全 文 ：第 １３卷第 ２期
２０１５年 ３月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ２
Ｍａｒ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０２􀆰 ０１７
收稿日期：２０１４－０１－２５
基金项目：江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１１１５８）
作者简介：卢绍曾（１９８７—），男，河南郑州人，硕士研究生，研究方向：发酵工程；吴剑荣（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｋｉｎｏｗｕ７６＠ １６３􀆰 ｃｏｍ
聚乙二醇 聚唾液酸嵌段聚合修饰尿酸酶
卢绍曾，吴剑荣，朱　 莉，郑志永，詹晓北
（江南大学 生物工程学院 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：探索一种综合聚唾液酸（ＰＳＡ）和聚乙二醇（ＰＥＧ）优势的蛋白修饰方法。 对纯化的聚唾液酸进行两步活
化，先在非还原端氧化产生活性醛基，再加入胱胺形成活性巯基；活化的聚唾液酸（相对分子质量为 ３􀆰 ４×１０４）和异
基双功能的 ＰＥＧ（相对分子质量为 ３􀆰 ５×１０３）形成嵌段聚合物，然后于 ４ ℃修饰尿酸酶。 利用凝胶层析（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
ＨＷ ５５Ｆ）对修饰后的尿酸酶进行纯化，收集相应峰进行化学法和 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳鉴定，经多角度激光光散射凝
胶系统测定缀合物相对分子质量为 ５􀆰 ２１４×１０５；相对于原始酶，修饰酶酶活保留率 ７２􀆰 ４％，体外热失活半衰期由
１１５􀆰 ５ ｈ提高到 ２３１ ｈ，对高温、酸碱、胰蛋白酶的耐受稳定性显著提高。
关键词：聚乙二醇；聚唾液酸；嵌段聚合；尿酸酶；缓释
中图分类号：Ｑ５５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０２－００８６－０７
Ｕｒｉｃａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ
ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ⁃ＰＳＡ） ｃｏ⁃ｐｏｌｙｍｅｒ
ＬＵ Ｓｈａｏｚｅｎｇ，ＷＵ Ｊｉａｎｒｏｎｇ，ＺＨＵ Ｌｉ，ＺＨＥＮＧ Ｚｈｉｙｏｎｇ，ＺＨＡＮ Ｘｉａｏｂｅｉ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｒｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ
ａｃｉｄ （ＰＳＡ） ａｎｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ （ＰＥＧ）． ＰＳＡ ｗａｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｔｗｏ ｓｔｅｐｓ：ｔｈｅ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｅｒｉｏｄａｔｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｎｏｎ⁃ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｆｏｒｍｅｄ
ｕｓｉｎｇ ｃｙｓｔａｍｉｎｅ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＳＡ（３􀆰 ４×１０４） ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｔｅｒｏ⁃ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＰＥＧ（３􀆰 ５×１０３） ｔｏ ｆｏｒｍ
