌细胞的 DNA复制过程。Jiang等 [41]通过顺铂与
AAV-肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (tumor
necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, AAV-
TRAIL)联用增加了头颈部癌细胞的转导率，抗癌
作用显著。此外，rAAV-2载体通过联合三肽氨基
醛蛋白酶抑制剂 [42]和阿霉素 [43]也增加了细胞的转
导率，加强了基因治疗。由此可见，AAV-2载体协
同 DNA损伤因素在抗肿瘤基因治疗方面具有潜在
的意义。
陈如意，等：2型腺相关病毒作为基因治疗载体的研究进展第6期 599
4　展望
近年来，rAAV-2载体在临床试验上的安全性
和良好治疗效果使人们对 rAAV-2载体的研究和开
发充满了信心。随着 rAAV-2载体的研究和开发不
断深入，其在基因治疗中存在的免疫原性、靶向性
不强和转导效率不高等问题，通过改造 AAV-2外壳
蛋白，利用药物制剂、生物材料等方法也得到了一
定的解决。日前欧洲监管机构建议批准由荷兰
uniQure公司研制和申报的基因治疗药物 Glyber上
市。该药以 AAV为载体，向患者体内注入脂蛋白
脂酶 (lipoprotein lipase, LPL)基因，适应症是严格
限制脂肪饮食却仍然发生严重或反复胰腺炎发作
的脂蛋白脂酶缺乏症 (lipoprotein lipase deficiency,
LPLD)。西方世界第一个基因治疗药物有望不久之
后在欧洲获准上市。研究表明，AAV-2作为颇具前
景的基因治疗载体在癌症、纤维化、糖尿病、癫痫
等众多疾病中具有良好应用前景。目前已发现了较
为明确的解决 AAV-2载体不足和缺点的方案。相信
在不远的将来，以 AAV-2载体为基础的基因治疗将
得到空前的发展，为人类疾病的治疗做出贡献。
[参　考　文　献]
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