ａ ｂｌｏｃｋ ｃｏ⁃ｐｏｌｙｍｅｒ， ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｕｒｉｃａｓｅ ａｔ ４ ℃ ． Ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｇｅｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｅａｋ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ．
Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｗａｓ ５􀆰 ２１４ × １０５ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｌｔｉ⁃ａｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｇｅｌ
ｓｙｓｔｅｍ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｎａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ，ｒｅｓｉｄｕａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ７２􀆰 ４％，ａｎｄ ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｈａｌｆ ｌｉｆｅ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗａｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｒｏｍ １１５􀆰 ５ ｈ ｕｐ ｔｏ ２３１ ｈ． Ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｈｅａｔ，ａｃｉｄ ａｎｄ ａｌｋａｌｉｎｅ，
ｔｒｙｐｓｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ； ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ；ｂｌｏｃｋ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ； ｕｒｉｃａｓｅ；ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ⁃ｒｅｌｅａｓｅ
　 　 目前，随着生物医药技术的发展，各种蛋白及
多肽类药物更好地保障了人类健康。 ２０１２ 年，该类
药物总销售额达 １ ２４６ 亿美元，且每年都继续稳定
增长。 但是，蛋白类药物存在着稳定性差、易被酶
降解、半衰期短、生物利用度低等缺点，非人源蛋白
自身具有免疫原性，进入人体易引起抗体反应，从
而加速血液清除，降低了药效［１］。 对蛋白质类药物
的改造成为当下研究的热点，目前比较成熟、成功
的方法是聚乙二醇（ＰＥＧ）修饰。 ＰＥＧ 修饰使用较
多的是单甲氧基聚乙二醇（ｍＰＥＧ）修饰剂，目前已
经应用在包括尿酸酶［２－３］、天冬酰胺酶［４］、胰岛
素［５］、白细胞介素 ２［６］、ＣＣ４９ ／ ２１８ 单链抗体［７］、干
扰素 α ２ｂ［８］和肿瘤坏死因子纳米抗体［９］等蛋白及
多肽上。 修饰后蛋白稳定性普遍提高，半衰期延
长，免疫原性降低，生物利用度提高。 由于 ＰＥＧ 为
人工合成，相对分子质量较大，其很难通过肾小球
被尿液排出，在体内降解非常缓慢，造成聚乙二醇
在机体内的积累［１０］。 已有研究证明，聚乙二醇在溶
酶体内的积累具有毒性［１１］，且慢性治疗中，频繁注
射聚乙二醇化蛋白易产生抗体［１２］。
与此同时，采用聚唾液酸（ＰＳＡ）作为蛋白修饰
剂的研究也在进行。 聚唾液酸是由唾液酸单体
（Ｎ 乙酰神经氨酸）以 α ２，８ 糖苷键连接成的聚
阴离子多糖［１３］，其单体广泛存在于人和动物体内细
胞表面的寡糖链末端，因而表现出良好的生物相容
性、生物可降解性及抗人体免疫系统识别功能［１４］。
目前，常见的方法是还原氨基化，已在研究的蛋白
包括过氧化氢酶［１５］、天冬酰胺酶［１６－１７］、胰岛素［１８］、
超氧化物歧化酶［１９］及丁酰胆碱酯酶［２０］等。 聚唾液
酸化蛋白不存在免疫原性，但修饰程度往往不及聚
乙二醇化的修饰程度，且聚唾液酸水化能力稍弱。
尿酸酶能将尿酸降解为溶解度高其 １３ 倍的尿
囊素，在治疗顽固性痛风及高尿酸血症方面有较好
的效果。 但作为外源蛋白，尿酸酶在体内易被酶水
解，稳定性低、免疫原性较强，因而限制了它的应
用。 本研究中笔者结合 ＰＥＧ 与 ＰＳＡ 的优点，以尿
酸酶为对象，采用全新的嵌段聚合修饰方法，将活
化的聚唾液酸与小分子 ＰＥＧ形成嵌段聚合物，用于
修饰尿酸酶，使其兼具聚唾液酸的抗免疫识别和
ＰＥＧ的强吸水性能［２１］，以提高稳定性和半衰期。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
聚唾液酸为笔者所在实验室成员发酵纯化所
得（Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ Ｋ２３５），数均相对分子质量 ３􀆰 ４２×１０４；尿
酸酶，来源于假丝酵母基因，在大肠杆菌中表达，
ＳＤＳ ＰＡＧＥ鉴定相对分子质量为 ３􀆰 ５×１０４。 尿酸、
５，５′ 二硫双（２ 硝基苯甲酸）（ＤＴＮＢ）购自南京都
莱有限公司；异基双功能 ＰＥＧ（ＭＡＬ ＰＥＧ ＮＨＳ）
购自北京键凯科技有限公司，相对分子质量为
３ ５９２；蛋白 Ｍａｒｋｅｒ、胰蛋白酶（１ ∶ ３００）购自上海生
工工程有限公司；透析袋 （ ７０００）、超滤离心管
（３０００）购自上海基星科技有限公司；其他试剂均购
自国药集团化学试剂公司，化学纯。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 聚唾液酸的活化
称取纯化的 ＰＳＡ ２００ ｍｇ溶于 ５０ ｍＬ加盖试管，加
入 １０ ｍＬ ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ高碘酸钠，室温避光振荡 １５ ｍｉｎ，
加 １０ ｍＬ乙二醇终止反应，继续振荡 ３０ ｍｉｎ，然后在
０􀆰 ０２％（质量分数）（ＮＨ４）２ＣＯ３ 透析液中 ４ ℃透析 ２４
ｈ。 透析液用超滤离心管浓缩，加入 １００倍摩尔比的胱
胺盐酸盐，滴加 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ调 ｐＨ ７􀆰 ４，３７ ℃磁力
搅拌 １ ｄ，加入与胱胺盐酸盐等摩尔的二硫苏糖醇，３７
℃反应 １ ｈ，反应液用相对分子质量为 ３ ０００的离心超
滤管４ ０００ ｇ×３０ ｍｉｎ超滤 ８次，除去未反应的小分子，
浓缩得到非还原端官能团为巯基的活性唾液酸［２１］。
１􀆰 ２􀆰 ２　 聚唾液酸活化程度测定
５，５′ 二硫代双（２ 硝基苯甲酸） （ＤＴＮＢ）法：
将 ＤＴＮＢ 溶于 ５０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ７􀆰 ０ 的 Ｎａ２ＨＰＯ４中制
成 １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＤＴＮＢ 标准液。 将标准液用 ０􀆰 ２５
ｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ８􀆰 ３的 Ｔｒｉｓ ＨＣｌ 缓冲液稀释 １００ 倍制得
ＤＴＮＢ分析液。 将活化的 ＰＳＡ稀释至 １ ｍＬ，分别加
入到 ５ ｍＬ 预先恒温于 ２５ ℃水浴中的 ＤＴＮＢ 分析
液，摇匀，静置 １０ ｍｉｎ，立即于波长 ４１２ ｎｍ处测定吸
光值（Ａ），以半胱氨酸为标准。 通过 ＤＴＮＢ 法测定
巯基含量（ｍｍｏｌ）后，再除以 ＰＳＡ 的量（ｍｍｏｌ）即可
获得聚唾液酸的活化程度。
１􀆰 ２􀆰 ３　 ＰＥＧ ＰＳＡ嵌段聚合修饰尿酸酶
按照摩尔比 １ ∶ １，将具有活性巯基的 ＰＳＡ 与
ＰＥＧ在 ２５ ℃反应 ０􀆰 ５ ｈ，然后按摩尔比 ５０ ∶ １加入尿
酸酶，于 ４ ℃冰水浴反应 ２ ｈ。
１􀆰 ２􀆰 ４　 修饰尿酸酶的纯化
采用分子筛柱进行纯化。 柱子尺寸：１６ ｍｍ×
２７０ ｍｍ；填料：ＴＯＳＯＨ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ ５５Ｆ；流动相：
２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｐＨ ７􀆰 ４ Ｈ３ＰＯ４缓冲液，０􀆰 １５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＣｌ；
洗脱条件：流速 ０􀆰 ７ ｍＬ ／ ｍｉｎ；检测器：示差折光检测
器串联紫外检测器（λ＝ ２１５ ｎｍ）。
１􀆰 ３　 缀合物的表征
１􀆰 ３􀆰 １　 温度稳定性
将等量天然酶和修饰酶置于 ５０和 ６０ ℃水浴保
７８　 第 ２期 卢绍曾等：聚乙二醇 聚唾液酸嵌段聚合修饰尿酸酶
温，定时（１、２、３、４、５和 ６ ｈ），取 １００ μＬ置于冰浴测
定酶活，以各温度下 ０ ｈ的原始酶活为对照。
１􀆰 ３􀆰 ２　 酸碱稳定性
取等量天然酶和修饰酶，在 ３７ ℃，ｐＨ 为 ６􀆰 ０、
７􀆰 ０（Ｈ３ＰＯ４缓冲液）、８􀆰 ０、９􀆰 ０ 和 １０􀆰 ０（Ｈ３ＢＯ３缓冲
液）水浴 ２ ｈ后测定酶活（２５ ℃，ｐＨ ８􀆰 ５ Ｈ３ＢＯ３缓冲
液）。 以各 ｐＨ下 ０ ｈ的原始酶活为对照。
１􀆰 ３􀆰 ３　 抗酶解稳定性
取 ５００ μＬ ０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ 尿酸酶，按体积比 １０ ∶ １
加入胰蛋白酶液（１％，２０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、ｐＨ ６􀆰 ８ Ｈ３ＰＯ４缓
冲液），在 ３７ ℃水浴保持 ０、０􀆰 ５、１、２ 和 ３ ｈ 后取样
测定酶活，计算酶活保留率。
１􀆰 ３􀆰 ４　 酶动力学参数测定
取 １８０ μＬ不同浓度尿酸溶液（４０～１４０ μｍｏｌ ／ Ｌ）
于石英 ９６孔板，加入 ０􀆰 １ ｍｇ ／ ｍＬ尿酸酶在 ２５ ℃反
应 ３ ｍｉｎ，每 １５ ｓ记录 １次 ２９３ ｎｍ波长处的吸光值，
计算反应速率。 最大反应速率和米氏常数的测定
采用 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅ Ｂｕｒｋ双倒数作图。
１􀆰 ４　 尿酸酶酶活的测定
根据尿酸于 ２９３ ｎｍ处有特征吸收，测定尿酸被
尿酸酶氧化生成尿囊素后，剩余尿酸在 ２９３ ｎｍ处的
吸光值。 酶活测定反应体系均为 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ３ＢＯ３
缓冲液（ｐＨ ８􀆰 ５），以 ０􀆰 ００１％的尿酸为底物，２５ ℃反
应 ３ ｍｉｎ，每 １５ ｓ记录一次 ２９３ ｎｍ波长处的吸光值。
以每分钟催化 １ μｍｏｌ 尿酸分解所需要的酶量定义
为 １个酶活力单位（Ｕ）。
１􀆰 ５　 聚唾液酸含量测定
聚唾液酸含量采用间苯二酚法，以 Ｎ 乙酰神
经氨酸为标品［２２］。
１􀆰 ６　 蛋白含量测定
蛋白质含量测定参照文献［２３］进行，以牛血清
白蛋白为参照。
１􀆰 ７　 聚乙二醇含量测定
将待测溶液稀释至 ４ ｍＬ，然后加入 １ ｍＬ ５％
ＢａＣｌ２和 ０􀆰 ５ ｍＬ ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ碘溶液，１５ ｍｉｎ 后在 ５３５
ｎｍ 处测定吸光值［２４］，以 ＰＥＧ （相对分子质量
４ ０００）为参照（０～１５ ｍｇ ／ Ｌ）。
１􀆰 ８　 相对分子质量测定
１􀆰 ８􀆰 １　 聚唾液酸相对分子质量测定
聚唾液酸相对分子质量采用十八角度激光光
散射凝胶系统（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）进行监测。
色谱柱为 Ｓｈｏｄｅｘ Ｏｈｐａｋ ＳＢ ８０４ ＨＱ 串联 Ｏｈｐａｋ
ＳＢ ８０２ ＨＱ，流动相为 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＮＯ３，流速为
０􀆰 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ，检测器为 Ｗｙａｔｔ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ Ⅱ十
八角度激光光散射仪串联 Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ ｒＥＸ示差折射
率检测器，标品为 Ｔ４０，相对分子质量 ４􀆰 ０×１０４。
１􀆰 ８􀆰 ２　 尿酸酶、缀合物相对分子质量测定
聚唾液酸 聚乙二醇修饰尿酸酶缀合物的相对
分子质量采用十八角度激光光散射凝胶系统进行
监测，色谱柱为 Ｓｈｏｄｅｘ Ｏｈｐａｋ ＳＢ ８０６ ＨＱ，流动相
为 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＮＯ３，流速为 ０􀆰 ４ ｍＬ ／ ｍｉｎ，检测器为
Ｗａｔｅｒｓ ＵＶ ／ ＶＩＳＩＢＬＥ串联 Ｗｙａｔｔ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ Ⅱ
十八角度激光光散射仪串联 Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ ｒＥＸ示差折
射率检测器。
１􀆰 ９　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分析
ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳用于监测尿酸酶修饰前后的
相对分子质量变化，采用质量分数 １２％分离胶和
５％浓缩胶［２５］。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 聚唾液酸活化
聚唾液酸非还原端 Ｃ７～９位有 ３个相邻的醇羟
基，反应活性较弱，通过活化得到活性巯基，进而与
ＰＥＧ修饰剂的马来酰亚胺官能团发生加成反应，形
成嵌段聚合物。 先用高碘酸钠特异性地氧化醇羟
基得到醛基，接着与胱胺盐酸盐反应，最后用二硫
苏糖醇还原，切断二硫键，得到末端巯基。 经过透
析和离心超滤两步纯化，累积回收率为 （ ６８􀆰 ２ ±
４􀆰 ５）％（ｎ＝ ３），活化程度为（３８􀆰 ６±２􀆰 ６８）％（ｎ ＝ ３）。
由于聚唾液酸是大分子，本身活化不易进行，且产
生的末端巯基在空气中不是很稳定，较易被氧化，
因此活化程度不是特别高。
２􀆰 ２　 ＰＥＧ ＰＳＡ嵌段聚合修饰尿酸酶
活化的聚唾液酸先与双官能团 ＰＥＧ修饰剂的马
来酰亚胺发生加成反应，形成嵌段聚合物，然后 ＰＥＧ
的另一官能团（ＮＨＳ）与尿酸酶上赖氨酸残基的氨基
发生亲电取代反应，形成酰胺键。 尿酸酶通过嵌段聚
合修饰后，相对分子质量增大，未修饰酶及其他副产
物相对分子质量则较小，反应产物通过分子筛层析进
行纯化，结果如图 １ 所示。 由图 １ 可知：按照示差信
号共收集 ４个峰，对收集的峰进行化学鉴定，分别测
定其聚唾液酸、聚乙二醇和蛋白含量。
发现只有第 １ 个峰检测到聚唾液酸，其他 ３ 个
峰未检出；第 １和第 ２个峰均检测到聚乙二醇，第 ３
和第 ４个峰未检出，且峰 １的聚唾液酸含量最高；第
１、第 ２和第 ４个峰均检测到蛋白，且峰 １ 蛋白含量
８８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 １　 分子筛层析纯化尿酸酶修饰产物结果
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｇｅｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｕｒｉｃａｓｅ
最高。 ＴＯＳＯＨ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ ５５Ｆ分子筛色谱柱填
料是由甲基丙酸烯聚合而成的基质，主要依靠分子
流体力学半径分离物质，嵌段聚合修饰尿酸酶后，
尿酸酶的水化半径显著增大，所以第 １ 个出峰。 第
２个流出峰为少量聚乙二醇连接的蛋白，第 ３ 个流
出峰为溶剂峰，第 ４ 个峰只检测到蛋白，且 ２１５ ｎｍ
处有紫外吸收，应为没有修饰的尿酸酶，可能与填
料上的羧基存在静电相互作用，所以最后出峰。
２􀆰 ３　 缀合物的表征结果分析
２􀆰 ３􀆰 １　 ＳＤＳ ＰＡＧＥ结果分析
除了进行化学鉴定，还对收集的峰进行进一步
ＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析，结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知：
未修饰尿酸酶单体相对分子质量约 ３􀆰 ５×１０４，纯化
收集第 １ 个峰为修饰产物，单体相对分子质量约
４􀆰 ５×１０４，还有一模糊条带为 ５􀆰 ５×１０４，可能还有更
高相对分子质量的产物（由于比例较低，未出现条
带）。 多条带的出现可能是由于嵌段聚合修饰是随
机修饰，造成产物的不均一性。 由相对分子质量半
对数—迁移率曲线所计算得到的相对分子质量并
不能反映修饰产物的真实相对分子质量，因为 ＰＥＧ
吸水较强，导致泳动速率较慢，得到的相对分子质
量偏大［３］；但同时作为嵌段聚合物之一的 ＰＳＡ是阴
离子多糖，与十二烷基磺酸（ＳＤＳ）所带电荷一致，导
致修饰产物可能泳动速度较快［２６］。 总之，修饰产物
相对分子质量的电泳行为同时受到 ＰＥＧ 和 ＰＳＡ 的
影响。 第 ２ 个峰由于蛋白含量较低，未出现条带。
第 ４个峰的相对分子质量与单体相对分子质量一
致，分析为未被修饰的尿酸酶。
２􀆰 ３􀆰 ２　 ＰＳＡ ＰＥＧ 修饰尿酸酶的相对分子质量表
征及生化参数
通过多角度激光光散射凝胶系统测定修饰尿
酸酶的相对分子质量，结果如图 ３所示。
１—未修饰尿酸酶；２—标准蛋白；３—修饰后未纯化尿酸酶；
４、５、６、７—修饰尿酸酶分子筛层析收集的洗脱峰 １～４
图 ２　 纯化产物电泳分析
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ｕｒｉｃａｓｅ ｆｒｏｍ ＧＰＣ
图 ３　 尿酸酶 ＰＥＧ ＰＳＡ缀合物的相对分子质量分布
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ｕｒｉｃａｓｅ⁃ＰＥＧ⁃ＰＳＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
一般尿酸酶是四聚体（相对分子质量 １􀆰 ４１２×
１０５），由图 ３可知：在连接上 ＰＳＡ ＰＥＧ 后，相对分
子质量变成 ５􀆰 ２１４×１０５。 ＰＳＡ和 ＰＥＧ的相对分子质
量为 ３􀆰 ４２×１０４和 ３􀆰 ５×１０３，通过计算（５􀆰 ２１４×１０５ －
１􀆰 ４１２×１０５） ／ （３􀆰 ４２×１０４＋３􀆰 ５×１０３）＝ １０􀆰 ０８，则平均
每个尿酸酶单体连接 ２􀆰 ５２ 个嵌段聚合物修饰剂。
尽管尿酸酶每个单体含有 ３２个赖氨酸残基，但是理
论上只有 １０ ～ １２ 是可以接近的。 可能是这些赖氨
酸残基相距较近，嵌段聚合物连在其中一个位点，
由于空间位阻，其他修饰剂将无法连接［２７－２８］。 此
外，聚唾液酸是阴离子多糖，同时还存在电荷排斥，
因此，修饰程度可能不及 ＰＥＧ修饰。 蛋白质化学修
饰往往是随机修饰，可能与活性部位的赖氨酸发生
作用，导致酶活降低，经测定，嵌段聚合修饰后酶活
保留率为 ７２􀆰 ４％。 Ｚｈａｎｇ 等［２９］采用含羟基琥珀酰
亚胺官能团的 ｍＰＥＧ ３５０ 和 ｍＰＥＧ ５ｋ，修饰来自苛
求芽胞杆菌的尿酸酶，酶活保留率分别为 １５％和
９８　 第 ２期 卢绍曾等：聚乙二醇 聚唾液酸嵌段聚合修饰尿酸酶
６５％；Ｂｏｍａｌａｓｋｉ等［３０］用 ＰＥＧ ５０００ ＭＷ 修饰假丝酵
母尿酸酶，酶活保留率 ５０％。 在 ３７ ℃恒温孵育箱
测定体外半衰期，酶的热失活半衰期由 １１５􀆰 ５ ｈ 提
高到 ２３１ ｈ，提高 １ 倍。 Ｚｈａｎｇ 等［２９］采用 ＰＥＧ 修饰
后，在 ４０ ℃热失活半衰期由 ４０ ｈ提高至 ８５ ｈ，嵌段
聚合修饰结果与其接近。
２􀆰 ３􀆰 ３　 ＰＳＡ ＰＥＧ修饰尿酸酶的温度稳定性
大部分蛋白酶在较高温度下，天然构象遭到破
坏，从紧密有序趋向随即松散，折叠结构打开，导致
酶活性丧失。 尿酸酶 ＰＥＧ ＰＳＡ 缀合物的温度稳
定性如图 ４所示。
图 ４　 尿酸酶 ＰＥＧ ＰＳＡ缀合物的温度稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｒｉｃａｓｅ⁃ＰＥＧ⁃ＰＳＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
由图 ４可知：在 ５０ ℃下，２ ｈ内修饰酶基本未损
失酶活，原始酶则损失了 １５％的酶活，６ ｈ 后修饰酶
酶活保留率为 ７２％，而原始酶则仅为 ６０％。 更高的
温度（６０ ℃）下，修饰酶和原始酶酶活损失都较大，
但修饰酶在 ６ ｈ后酶活剩余 ３４％，原始酶则为 ２７％。
整体而言，修饰后尿酸酶比原始尿酸酶对温度的耐
受性更强，这有利于酶的储运，即使短暂暴露于较
高的温度条件下，亦能保留较多酶活。 推测原因，
可能是酶的活性位点受到嵌段聚合物的保护，提高
了尿酸酶蛋白的刚性［３１］。
２􀆰 ３􀆰 ４　 ＰＳＡ ＰＥＧ修饰尿酸酶的酸碱稳定性
ｐＨ对酶稳定性具有重要的影响，反应体系 ｐＨ
的变化，会影响酶活性部位的基团解离状态，从而
影响酶的活性。 极端的 ｐＨ 会使维护酶三维结构的
部分———非共价键受到干扰，导致酶自身的变性。
考察尿酸酶 ＰＥＧ ＰＳＡ 缀合物的酸碱稳定性，结
果见图 ５。
由图 ５可知：在不同 ｐＨ 条件下处理 ２ ｈ 后，修
饰尿酸酶酶活保留率高于原始酶，其中在碱性条件
下较为明显。 在 ｐＨ １０ 时，修饰酶比原始酶酶活高
图 ５　 尿酸酶 ＰＥＧ ＰＳＡ缀合物的酸碱稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ｐＨ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｕｒｉｃａｓｅ⁃ＰＥＧ⁃ＰＳＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
出 ２２％，而在接近人体血液 ｐＨ 条件下，修饰酶残余
酶活 ７０％，原始酶活则为 ６０％，修饰酶更加稳定，显
示出良好的临床应用前景。 在酸性条件下，修饰酶
和原始酶酶活损失都较多，因为尿酸酶属过氧化物
酶，在碱性 ｐＨ条件下有最大酶活，酸性条件下酶易
降解失活。 另外，修饰剂之一的聚唾液酸在碱性条
件下稳定，酸性条件下糖苷键也会被水解［１４］，所以
酸性条件下酶的稳定性提高不多。
２􀆰 ３􀆰 ５　 ＰＳＡ ＰＥＧ修饰尿酸酶的酶解稳定性
蛋白酶药物进入体内后，由于体内较多的蛋白
酶存在，使得酶蛋白被水解，多肽链断裂，蛋白酶的
功能结构受到破坏而丧失活性，因此必须考察尿酸
酶修饰后对蛋白酶的稳定性，结果如图 ６所示。
图 ６　 尿酸酶 ＰＥＧ ＰＳＡ缀合物的抗酶解稳定性
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｕｒｉｃａｓｅ⁃ＰＥＧ⁃ＰＳＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
由图 ６可知：在 ０􀆰 ５ ｈ 时，修饰尿酸酶酶活残余
８５％，而原始酶为 ６０％，３ ｈ 后修饰尿酸酶残余酶活
３４％，原始酶则只剩 ２０％。 尿酸酶修饰后，对胰蛋白
酶的耐受性显著增加，稳定性提高，在体内能更加
持久地发挥药效，可减少给药剂量，降低治疗成本，
同时也可减少病人的痛苦（目前临床尿酸酶的给药
途径主要是静脉注射）。 推测原因，可能是尿酸酶
上暴露在外面的蛋白酶识别位点被嵌段聚合修饰
０９ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
剂共价连接后，识别位点被掩蔽，无法被蛋白酶识
别，进而降解，另外聚唾液酸具有较强的负离子性，
与酶蛋白周围带相反电荷的氨基酸残基相互作用，
形成第二层保护层［１９］。
２􀆰 ３􀆰 ６　 ＰＳＡ ＰＥＧ修饰尿酸酶的动力学参数
分别比较原始尿酸酶与修饰尿酸酶的动力学
参数，结果如表 １所示。 由表 １可以看出，尿酸酶修
饰后，米氏常数 Ｋｍ减小，对底物的亲和能力增强，最
大反应速率 Ｖｍａｘ增大，催化效率提高。 Ｚｈａｎｇ 等［２９］
用 ｍＰＥＧ ３５０和 ｍＰＥＧ ５ｋ 修饰尿酸酶后 Ｋｍ没有明
显的变化。 尿酸酶修饰后并没有因为嵌段聚合修
饰剂的屏蔽效应，造成底物与酶亲和能力的下降，
推测原因，可能是酶的溶解度较低［３２］，但是 ＰＥＧ 的
强吸水性能加上聚唾液酸的高度亲水性，增加了酶
的溶解度，使酶与底物的亲和能力增强。 酶修饰后
最大反应速率与催化效率均有所增加。
表 １　 尿酸酶的动力学参数
Ｔａｂｌｅ １　 Ｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｕｒｉｃａｓｅ
尿酸酶
Ｋｍ ／
（μｍｏｌ·Ｌ－１）
Ｖｍａｘ ／
（μｍｏｌ·Ｌ－１·ｍｉｎ－１）
ｋｃａｔ ／
ｓ－１
未修饰 ２３９􀆰 ７ ８３􀆰 ３ １􀆰 ９４
修饰后 １６２􀆰 ６ ９０􀆰 ９ ２􀆰 １２
３　 结论
本研究确定了一种以聚唾液酸 聚乙二醇嵌段聚
合物修饰蛋白的方法。 采用异基双功能聚乙二醇
ＭＡＬ ＰＥＧ ＮＨＳ为接头，将聚唾液酸与尿酸酶链接
起来，平均每个尿酸酶单体交联 ２􀆰 ５２个ＰＥＧ ＰＳＡ嵌
段聚合物，酶活保留率为 ７２􀆰 ４％，热失活半衰期由
１１５􀆰 ５ ｈ提高到 ２３１ ｈ。 另外，米氏常数 Ｋｍ由原始酶
的 ２３９􀆰 ７ μｍｏｌ ／ Ｌ 降为 １６２􀆰 ６ μｍｏｌ ／ Ｌ，最大反应速率
Ｖｍａｘ由原始酶的 ８３􀆰 ３ μｍｏｌ ／ （Ｌ·ｍｉｎ）增大为 ９０􀆰 ９
μｍｏｌ ／ （Ｌ·ｍｉｎ），ｋｃａｔ由 １􀆰 ９４ ｓ
－１增大为 ２􀆰 １２ ｓ－１。 ＰＳＡ
ＰＥＧ嵌段聚合修饰蛋白程度不如 ＰＥＧ 修饰，但由于
其易降解，不产生免疫反应，可用于进一步临床实验，
在未来可能是一种替代 ＰＥＧ修饰的更好方法。
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１９　 第 ２期 卢绍曾等：聚乙二醇 聚唾液酸嵌段聚合修饰尿酸酶
［１９］　 Ｗｕ Ｊ Ｒ， Ｌｉｎ Ｙ， Ｚｈｅｎｇ Ｚ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣｕＺｎ⁃
ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ
ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２０１０，３２（１２）：１９３９⁃１９４５．
［２０］ 　 Ｉｌｙｕｓｈｉｎ Ｄ Ｇ， Ｓｍｉｒｎｏｖ Ｉ Ｖ， Ｂｅｌｏｇｕｒｏｖ Ａ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ
ｄｅｌｉｖｅｒｓ ａ ｌｏｎｇ⁃ａｃｔｉｎｇ ｂｉｏｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｆｏｒ ｎｅｒｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ［ Ｊ］ ．
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（责任编辑　 管　 珺）
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（上接第 ５９页）
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（责任编辑　 荀志金）
２９ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